本發(fā)明涉及識別并切割雙鏈核酸中的錯配堿基對(以下也簡稱為錯配)的耐熱錯配核酸內(nèi)切酶突變體、包含所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的組合物，以及使用所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的方法。

背景技術(shù)：

1、近年來，生物技術(shù)已取得顯著的發(fā)展。特別地，由于大規(guī)?；蚪M分析，伴隨基因組分析技術(shù)的進(jìn)步，已積累了大量的基因組序列信息。此外，基于上述信息與各種生理功能分析的組合，已發(fā)現(xiàn)許多功能性基因突變。這些突變的分析已用于人類的基因診斷，以及農(nóng)作物的改良和有用微生物的分離或制造，并且因此對一般生活做出了巨大貢獻(xiàn)。

2、通過對基因組序列的直接分析或通過使用識別錯配堿基對的酶來進(jìn)行突變分析。突變分析方法包括使用能夠特異性結(jié)合由突變型dna與野生型dna的配對而形成的錯配堿基對的因子的檢測。突變分析方法的代表性實例包括使用來自大腸桿菌的muts、mutt和mutl復(fù)合物的突變位點檢測(專利文獻(xiàn)1)。

3、包括使用特異性切割錯配位點的錯配核酸內(nèi)切酶的突變分析方法，也是已知的。在這種方法中，使用錯配核酸內(nèi)切酶在錯配堿基對附近切割dna，并分析由此獲得的dna片段以檢測是否存在突變以及突變的位置。作為代表性實例，已知使用來自芹菜的細(xì)胞基因產(chǎn)物的方法(專利文獻(xiàn)2)，并且所述方法實際上用于堿基突變的分析。然而，所述酶不是耐熱的，并且因此不能用于涉及高溫反應(yīng)過程的技術(shù)，例如pcr。因此，為了檢測堿基突變，所述方法需要擴(kuò)增、錯配形成、錯配切割和檢測的四個步驟。

4、錯配核酸內(nèi)切酶的其他實例包括來自激烈熱球菌(pyrococcus?furiosus)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus?jannaschii)、thermococcus?barophylus和thermococcuskodakarensis的錯配核酸內(nèi)切酶(專利文獻(xiàn)3和4)。然而，這些錯配核酸內(nèi)切酶識別并切割多個錯配，并且因此具有錯配識別(底物特異性)的問題。

5、在某些情況下，錯配核酸內(nèi)切酶的底物特異性不適用于待檢測的基因突變，并且因此無法分析所述基因突變。在這種情況下，除了將適當(dāng)設(shè)計的核酸(所謂抑制性寡核苷酸)添加到反應(yīng)系統(tǒng)中以特異性檢測基因突變之外，別無選擇(專利文獻(xiàn)5)。

6、除了突變分析之外，具有很大影響的生物技術(shù)技術(shù)的實例包括核酸擴(kuò)增技術(shù)。核酸擴(kuò)增技術(shù)的代表性實例是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。pcr是用于容易地在體外擴(kuò)增所需核酸片段的技術(shù)。pcr是一種實驗技術(shù)，其在包括生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)的領(lǐng)域中以及關(guān)于基因的研究的廣泛領(lǐng)域中都是必不可少的。pcr也被應(yīng)用于突變基因的檢測和dna甲基化的分析。等溫核酸擴(kuò)增方法，諸如lamp方法和ican方法，不需要特殊的設(shè)備，并且因此被用作更廉價的核酸檢測方法。對于近年來進(jìn)行的全基因組結(jié)構(gòu)分析，全基因組擴(kuò)增方法是一項重要的技術(shù)，特別是對于稀有樣本的分析。

7、在這些核酸擴(kuò)增方法中，錯誤堿基的并入以恒定的概率發(fā)生。通過聚合酶等的改進(jìn)降低了所述概率。然而，錯誤堿基的并入仍然對精確分析造成干擾。

8、核酸擴(kuò)增技術(shù)不僅用于擴(kuò)增具有特定核苷酸序列的dna，而且還用于擴(kuò)增在兩端具有共同核苷酸序列區(qū)域的dna混合物。這種核酸擴(kuò)增技術(shù)的具體實例包括基因組文庫或cdna文庫的構(gòu)建。然而，在此類文庫的構(gòu)建中，含量較高的dna分子被優(yōu)先擴(kuò)增，這可能干擾各種dna的分析或篩選。

9、為了解決上述問題，通過利用自雜交的歸一化來降低含量較高的dna的比例(非專利文獻(xiàn)1)。也使用組合了pcr和自雜交的ssh-pcr(非專利文獻(xiàn)2)。然而，使用這些方法，與含量較高的dna同源的dna也被去除。

10、在通過核酸擴(kuò)增方法的dna檢測中，靶dna和非靶dna可能競爭擴(kuò)增。換言之，在擴(kuò)增靶dna的同時擴(kuò)增非靶dna時，難以檢測靶dna。可以通過使用實時pcr來解決上述問題，其中使用諸如循環(huán)探針或taqman探針的探針，以僅檢測靶dna。然而，在非靶dna相對于靶dna過度大量存在的情況下，由于與非靶dna的假陽性反應(yīng)而難以檢測靶dna。

11、此類問題可能發(fā)生在例如，在存在正常等位基因的情況下檢測少量突變等位基因(例如，檢測循環(huán)腫瘤基因)，通過表觀遺傳分析檢測少量甲基化或非甲基化等位基因，檢測在母親血液中循環(huán)的少量胎兒dna序列等。

12、為了解決上述問題，已開發(fā)了稱為富集pcr或限制性核酸內(nèi)切酶-介導(dǎo)的選擇性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rems?pcr)的方法(非專利文獻(xiàn)3)。這種方法涉及使用耐熱的限制性酶。在這種方法中，使用引物選擇性地檢測具有突變核苷酸序列的dna，所述引物例如經(jīng)過設(shè)計，使得限制性酶的切割僅在模板具有正常核苷酸序列時發(fā)生。然而，取決于待檢測的靶dna，可能不存在具有適合于通過rems?pcr檢測的識別序列的耐熱的限制性酶。

13、引用列表

14、專利文獻(xiàn)

15、專利文獻(xiàn)1：us?5922539?b

16、專利文獻(xiàn)2：wo?01/062974

17、專利文獻(xiàn)3：wo?2014/142261

18、專利文獻(xiàn)4：wo?2016/039377

19、專利文獻(xiàn)5：wo?2016/152812

20、非專利文獻(xiàn)

21、非專利文獻(xiàn)1："nucleic?acids?research",2004年2月，第32卷，3號，e37

22、非專利文獻(xiàn)2："methods?in?molecular?biology",2009年，第496卷，2號，p.223-243非專利文獻(xiàn)3："american?journal?of?pathology",1998年8月，第153卷，2號，p.373-379。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、本發(fā)明的目的包括提供與常規(guī)錯配核酸內(nèi)切酶相比，具有改進(jìn)的錯配特異性的耐熱錯配核酸內(nèi)切酶突變體、包含所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的組合物，以及使用所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的方法。

3、解決問題的方案

4、在上述情況下，通過深入的努力，本發(fā)明人成功地制造出能夠特異性地切割g-g錯配的錯配核酸內(nèi)切酶突變體和能夠特異性地切割t-t錯配的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。此外，雖然錯配核酸內(nèi)切酶原本是同二聚體，但本發(fā)明人成功地將分別來自上述兩個突變體的兩個單體用接頭連接，從而產(chǎn)生了能夠特異性切割g-t/t-g錯配的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。由此完成了本發(fā)明。

5、具體地，本發(fā)明的第一方面提供：

6、[1]由以下(a)或(b)表示的多肽：

7、(a)一種多肽，其選自由以下(1)至(4)組成的組并且具有切割核酸鏈的活性，所述核酸鏈具有在雙鏈核酸中形成錯配堿基對的鳥嘌呤(g)：

8、(1)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中所示的氨基酸序列中，由堿性氨基酸殘基對第47位的絲氨酸的取代和由酸性氨基酸殘基對第76位的天冬酰胺的取代；

9、(2)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在(1)中所述的取代氨基酸序列中的另外的1至10個氨基酸殘基的突變，其中所述突變是取代、缺失、插入和/或添加，并且(1)中所述的取代氨基酸序列中的氨基酸取代得到保留；

10、(3)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同源性，其中(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留；和

11、(4)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同一性，其中(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留；或者

12、(b)一種多肽，其選自由以下(5)至(8)組成的組并且具有切割核酸鏈的活性，所述核酸鏈具有在雙鏈核酸中形成錯配堿基對的胸腺嘧啶(t)：

13、(5)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中所示的氨基酸序列中，由堿性氨基酸殘基對第78位的谷氨酰胺的取代和由中性(極性，不帶電)氨基酸殘基或含硫氨基酸殘基對第123位的亮氨酸的取代，或由疏水性氨基酸殘基或含硫氨基酸殘基對第125位的亮氨酸的取代；

14、(6)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在(5)中所述的取代氨基酸序列中的另外的1至10個氨基酸殘基的突變，其中所述突變是取代、缺失、插入和/或添加，并且(5)中所述的取代氨基酸序列中的氨基酸取代得到保留；

15、(7)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同源性，其中(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留；和

16、(8)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同一性，其中(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留；

17、[2]根據(jù)[1]所述的多肽，其中：

18、所述堿性氨基酸殘基是賴氨酸、精氨酸或組氨酸，

19、所述酸性氨基酸殘基是天冬氨酸或谷氨酸，

20、所述中性(極性、不帶電)氨基酸是蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸或半胱氨酸，

21、所述含硫氨基酸是半胱氨酸或甲硫氨酸，以及

22、所述疏水(非極性)氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸；

23、[3]根據(jù)[1]或[2]所述的多肽，其包含選自seq?id?no:6至15的氨基酸序列；

24、[4]一種核酸，其編碼根據(jù)[1]-[3]中任一項所述的多肽；

25、[5]根據(jù)[4]所述的核酸，其包含選自seq?id?no:21至30的核苷酸序列；

26、[6]一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)[4]或[5]所述的核酸和表達(dá)調(diào)控序列；

27、[7]一種細(xì)胞，其由根據(jù)[6]所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，表達(dá)具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽；

28、[8]一種用于切割具有錯配的雙鏈核酸的方法，所述方法包括使用根據(jù)[1]-[3]中任一項所述的多肽處理所述雙鏈核酸的步驟；

29、[9]一種組合物，其包含以下(a)至(d)：

30、(a)根據(jù)[1]-[3]中任一項所述的多肽；

31、(b)一種寡核苷酸，其在與非靶核酸雜交時形成包含至少一個錯配的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸被(a)的多肽切割，并且在與靶核酸雜交時形成不被(a)的多肽切割的雙鏈核酸；

32、(c)至少一對寡核苷酸引物；和

33、(d)具有dna聚合酶活性的多肽；

34、[10]一種用于擴(kuò)增核酸的方法，所述方法包括以下步驟(1)和(2)：

35、(1)制備組合物的步驟，所述組合物包含作為模板的核酸分子和以下(a)至(d)：

36、(a)根據(jù)[1]-[3]中任一項所述的多肽；

37、(b)一種寡核苷酸，其在與非靶核酸雜交時形成包含至少一個錯配的雙鏈核酸，其中所述雙鏈核酸被(a)的多肽切割，并且在與靶核酸雜交時形成不被(a)的多肽切割的雙鏈核酸；

38、(c)至少一對寡核苷酸引物；和

39、(d)具有dna聚合酶活性的多肽；和

40、(2)使步驟(1)中獲得的組合物在適當(dāng)?shù)臈l件下反應(yīng)以進(jìn)行核酸擴(kuò)增的步驟；

41、[11]根據(jù)[10]所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法、等溫核酸擴(kuò)增方法或多重置換擴(kuò)增(mda)方法進(jìn)行；

42、[12]一種用于抑制包含特定核苷酸序列的核酸擴(kuò)增的方法，所述方法包括在以下(a)至(d)的存在下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的步驟：

43、(a)一種寡脫氧核苷酸，其經(jīng)設(shè)計以在與包含特定核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的核酸雜交時產(chǎn)生一個或幾個錯配；

44、(b)dna聚合酶；

45、(c)至少一對寡核苷酸引物；和

46、(d)根據(jù)[1]-[3]中任一項所述的多肽；

47、[13]根據(jù)[12]所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或等溫核酸擴(kuò)增；

48、[14]一種用于優(yōu)先擴(kuò)增靶dna的方法，所述方法包括通過根據(jù)[12]或[13]所述的方法抑制具有與靶dna相差一個或幾個核苷酸的核苷酸序列的dna的擴(kuò)增；

49、[15]根據(jù)[14]所述的方法，其用于擴(kuò)增具有野生型核苷酸序列的dna和通過彼此不同的單核苷酸多態(tài)性突變而不同于野生型dna的dna中的一個；

50、[16]根據(jù)[15]所述的方法，其中所述單核苷酸多態(tài)性突變是與癌變或癌癥治療劑的治療效果相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性突變；和

51、[17]二聚體形式的多肽，其選自：

52、(1)同二聚體，其具有作為亞基的根據(jù)權(quán)利要求1(a)所述的多肽，

53、(2)同二聚體，其具有作為亞基的根據(jù)權(quán)利要求1(b)所述的多肽，和

54、(3)異二聚體，其具有作為亞基的根據(jù)[1](a)所述的多肽和根據(jù)[1](b)所述的多肽。

55、本發(fā)明的效果

56、根據(jù)本發(fā)明，提供了一種在生物技術(shù)中具有很大實用性的耐熱的錯配核酸內(nèi)切酶突變體、包含所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的組合物，以及使用所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的方法。

57、實施方案的描述

58、如本文所用，術(shù)語“錯配”是指不同于存在于雙鏈核酸中的watson-crick堿基對的堿基配對，換言之，不同于g(鳥嘌呤堿基)-c(胞嘧啶堿基)，和a(腺嘌呤堿基)-t(胸腺嘧啶堿基)或u(尿嘧啶堿基)的堿基配對的組合的堿基配對。

59、如本文所用，術(shù)語“gg-特異性”是指對gg錯配具有特異性，術(shù)語“tt-特異性”是指對tt錯配具有特異性，并且術(shù)語“gt/tg-特異性”是指對g-t或t-g錯配具有特異性。換言之，這些術(shù)語意味著基本上僅識別所指出的錯配。

60、如本文所用，術(shù)語“具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽(有時簡稱為錯配核酸內(nèi)切酶)”是指具有切割存在于雙鏈核酸中的錯配位點的活性的核酸酶。錯配核酸內(nèi)切酶活性包括在形成錯配堿基對的核苷酸附近切割磷酸二酯鍵的活性，以及在位于與錯配堿基對相距1-5個堿基對、優(yōu)選1-3個堿基對的核苷酸附近切割磷酸二酯鍵的活性。在本發(fā)明中，錯配核酸內(nèi)切酶優(yōu)選是具有特異性識別雙鏈核酸中的特定錯配堿基對以切割雙鏈核酸的活性的核酸酶。如本文所用，耐熱的錯配核酸內(nèi)切酶是指具有在50℃或更高的溫度下切割存在于雙鏈核酸中的錯配位點的活性的核酸酶。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用耐熱的錯配核酸內(nèi)切酶。

61、本發(fā)明中的錯配核酸內(nèi)切酶是形成二聚體而發(fā)揮活性的酶。已知當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的單體(也稱為“亞基”，意指二聚體的組分)在諸如大腸桿菌等宿主中表達(dá)時，單體自然地結(jié)合形成二聚體(同二聚體)。如本文所用，“具有切割核酸鏈的活性的多肽，所述核酸鏈具有在雙鏈核酸中形成錯配堿基對的鳥嘌呤(g)”和“具有切割核酸鏈的活性的多肽，所述核酸鏈具有在雙鏈核酸中形成錯配堿基對的胸腺嘧啶(t)”是指單體。

62、氨基酸根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)分為親水(極性)氨基酸和疏水(非極性)氨基酸。

63、親水(極性)氨基酸包括酸性氨基酸、堿性氨基酸、中性(極性、不帶電)氨基酸、含芳環(huán)氨基酸中的酪氨酸和含硫氨基酸中的半胱氨酸。

64、疏水(非極性)氨基酸包括具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸、含芳環(huán)氨基酸中的色氨酸和苯丙氨酸以及含硫氨基酸中的甲硫氨酸。

65、酸性氨基酸包括天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)。

66、堿性氨基酸包括賴氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)和組氨酸(his，h)。

67、中性(極性、不帶電)氨基酸包括蘇氨酸(thr，t)、絲氨酸(ser，s)、天冬酰胺(asn，n)、谷氨酰胺(gln，q)、酪氨酸(tyr，y)和半胱氨酸(cys)。

68、含芳環(huán)的氨基酸包括酪氨酸(tyr，y)、色氨酸(trp，w)和苯丙氨酸(phe，f)。

69、含硫氨基酸包括半胱氨酸(cys，c)和甲硫氨酸(met，m)。

70、具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸包括丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、纈氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)、異亮氨酸(ile，i)和脯氨酸(pro，p)。脯氨酸是具有環(huán)化側(cè)鏈的亞氨基酸。

71、如本文所用，“相似的氨基酸”是指基于上述化學(xué)性質(zhì)分類為同一組的氨基酸。例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸被分類為堿性氨基酸，并且因此是彼此相似的氨基酸。

72、如本文所用，“氨基酸序列的同源性”是指在考慮上述相似氨基酸的情況下，多肽序列之間的同源性或相似性。如上所述，基于氨基酸的化學(xué)性質(zhì)分類為同一組的氨基酸被認(rèn)為是“同源的”。

73、如本文所用，“氨基酸序列的同一性”是指在不考慮上述相似氨基酸的情況下，多肽序列之間的同一性。如本文所用，“核苷酸序列的同一性”是指多核苷酸序列之間的同一性。

74、可使用已知程序來計算氨基酸序列同源性、氨基酸序列同一性和核苷酸序列同一性的評分。所述程序的實例包括但不限于blast、blat、fasta、ssearch和mpsrch。

75、如本文所用，氨基酸編號(也稱為氨基酸位置)是基于seq?id?no:1的氨基酸序列。因此，在從源自其他生物體的同源蛋白或seq?id?no:1的多肽的變體蛋白中的n-末端計數(shù)時，通過如本文所用的氨基酸編號指示的氨基酸位置，可能不同于通過相同氨基酸編號指示的氨基酸位置。換言之，如本文所用的“對應(yīng)于野生型錯配核酸內(nèi)切酶的氨基酸序列中的第47位的位置”是指當(dāng)野生型氨基酸序列與突變氨基酸序列或源自其他生物體的錯配核酸內(nèi)切酶的氨基酸序列進(jìn)行比較和比對時，被認(rèn)為處于與野生型氨基酸序列(seq?id?no:1)中的第47位相同的位置的氨基酸殘基。

76、如本文所用，“靶核酸”或“靶dna”是不被本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體切割的核酸。換言之，靶核酸或靶dna是將通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸(作為模板)。另一方面，“非靶核酸”或“非靶dna”是被本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體切割的核酸。換言之，非靶核酸或非靶dna是通過本發(fā)明的切割方法切割并因此不通過本發(fā)明的擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸?！鞍泻怂帷被颉鞍衐na”和“非靶核酸”或“非靶dna”沒有特別限制，并且可以是希望彼此區(qū)分的任何核酸。

77、在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明。

78、1.本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體

79、本發(fā)明的第一方面涉及錯配核酸內(nèi)切酶突變體，即具有改變的底物特異性的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。錯配核酸內(nèi)切酶突變體的特征在于在來自激烈熱球菌的野生型錯配核酸內(nèi)切酶(也稱為pfunucs)或其同源物或具有pfunucs的錯配核酸內(nèi)切酶活性的突變體中，促成底物識別和/或切割的位點的氨基酸序列的變化。

80、本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以例如通過將氨基酸取代引入來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065(refseq?id：wp_11011124.1，seq?id?no:1，原名：pf0012，原refseqid:np_577741)中來制備，其中所述氨基酸取代是(i)由堿性氨基酸對第47位的絲氨酸的氨基酸取代，和由酸性氨基酸對第76位的天冬酰胺的氨基酸取代，或(ii)由堿性氨基酸對第78位的谷氨酰胺的氨基酸取代，和由中性(極性，不帶電)氨基酸或含硫氨基酸對第123位的亮氨酸的氨基酸取代，或由疏水性氨基酸或含硫氨基酸對第125位的亮氨酸的氨基酸取代。

81、此外，本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體還可以通過將對應(yīng)于上述氨基酸取代(i)或(ii)的突變引入如下而制備：多肽w77f(seq?id?no:2)，其中pf_rs00065中第77位的色氨酸被替換為苯丙氨酸；來自詹氏甲烷球菌的多肽mj?rs01180(ref?seq?id：np_247194，seqid?no:3，原名：mj_0225)，其是pf_rs00065的同源物；來自thermococcus?barophilus的多肽termp_01877(ref?seq?id：yp_004072075，seq?id?no:4)，其是pf_rs00065的同源物；或來自thermococcus?kodakarensis菌株kod1(jcm?12380t)的多肽(seq?id?no:5)，其是pf_rs00065的同源物。

82、本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體優(yōu)選為熱穩(wěn)定的酶。例如，在本發(fā)明的方法中優(yōu)選使用即使在熱循環(huán)(諸如pcr)中也穩(wěn)定地保持活性的多肽。在本發(fā)明的方法中，可以使用即使在50℃或更高，優(yōu)選60℃或更高，進(jìn)一步優(yōu)選70℃或更高，并且更優(yōu)選70℃或更高，也不失活的多肽。

83、例如，本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體包含如下所述的(a)和/或(b)中所示的多肽。本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的優(yōu)選實例包括由如下所述的(a)和/或(b)中所示的多肽組成的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。

84、(a)一種多肽，其選自由以下(1)至(4)組成的組并且具有切割核酸鏈的活性，所述核酸鏈具有在雙鏈核酸中形成錯配堿基對的鳥嘌呤(g)：

85、(1)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中所示的氨基酸序列中，由堿性氨基酸殘基對第47位的絲氨酸的取代和由酸性氨基酸殘基對第76位的天冬酰胺的取代；

86、(2)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在(1)中所述的取代氨基酸序列中的另外的1至10個氨基酸殘基的突變，其中所述突變是取代、缺失、插入和/或添加，并且(1)中所述的取代氨基酸序列中的氨基酸取代得到保留；

87、(3)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同源性，其中(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留；和

88、(4)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同一性，其中(1)或(2)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留。

89、(b)一種多肽，其選自由以下(5)至(8)組成的組并且具有切割核酸鏈的活性，所述核酸鏈具有在雙鏈核酸中形成錯配堿基對的胸腺嘧啶(t)：

90、(5)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中所示的氨基酸序列中，由堿性氨基酸殘基對第78位的谷氨酰胺的取代和由中性(極性，不帶電)氨基酸殘基或含硫氨基酸殘基對第123位的亮氨酸的取代，或由疏水性氨基酸殘基或含硫氨基酸殘基對第125位的亮氨酸的取代；

91、(6)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在(5)中所述的取代氨基酸序列中的另外的1至10個氨基酸殘基的突變，其中所述突變是取代、缺失、插入和/或添加，并且(5)中所述的取代氨基酸序列中的氨基酸取代得到保留；

92、(7)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同源性，其中(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留；和

93、(8)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列具有50％或更高的同一性，其中(5)或(6)中所述的取代或突變的氨基酸序列中的氨基酸取代或突變得到保留。

94、本發(fā)明提供了具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽。具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的實例包括但不限于如上所述的(a)中所示的多肽。具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的優(yōu)選實例包括但不限于包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中所示的氨基酸序列中，由堿性氨基酸殘基對第47位的絲氨酸的取代和由酸性氨基酸殘基對第76位的天冬酰胺的取代，如上文(a)(1)中所述。具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的進(jìn)一步實例包括包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中，由具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸對第123位的亮氨酸的取代，以及上述在第47位和第76位的氨基酸取代。具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的進(jìn)一步優(yōu)選實例包括包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1的氨基酸序列中，由賴氨酸、精氨酸或組氨酸對第47位的絲氨酸的取代和由天冬氨酸或谷氨酸對第76位的天冬酰胺的取代。具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的進(jìn)一步優(yōu)選實例還包括包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中，由丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或脯氨酸對第123位的亮氨酸的取代，以及上述在第47位和第76位的氨基酸取代。

95、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽。具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的實例包括但不限于如上所述的(b)中所示的多肽。具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的優(yōu)選實例包括但不限于包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1中所示的氨基酸序列中，由堿性氨基酸殘基對第78位的谷氨酰胺的取代，和由中性(極性，不帶電)氨基酸殘基或含硫氨基酸殘基對第123位的亮氨酸的取代，或由疏水性氨基酸殘基或含硫氨基酸殘基對第125位的亮氨酸的取代，如上文(b)(5)中所述。具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的進(jìn)一步優(yōu)選實例包括包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在seq?id?no:1的氨基酸序列中，由賴氨酸、精氨酸或組氨酸對第78位的谷氨酰胺的取代，和由蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸對第123位的亮氨酸的取代，或由丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸對第125位的亮氨酸的取代。在具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的更優(yōu)選的實例中，第125位的亮氨酸可以被替換成除亮氨酸以外的具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸。

96、具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽可以呈同二聚體的形式。當(dāng)具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽作為單體在宿主(諸如大腸桿菌等)中表達(dá)時，所述單體自然地結(jié)合形成二聚體(同二聚體)并因此表現(xiàn)出活性。這同樣適用于具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽。

97、此外，本發(fā)明還提供了具有g(shù)t/tg-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽。具有g(shù)t/tg-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的實例包括但不限于包含上述(a)中所示的多肽和上述(b)中所示的多肽的異二聚體蛋白。具有g(shù)t/tg-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的優(yōu)選實例包括但不限于包含具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的異二聚體蛋白。異二聚體蛋白可以通過在宿主(諸如大腸桿菌等)中表達(dá)具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽，從而形成二聚體(異二聚體)來產(chǎn)生。然而，用于產(chǎn)生異二聚體蛋白的方法沒有限制。在單獨表達(dá)具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽，且隨后通過任何方法解離成單體后，可以將兩種多肽的單體混合以允許重新結(jié)合。在產(chǎn)生異二聚體蛋白的優(yōu)選方法中，具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽經(jīng)由接頭作為單個多肽表達(dá)。具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽在單個多肽內(nèi)的排列沒有限制。它們可以按如下順序排列：[具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽]-[接頭]-[具有tt-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽]，或[具有tt特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽]-[接頭的順序排列]-[具有g(shù)g-特異性錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽]。所述接頭優(yōu)選是肽接頭。肽接頭的氨基酸序列和殘基數(shù)量(長度)沒有限制，只要接頭不抑制異二聚化以及雙鏈核酸的切割。此外，在具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和接頭之間可以存在用于切割融合多肽的蛋白酶的識別序列，例如因子xa、prescission蛋白酶、凝血酶、腸激酶、tev蛋白酶(煙草蝕紋病毒蛋白酶)等。

98、除了(a)(1)和(b)(5)中所述的上述氨基酸取代之外，本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以包含在其他氨基酸位置的突變，只要所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體不喪失底物特異性(對gg、tt或gt/tg錯配的特異性)。在其他氨基酸位置的突變的實例包括但不限于增加耐熱性的突變、增加對抑制劑的抗性的突變和改善錯配核酸內(nèi)切酶性質(zhì)的突變，只要本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的底物特異性得到保持。如本文所用，“突變”可以是氨基酸的任何取代、插入、缺失或添加。

99、例如，包括在其他氨基酸位置的突變的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列除了(a)(1)和(b)(5)中的上述氨基酸取代之外，包含另外的1至10個氨基酸殘基的突變。

100、此外，例如，在其他氨基酸位置包含突變的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列與包含(a)(1)和(b)(5)中的上述氨基酸取代的seq?id?no:1的氨基酸序列或與包含(a)(1)和(b)(5)中的上述氨基酸取代和另外的1至10個氨基酸殘基的突變seq?id?no:1的氨基酸序列具有50％或更高的同源性。所述50％或更高的同源性包括例如50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高，或75％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選85％或更高，進(jìn)一步更優(yōu)選90％或更高，并且甚至更優(yōu)選95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高，或99％或更高的氨基酸序列同源性。

101、此外，例如，在其他氨基酸位置包含突變的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列與包含(a)(1)和(b)(5)中的上述氨基酸取代的seq?id?no:1的氨基酸序列或與包含(a)(1)和(b)(5)中的上述氨基酸取代和另外的1至10個氨基酸殘基的突變seq?id?no:1的氨基酸序列具有50％或更高的同一性。所述50％或更高的同一性包括例如50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高，或75％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選85％或更高，進(jìn)一步優(yōu)選90％或更高，并且甚至更優(yōu)選95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高，或99％或更高的氨基酸序列同一性。

102、此外，本發(fā)明包括錯配核酸內(nèi)切酶突變體，所述錯配核酸內(nèi)切酶突變體包含添加到n-末端或c-末端的親和標(biāo)簽，以用于促進(jìn)純化的目的。所述親和標(biāo)簽可以是已知的親和標(biāo)簽，并且它的實例包括由4至8個連續(xù)的his殘基組成的組氨酸(his)標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)標(biāo)簽和由8個氨基酸殘基(trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys)組成的strep(ii)標(biāo)簽。所述標(biāo)簽可以任選地經(jīng)由包含1至15個氨基酸的接頭連接至本發(fā)明的突變體。此外，在具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽和接頭之間可以存在用于融合多肽切割的蛋白酶的識別序列。所述蛋白酶的實例包括因子xa、prescission蛋白酶、凝血酶、腸激酶和tev蛋白酶(煙草蝕紋病毒蛋白酶)。因此，包含親和標(biāo)簽、接頭和/或用于融合多肽切割的蛋白酶的識別序列的此類多肽也是本發(fā)明的包含在其他氨基酸位置的突變的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的實例。例如，在如上所述的1至10個的突變氨基酸殘基數(shù)量、氨基酸同源性或氨基酸同一性的范圍內(nèi)，本發(fā)明的包含在其他氨基酸位置的突變的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以包含親和標(biāo)簽、接頭和/或用于融合多肽切割的蛋白酶的識別序列。

103、本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可以包含人造氨基酸(也稱為非天然氨基酸)。人造氨基酸的實例包括鹵代(氯代、溴代、碘代)酪氨酸、酪氨酸硫酸酯、疊氮基酪氨酸、乙?；嚢彼?、疊氮基苯丙氨酸和氟代苯丙氨酸。用人造氨基酸替換天然氨基酸的方法沒有特別限定，并且可以使用公知的方法。

104、本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的實例包括但不限于由seq?id?no:6-15中所示的任何氨基酸序列組成的突變體。

105、本發(fā)明的此類錯配核酸內(nèi)切酶突變體適用于下文所述的各種用途，例如，用于排除包含特定dna序列的dna、并且擴(kuò)增和檢測其他dna的方法中。

106、錯配核酸內(nèi)切酶的活性可以使用含有錯配的雙鏈核酸作為底物來測量。具體地，通過使錯配核酸內(nèi)切酶與過量的含有錯配的雙鏈核酸反應(yīng)，且然后測量每單位時間切割的核酸的量來測量活性?？梢酝ㄟ^電泳等，分別地定量切割的雙鏈核酸與未經(jīng)切割的核酸。雙鏈核酸可以用熒光物質(zhì)和猝滅劑進(jìn)行雙重標(biāo)記，使得只有在被切割時才檢測到熒光強(qiáng)度的增加。通過使用雙重標(biāo)記的雙鏈核酸，以適當(dāng)?shù)臅r間間隔確定反應(yīng)溶液中的熒光強(qiáng)度來促進(jìn)活性測量。也可以通過改變作為底物的雙鏈核酸中的錯配堿基對，來研究靶向特定錯配的切割活性。

107、2.編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸

108、本發(fā)明提供了編碼錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸。具體地，提供了編碼本發(fā)明的上述錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸。

109、編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的實例包括但不限于包含編碼seqid?no:6-15中所示氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的優(yōu)選實例包括包含編碼seq?id?no:21-30所示氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。

110、作為本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的實例，在表1中顯示了實施例中制備的多肽的氨基酸序列及其編碼核酸序列，但本發(fā)明不限于此。

111、[表1]

112、

113、

114、編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸沒有特別限制，只要其由編碼可以在所使用的宿主中表達(dá)并且具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白質(zhì)的密碼子構(gòu)成。可以對核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以允許在宿主中表達(dá)或增加表達(dá)水平。密碼子優(yōu)化優(yōu)選通過本領(lǐng)域常用的方法進(jìn)行。

115、3.含有編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的表達(dá)載體本發(fā)明的表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸，以及與所述核酸可操作連接的表達(dá)調(diào)控序列。

116、本發(fā)明中使用的表達(dá)載體可以是本領(lǐng)域常用的表達(dá)載體，并且沒有特別限制?？梢允褂媚軌蛟谒拗骷?xì)胞中自主復(fù)制的載體，或能夠整合到宿主染色體中的載體?？梢允褂门c宿主相容的載體。

117、插入編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的表達(dá)載體的實例包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體和病毒載體。質(zhì)粒載體可以是適合于待使用的宿主的質(zhì)粒，并且此類質(zhì)粒的實例包括源自大腸桿菌的質(zhì)粒、源自屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌的質(zhì)粒，以及源自酵母的質(zhì)粒。此類質(zhì)粒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且存在許多市售的質(zhì)粒載體。這些已知的質(zhì)粒及其改變的質(zhì)粒可用于本發(fā)明中。噬菌體載體可以是例如λ噬菌體等。病毒載體可以是例如動物病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘病毒，或昆蟲病毒，如桿狀病毒。此外，已經(jīng)構(gòu)建了使用酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞作為宿主的許多異源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，并且已經(jīng)可以商購獲得。這樣的表達(dá)系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。

118、可以根據(jù)宿主選擇將包含在本發(fā)明的表達(dá)載體中的啟動子。例如，對于大腸桿菌，可以使用源自大腸桿菌或噬菌體的啟動子或其改變的啟動子，包括但不限于trp啟動子、lac啟動子、pl啟動子和pr啟動子。進(jìn)一步地，可以使用含有組合的源自噬菌體的啟動子和源自噬菌體的rna聚合酶基因的表達(dá)系統(tǒng)(例如pet表達(dá)系統(tǒng)等)。

119、為了便于純化表達(dá)的多肽，本發(fā)明的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含編碼親和標(biāo)簽的核酸。將編碼親和標(biāo)簽的核酸插入載體中，由此可以表達(dá)本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體和親和標(biāo)簽的融合蛋白。親和標(biāo)簽的實例包括但不限于組氨酸(his)標(biāo)簽、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)標(biāo)簽和由8個氨基酸殘基(trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys)組成的strep(ii)標(biāo)簽。標(biāo)簽可以添加到編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的5'端側(cè)和/或3'端側(cè)。標(biāo)簽可以適當(dāng)?shù)靥砑拥讲桓蓴_表達(dá)和標(biāo)簽功能的位置。標(biāo)簽優(yōu)選地是可以在所表達(dá)多肽的純化期間或之后被切割的標(biāo)簽。這種可被切割的標(biāo)簽的實例包括但不限于包含編碼用于切割融合多肽的蛋白酶的識別序列的核酸的標(biāo)簽，所述蛋白酶例如xa因子、prescission蛋白酶、凝血酶、腸激酶和tev蛋白酶(煙草蝕紋病毒蛋白酶)。

120、本發(fā)明的表達(dá)載體還含有一種或多種表達(dá)調(diào)控序列。表達(dá)調(diào)控序列的實例包括但不限于啟動子、參與調(diào)控啟動子的基因、核糖體結(jié)合序列、多聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止序列(轉(zhuǎn)錄終止子)和增強(qiáng)子。本發(fā)明的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含編碼復(fù)制起點或用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記(抗藥性基因、熒光標(biāo)記或發(fā)光標(biāo)記)的基因，以及用于增強(qiáng)翻譯效率的核苷酸序列。

121、4.用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞

122、將使用表達(dá)本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(宿主)可以是本領(lǐng)域常用的宿主，并且沒有特別限制。它的實例包括細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)、酵母、絲狀真菌、昆蟲細(xì)胞、真核細(xì)胞和動物細(xì)胞(哺乳動物細(xì)胞，包括人細(xì)胞等)。

123、在使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時，所述宿主細(xì)胞的實例包括細(xì)菌，其屬于埃希氏桿菌屬，諸如大腸桿菌；芽孢桿菌屬，諸如枯草芽孢桿菌；假單胞菌屬，諸如惡臭假單胞菌(pseudomonas?putida)，以及根瘤菌屬，諸如苜蓿根瘤菌(rhizobium?meliloti)?？捎糜谏a(chǎn)異源蛋白的大腸桿菌是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且存在很多市售的大腸桿菌菌株(例如，大腸桿菌bl21t1r、大腸桿菌bl21、大腸桿菌xl1-blue、大腸桿菌xl2-blue、大腸桿菌dh1、大腸桿菌jm109、大腸桿菌hb101等)。進(jìn)一步地，已知屬于芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌mi114、枯草芽孢桿菌207-21等，屬于短芽孢桿菌屬的橋石短芽孢桿菌(brevibacilluschoshinensis)等，作為生產(chǎn)異源蛋白的宿主。上述宿主細(xì)胞和合適的表達(dá)載體可以組合用于生產(chǎn)本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。優(yōu)選地，可以使用大腸桿菌bl21t1r或bl21de3，其為大腸桿菌的菌株bl21。

124、將表達(dá)載體引入宿主的方法沒有特別限制，只要它可以將核酸引入宿主。所述方法的實例包括使用鈣離子的方法、電穿孔法、原生質(zhì)球法和乙酸鋰法。將表達(dá)載體引入昆蟲細(xì)胞的方法沒有特別限制，只要它可以將dna引入昆蟲細(xì)胞，并且其實例包括磷酸鈣法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。當(dāng)使用噬菌體載體或病毒載體時，可以通過適合載體的方法感染宿主細(xì)胞，并且可以由此獲得表達(dá)本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的轉(zhuǎn)化體。

125、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體?？梢詮霓D(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物收集本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。培養(yǎng)條件沒有特別限制，只要其適合于所使用的表達(dá)載體、所使用的宿主等。例如，使用pet載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21de3，并且將轉(zhuǎn)化體接種到lb培養(yǎng)基中，并且在37℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的od值達(dá)到0.2-0.8時，向培養(yǎng)基添加iptg，且然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)以誘導(dǎo)所需蛋白的表達(dá)，例如在15-30℃持續(xù)2-5小時，優(yōu)選在25℃持續(xù)4-5個小時。然后，將培養(yǎng)物離心，并洗滌由此獲得的細(xì)菌細(xì)胞，且然后進(jìn)行超聲波處理或用溶菌酶裂解，以獲得含有本發(fā)明的突變體的總細(xì)胞提取物。由于提取物含有大量雜質(zhì)，本發(fā)明的突變體優(yōu)選通過適當(dāng)組合本領(lǐng)域中使用的純化方法進(jìn)行純化，例如硫酸銨沉淀、陰離子交換柱、陽離子交換柱、凝膠過濾柱、親和層析柱、透析等。通過使用適合于親和標(biāo)簽特性的親和載體，可以容易地純化帶有親和標(biāo)簽的突變體。進(jìn)一步地，除了iptg以外，可以根據(jù)所使用的宿主類型或表達(dá)載體，在適當(dāng)?shù)臅r機(jī)添加其他必要的誘導(dǎo)劑，諸如l-阿拉伯糖。

126、5.生產(chǎn)編碼本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的方法

127、生產(chǎn)本發(fā)明的核酸的方法包括，例如，在編碼錯配核酸內(nèi)切酶的核酸中，將編碼位于對應(yīng)于seq?id?no:1的氨基酸序列中第47位的位置處的絲氨酸的密碼子替換成編碼堿性氨基酸的密碼子的步驟，所述錯配核酸內(nèi)切酶多肽pf_rs00065或其突變多肽w77f，或rs_00065的同源物。絲氨酸的密碼子優(yōu)選替換成精氨酸或賴氨酸的密碼子，更優(yōu)選替換成精氨酸的密碼子。類似地，也可以替換在其他位置的氨基酸殘基的密碼子。

128、如上文第1部分所述，本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體可包含在其他氨基酸位置的突變。即使在這種情況下，也可以類似地替換密碼子。

129、包含上述密碼子替換的編碼錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸的優(yōu)選實例包括seqid?no:16-30的核酸。

130、密碼子替換可以通過已知的方法進(jìn)行，包括但不限于通過已知方法引入突變，例如使用用于引入突變的引物的位點特異性誘變，以及人工合成具有突變序列(或序列的一部分)的核酸。進(jìn)一步地，為了允許在所使用的宿主中表達(dá)或增加表達(dá)水平的目的，可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化可以通過本領(lǐng)域常用的方法進(jìn)行。

131、生產(chǎn)本發(fā)明的核酸的方法可以進(jìn)一步包括替換編碼錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核酸中的密碼子，以用于穩(wěn)定和增加宿主中的蛋白生產(chǎn)的目的。

132、對于生產(chǎn)本發(fā)明的核酸的方法，可以應(yīng)用上文第2部分中詳述的核酸。

133、6.本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法

134、本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法通過在含有二價金屬離子(例如鎂離子)的適當(dāng)緩沖液中，使用上文第1部分所述的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體處理具有錯配的雙鏈核酸而進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以切割含有g(shù)-g錯配、t-t錯配、g-t錯配或t-g錯配的雙鏈核酸。

135、對于本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法，具有錯配的雙鏈核酸可以是在內(nèi)部(在正常配對的兩個堿基對之間)含有錯配的雙鏈核酸。具有錯配的雙鏈核酸不僅可以是含有一個錯配的雙鏈核酸，還可以是含有間隔的兩個或更多個錯配的雙鏈核酸，或含有兩個或更多個連續(xù)錯配的雙鏈核酸。對于本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法中，錯配的實例包括優(yōu)選存在于雙鏈核酸中的1-8個連續(xù)錯配，更優(yōu)選1-4個連續(xù)錯配，進(jìn)一步優(yōu)選2個連續(xù)錯配，以及1個錯配。在本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法中，在雙鏈核酸中存在兩個或更多個錯配時，所述兩個或更多個錯配可以是相同種類的錯配，或者可以是不同種類的錯配。

136、此外，可以使用如wo2014/142261等中公開的寡脫氧核苷酸。如本文所用，所述寡脫氧核苷酸是經(jīng)設(shè)計以在與具有特定核苷酸序列(例如，具有感興趣的基因突變)的核酸雜交時產(chǎn)生一個或幾個錯配的寡脫氧核苷酸。對于作為用于突變檢測的探針的用途，寡脫氧核苷酸可以在兩端用熒光物質(zhì)和猝滅物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。可以適當(dāng)?shù)卮_定寡脫氧核苷酸的長度，使得寡脫氧核苷酸可以在待進(jìn)行的反應(yīng)條件下與具有特定核苷酸序列的核酸雜交。當(dāng)寡脫氧核苷酸與具有特定核苷酸序列的核酸雜交時，錯配優(yōu)選在距寡脫氧核苷酸的5'端和3'端二者至少3個核苷酸的位置產(chǎn)生。

137、此外，當(dāng)由于待檢測的基因突變與錯配核酸內(nèi)切酶的底物特異性不匹配而無法分析基因突變時，可以使用如wo2016/152812等中公開的抑制性寡核苷酸。如本文所用，抑制性寡核苷酸是在寡核苷酸與非靶核酸雜交時形成至少一個錯配的寡核苷酸，并且當(dāng)寡核苷酸與靶核酸雜交時形成比寡核苷酸與非靶核酸雜交時更多的錯配。當(dāng)抑制性寡核苷酸與非靶核酸雜交時形成的至少一個錯配的數(shù)量沒有特別限制，只要發(fā)生非靶核酸的選擇性切割，并且取決于抑制性寡核苷酸的長度，它的實例包括1-7、1-5或1-3個錯配。當(dāng)至少一個錯配的數(shù)量表示為占抑制性寡核苷酸的長度的百分比時，例如，至少一個錯配占抑制性寡核苷酸的長度的1-20％、3-15％或4-8％。作為這一方面的實例，闡述了其核苷酸序列僅相差一個堿基的靶核酸和非靶核酸的組合。當(dāng)抑制性寡核苷酸與靶核酸雜交時，在抑制性寡核苷酸與靶核酸/非靶核酸之間不同的堿基之間形成錯配(下文有時稱為第一錯配)，同時形成另一個錯配(以下有時稱為第二錯配)。

138、第一錯配的堿基對涉及靶核酸和非靶核酸之間不同的堿基，而無論錯配堿基對是否被具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的共存多肽識別并切割。

139、第二錯配是被具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的共存多肽識別并切割的錯配堿基對。例如，當(dāng)使用具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽以識別并切割鳥嘌呤堿基-鳥嘌呤堿基、鳥嘌呤堿基-胸腺嘧啶堿基，或胸腺嘧啶堿基-胸腺嘧啶堿基時，抑制性寡核苷酸被設(shè)計為形成選自上述錯配堿基對的錯配。

140、當(dāng)抑制性寡核苷酸與非靶核酸雜交時，形成第二錯配，而沒有形成第一錯配。

141、設(shè)計和使用具有上述特性的抑制性寡核苷酸，使得能夠通過具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽選擇性切割非靶核酸。本發(fā)明不限于使用能夠形成如上所述的一個或兩個錯配的抑制性寡核苷酸?？梢栽O(shè)計和使用能夠形成3個或更多個錯配的抑制性寡核苷酸，只要發(fā)生所需核酸的選擇性切割。在這種情況下，在靶核酸和非靶核酸中形成的至少一個錯配可以是第二錯配，而其他錯配可以或可不被具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽識別并切割。所述3個或更多個錯配優(yōu)選地被具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽識別并切割。

142、wo2014/142261等中公開的寡脫氧核苷酸和wo2016/152812等中公開的抑制性寡核苷酸由dna構(gòu)成，或者可以部分地包含核苷酸類似物或rna。換言之，寡脫氧核苷酸和抑制性寡核苷酸沒有特別限定，只要它們具有如下的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)在與非靶核酸雜交時形成具有至少一個錯配的雙鏈核酸，并且所述錯配被具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的共存多肽識別并切割。

143、具有通過本發(fā)明的方法切割的錯配的雙鏈核酸的實例包括pcr產(chǎn)物、源自生物樣品的核酸，諸如如基因組dna或其片段，以及合成核酸。具有錯配的雙鏈核酸可以是來自生物樣品的核酸的混合物，或者來自生物樣品的核酸和合成核酸的解鏈-再退火混合物。例如，當(dāng)包含突變的核酸和野生型核酸混合、解鏈和再退火時，形成錯配并且在錯配的位置發(fā)生錯配核酸內(nèi)切酶的切割。可以觀察由此在通過錯配核酸內(nèi)切酶切割后獲得的核酸片段的大小，以評估突變的存在或不存在和突變的位置。使用本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶，允許通過簡單地將這種錯配核酸內(nèi)切酶添加用于核酸擴(kuò)增(諸如pcr)的反應(yīng)溶液的突變分析。對于pcr，已知當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到高于一定數(shù)量時，沒有發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效果的增加。這主要是因為添加的引物或底物dntp耗盡或引物與反應(yīng)產(chǎn)物之間競爭退火。此時，反應(yīng)產(chǎn)物之間發(fā)生退火。如果存在具有突變的模板和野生型模板二者，則通過從突變模板擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物與從野生型模板擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物之間的退火，在突變位置形成錯配。因此，通過簡單地在本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶的存在下進(jìn)行比通常更多的循環(huán)數(shù)的pcr，使突變分析成為可能。換言之，本發(fā)明提供了一種分析突變的方法，所述方法包括用上文第1部分所述的錯配核酸內(nèi)切酶處理雙鏈核酸。

144、本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法可以在酸性高分子物質(zhì)的存在下進(jìn)行。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸性高分子物質(zhì)具有通過酸性高分子物質(zhì)的共存來控制多肽的錯配識別和切割活性的效果。酸性高分子物質(zhì)在含有少量核酸的樣品中發(fā)揮更大的作用。酸性高分子物質(zhì)的優(yōu)選實例包括聚陰離子。酸性高分子物質(zhì)的優(yōu)選實例還包括具有糖骨架的酸性多糖和具有線性碳鏈的酸性多糖。作為酸性高分子物質(zhì)，可以使用選自以下的一種或多種物質(zhì)：含硫酸巖藻糖的多糖、硫酸葡聚糖、角叉菜膠、肝素、硫酸鼠李聚糖、硫酸皮膚素(硫酸軟骨素b)、硫酸乙酰肝素、透明質(zhì)酸、海藻酸、果膠、聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚乙烯基硫酸酯、聚苯乙烯硫酸酯，及其鹽，以及與靶核酸和非靶核酸不同的核酸。

145、本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法還可以與增殖細(xì)胞核抗原(pcna)的使用組合進(jìn)行。

146、7.本發(fā)明的雙鏈核酸的擴(kuò)增方法

147、本發(fā)明的雙鏈核酸的切割方法甚至可以在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的過程中進(jìn)行。通過向用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物添加錯配核酸內(nèi)切酶，來切割具有錯配的雙鏈核酸，所述錯配通過在擴(kuò)增過程中并入錯誤的核苷酸而形成。由此，抑制在反應(yīng)開始前具有不同于模板核酸的序列的核酸的擴(kuò)增。因此，使得具有降低錯誤率的核酸擴(kuò)增成為可能。

148、也即，本發(fā)明提供了一種核酸擴(kuò)增方法，其包括通過使用上文第1部分所述的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體切割具有錯配的雙鏈核酸的步驟。切割具有錯配的雙鏈核酸的步驟可以與核酸擴(kuò)增步驟同時進(jìn)行。此外，作為本發(fā)明的一個方面，提供了一種組合物，其包含(a)dna聚合酶，(b)至少一對寡核苷酸引物，和(c)上文第1部分所述的錯配核酸內(nèi)切酶。

149、類似地，作為本發(fā)明的一個方面，還提供了一種核酸擴(kuò)增方法，其包括制備如下組合物的步驟，所述組合物包含上述用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的組合物和作為模板的核酸分子；和通過使所獲得的組合物在適當(dāng)?shù)臈l件下反應(yīng)以進(jìn)行核酸擴(kuò)增的步驟。

150、上述組合物可以進(jìn)一步包含選自如下的至少一種：反應(yīng)緩沖液、二價金屬離子、脫氧核糖核苷酸、寡核苷酸探針和嵌入染料。當(dāng)所述組合物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)時，所述組合物可以進(jìn)一步包含作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板的核酸。在所述組合物中，脫氧核糖核苷酸可以含有核苷酸類似物。反應(yīng)緩沖劑是指具有緩和反應(yīng)溶液中氫離子濃度(ph)變化的能力的化合物或混合物。由于弱酸及其鹽，或弱堿及其鹽的混合溶液通常具有強(qiáng)的緩沖作用，所述混合溶液廣泛用作反應(yīng)緩沖液，以用于控制ph的目的。用于本發(fā)明中的反應(yīng)緩沖液的實例包括good's緩沖液，諸如tris-hcl和hepes-koh，以及磷酸鹽緩沖液，諸如磷酸鈉緩沖液。二價金屬離子的實例包括鎂離子、錳離子、鋅離子和鈷離子。二價金屬離子可以作為鹽的形式提供，例如氯化物、硫酸鹽或乙酸鹽。

151、本發(fā)明的雙鏈核酸的擴(kuò)增方法的實例是擴(kuò)增dna的方法，但本發(fā)明不特別限于此。擴(kuò)增dna的方法的實例包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、mda(多重置換擴(kuò)增)和等溫核酸擴(kuò)增例如ican和lamp。

152、用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上述組合物中的具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的濃度可以通過視情況，在每個反應(yīng)系統(tǒng)中測定不抑制dna擴(kuò)增反應(yīng)的濃度，或?qū)哂绣e配的雙鏈核酸的切割有效的濃度來確定。

153、作為用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的上述組合物的至少一對引物，選擇適合用于各核酸擴(kuò)增方法的兩種或更多的引物。引物可以是dna引物、rna引物或其中dna分子的一部分被rna替換的嵌合引物，只要獲得期望的擴(kuò)增即可。引物也可以是含有已知核酸類似物的引物，以及標(biāo)記的引物，例如具有用于檢測目的的熒光染料。

154、此外，作為本發(fā)明的組合物的另一方面，所述組合物可以包含用于防止殘留污染(carryover)的組分。這種組分的實例包括dutp和尿嘧啶n-糖苷酶。

155、本發(fā)明的雙鏈核酸的擴(kuò)增方法可以在上述酸性高分子物質(zhì)的存在下進(jìn)行。酸性高分子物質(zhì)在含有少量核酸的樣品中發(fā)揮更大的作用。酸性高分子物質(zhì)的優(yōu)選實例如用于選擇性切割本發(fā)明的非靶核酸的方法的上文所述。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步與上述增殖細(xì)胞核抗原(pcna)或其突變體組合進(jìn)行。

156、8.本發(fā)明的擴(kuò)增核酸抑制的方法

157、本發(fā)明的擴(kuò)增核酸抑制的方法包括利用上文第1部分所述的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體和適當(dāng)設(shè)計的寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸來抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增。

158、因此，本發(fā)明的一個方面提供了一種用于抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增的方法，所述方法包括在如下的存在下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的步驟：(a)一種經(jīng)設(shè)計以在與包含特定核苷酸序列的核酸雜交時產(chǎn)生一個或幾個錯配的寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸；(b)dna聚合酶；(c)至少一對寡核苷酸引物；和(d)具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽。本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了一種用于優(yōu)先擴(kuò)增靶核酸的方法，所述方法包括通過使用上述方法抑制具有特定核苷酸序列的核酸的擴(kuò)增，所述特定核苷酸序列含有與靶核酸的核苷酸序列不同的一個或幾個核酸。

159、(a)的寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸沒有特別限制，只要它是具有如下核苷酸序列的單鏈dna，所述核苷酸序列經(jīng)設(shè)計以在與包含特定核苷酸序列的核酸雜交時形成一個或幾個錯配。寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸可以是所謂的嵌合寡脫氧核苷酸，其中dna分子的一部分被rna替換。可以對寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸的3'-末端進(jìn)行修飾，以抑制dna聚合酶對單鏈dna的延伸反應(yīng)，但本發(fā)明不特別限于此。修飾的實例包括胺化?？梢酝ㄟ^硫代磷酸化或其他修飾保護(hù)寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸免于脫氧核糖核酸酶的切割，只要與寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸結(jié)合的核酸經(jīng)受具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的切割?？梢杂脽晒馊玖?、猝滅劑等標(biāo)記寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸，用于檢測的目的。

160、可以適當(dāng)?shù)卮_定寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸的長度，使得寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸可以在進(jìn)行的反應(yīng)條件下與具有特定核苷酸序列的核酸雜交。當(dāng)寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸與具有特定核苷酸序列的核酸雜交時產(chǎn)生的錯配的位置優(yōu)選距寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸的5'端和3'端二者至少3個核苷酸。

161、例如，在進(jìn)行本發(fā)明的方法，以通過包括在高溫下的反應(yīng)(諸如pcr)的方法抑制具有特定堿基序列的核酸的擴(kuò)增時，優(yōu)選使用耐熱的錯配核酸內(nèi)切酶。上文第1部分所述的錯配核酸內(nèi)切酶包括在pcr中不失活的熱穩(wěn)定酶，并且此類酶適用于上述用途。

162、因此，本發(fā)明還提供一種用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的組合物，包括以下(a)至(d)：

163、(a)一種經(jīng)設(shè)計以在與包含特定核苷酸序列的核酸雜交時產(chǎn)生一個或幾個錯配的寡脫氧核苷酸，或抑制性寡核苷酸或其互補(bǔ)鏈；

164、(b)dna聚合酶；

165、(c)至少一對寡核苷酸引物；和

166、(d)上文第1部分所述的本發(fā)明的錯配核酸內(nèi)切酶突變體。

167、上述組合物可以進(jìn)一步包含選自如下的至少一種：反應(yīng)緩沖液、二價金屬離子、脫氧核糖核苷酸、寡核苷酸探針和嵌入染料。上述組合物可以進(jìn)一步包含作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板的核酸。上述組合物可以進(jìn)一步包含dutp或尿嘧啶n-糖苷酶。

168、本發(fā)明的用于抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增的方法可以通過任何核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行。此類核酸擴(kuò)增方法的優(yōu)選實例是但不限于，擴(kuò)增dna的方法。擴(kuò)增dna的方法的實例包括pcr、mda和等溫核酸擴(kuò)增，例如ican和lamp。

169、本發(fā)明的用于抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增的方法可以應(yīng)用于任何核酸。當(dāng)該方法應(yīng)用于dna擴(kuò)增時，這樣的dna可以是存在于人工制備的dna混合物、源自環(huán)境的樣品、生物樣品或由上述樣品制備的dna混合物中的dna。生物樣品的實例包括但不限于源自哺乳動物(諸如人)的樣品。dna混合物的實例包括但不限于基因組dna的片段的混合物、通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從mrna產(chǎn)生的cdna的混合物、以及多個pcr產(chǎn)物的混合物。抑制其擴(kuò)增的具有特定核苷酸序列的dna的實例包括仍未分離的來自rrna的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以及通過引物配對產(chǎn)生的小分子dna。在擴(kuò)增基因文庫隨后進(jìn)行功能篩選的情況下，可以通過抑制具有陽性已知基因序列的dna的擴(kuò)增，來產(chǎn)生能夠更有效地檢索未知基因的文庫。

170、在本發(fā)明的方法中，具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽的濃度可以通過視情況，在每個反應(yīng)系統(tǒng)中測定不抑制dna擴(kuò)增反應(yīng)的濃度，或?qū)哂绣e配的雙鏈核酸的切割有效的濃度來確定。寡核苷酸或抑制性寡脫氧核苷酸的濃度可以通過考慮模板量和靶dna的擴(kuò)增效率而優(yōu)化所使用的濃度來確定。例如，寡脫氧核苷酸或抑制性寡核苷酸的濃度可以是用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物濃度的0.1至10倍。

171、如上所述，本發(fā)明提供了一種用于優(yōu)先擴(kuò)增靶核酸的方法。所述方法可以進(jìn)一步包括檢測擴(kuò)增的靶dna的步驟。在下文中，可將本發(fā)明的這一方面稱為“本發(fā)明的用于檢測核酸的方法”。例如，根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，其中dna用作待檢測的靶標(biāo)，即使當(dāng)不是待檢測靶標(biāo)的dna(具有特定核苷酸序列的dna)相對于作為待檢測靶標(biāo)的dna(靶標(biāo)dna)而言過度大量存在時，憑借本發(fā)明的用于抑制具有特定核苷酸序列的核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增的方法中的寡核苷酸或抑制性寡核苷酸以及具有錯配核酸內(nèi)切酶活性的多肽，抑制具有非靶標(biāo)dna作為模板的擴(kuò)增，并且由此可以檢測所述待檢測的靶dna。

172、本發(fā)明的抑制核酸擴(kuò)增的方法可以在上述酸性高分子物質(zhì)的存在下進(jìn)行。酸性高分子物質(zhì)在含有少量核酸的樣品中發(fā)揮更大的作用。酸性高分子物質(zhì)的優(yōu)選實例如用于選擇性切割本發(fā)明的非靶核酸的方法的上文所述。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步與上述增殖細(xì)胞核抗原(pcna)或其突變體組合進(jìn)行。

173、9.本發(fā)明的用于檢測核酸的方法

174、本發(fā)明的用于檢測核酸的方法包括通過上述第8部分所述的本發(fā)明的抑制核酸擴(kuò)增方法抑制非靶核酸的擴(kuò)增，并由此優(yōu)選擴(kuò)增靶核酸的步驟，以及檢測擴(kuò)增的靶核酸的步驟。本發(fā)明的用于檢測核酸的方法能夠區(qū)別地檢測例如與已知基因中存在突變的基因?qū)?yīng)的核酸的野生型和突變型。當(dāng)使用包含野生型核苷酸序列的dna作為具有特定核苷酸序列的核酸(非靶核酸)進(jìn)行本發(fā)明的檢測方法時，可以在存在的過度大量正常等位基因(即，具有野生型核苷酸序列的dna)的情況下，檢測少量的突變等位基因。例如，本發(fā)明的方法可用于檢測循環(huán)腫瘤dna，或檢測母體血液中含有的少量胎兒dna序列。突變的實例包括微缺失和點突變。由點突變產(chǎn)生的多態(tài)性稱為單核苷酸多態(tài)性(snp)。如本文所用，在snp中具有突變核苷酸序列的dna有時被稱為具有單核苷酸多態(tài)性突變的dna。

175、少量的突變等位基因的優(yōu)選實例包括但不限于含有至少一種單核苷酸多態(tài)性的核酸，所述單核苷酸多態(tài)性選自用作腫瘤標(biāo)志物的單核苷酸多態(tài)性突變、與用于癌癥治療的藥劑的治療效果相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性突變，以及已知與細(xì)胞癌變相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性突變。snp的實例包括經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的那些，以及已知與用于治療癌癥的藥劑的治療效果或致癌作用相關(guān)的那些。此類snp的實例包括k-ras基因、b-raf基因和表皮生長因子受體(egfr)基因的snp。k-ras基因中的體細(xì)胞突變常見于結(jié)直腸癌、肺腺癌、甲狀腺癌等。b-raf基因中的體細(xì)胞突變常見于結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、乳頭狀甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌等。egfr基因中的體細(xì)胞突變常見于各種實體瘤。已知當(dāng)癌組織中的egfr基因具有特定的單核苷酸多態(tài)性突變時，使用egfr抑制劑，諸如吉非替尼或厄洛替尼，治療癌癥很可能是有效的。相反，已知當(dāng)癌組織中的k-ras基因具有單核苷酸多態(tài)性突變時，癌癥可能對egfr抑制劑是抗性的。

176、本發(fā)明的檢測方法可以使用在以亞硫酸氫鹽處理如下的組合物后獲得的dna作為原料進(jìn)行，所述組合物含有從來自生物體的樣品提取的甲基化dna。根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，可以在存在過度大量的非甲基化等位基因的情況下進(jìn)行少量的甲基化等位基因的檢測，或在存在過度大量的甲基化等位基因的情況下進(jìn)行少量的非甲基化等位基因的檢測。

177、作為使用亞硫酸氫鹽的處理，可以使用已知的用于檢測甲基化dna的亞硫酸氫鹽法。通過處理，非甲基化胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃ谆奏]有變化。當(dāng)用亞硫酸氫鹽處理的反應(yīng)溶液進(jìn)行pcr擴(kuò)增時，尿嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?，并且甲基化胞嘧啶變?yōu)榘奏?。換言之，在特定位點存在過度大量的非甲基化等位基因的情況下檢測少量的甲基化等位基因，以及在存在過度大量的甲基化等位基因的情況下檢測少量的非甲基化等位基因，分別對應(yīng)于在存在過度大量的胸腺嘧啶的情況下檢查胞嘧啶的存在，以及在存在過度大量的胞嘧啶的情況下檢查胸腺嘧啶的存在。當(dāng)過度大量的含有胸腺嘧啶或胞嘧啶的dna的擴(kuò)增被抑制時，容易檢查少量的甲基化等位基因或非甲基化等位基因的存在。

178、對于本發(fā)明的檢測方法中的檢測靶核酸的步驟，可以使用電泳、核苷酸序列分析或使用探針(如循環(huán)探針或taqman探針)的實時pcr。對于這些檢測方法，可以直接使用常規(guī)技術(shù)。具體地，高分辨率解鏈(hrm)分析方法的應(yīng)用允許通過一個步驟擴(kuò)增和檢測感興趣的dna，并且由此實現(xiàn)對感興趣的dna的快速且簡單的檢查。

179、本發(fā)明的用于檢測核酸的方法可以在上述酸性高分子物質(zhì)的存在下進(jìn)行。酸性高分子物質(zhì)在含有少量核酸的樣品中發(fā)揮更大的作用。酸性高分子物質(zhì)的優(yōu)選實例如用于選擇性切割本發(fā)明的非靶核酸的方法的上文所述。本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步與上述增殖細(xì)胞核抗原(pcna)或其突變體組合進(jìn)行。

180、實施例

181、在下文中，將參考實施例具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限于這些實施例。

182、實驗方法1：

183、(1-1)錯配核酸內(nèi)切酶突變體的制備

184、編碼來自激烈熱球菌的多肽pf_r00065的基因的核苷酸序列(refseq?id:wp_11011124.1，seq?id?no:1)顯示在seq?id?no:16中?；谏鲜龊塑账嵝蛄?，通過常規(guī)方法，將突變引入特定位置以制備人工基因。使用in-fusion(注冊商標(biāo))hd克隆試劑盒(由takarabio?usa制造)，將由此獲得的人工基因引入質(zhì)粒pet6xhn-c(由takara?bio?usa制造)。由此獲得的質(zhì)粒具有編碼錯配核酸內(nèi)切酶突變體的核苷酸序列，和添加至c末端側(cè)的組氨酸標(biāo)簽。

185、然后，使用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21?de3菌株(由takara?bio?inc.制造)，并在含有100μg/ml氨芐青霉素的1.5％瓊脂糖lb平板上于37℃培養(yǎng)過夜。從平板選出3個單菌落，接種于含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基(以下稱為lb-ap培養(yǎng)基)中，并在37℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后，將300μl培養(yǎng)物接種到6ml?lb-ap培養(yǎng)基中，并在37℃振蕩培養(yǎng)過夜。當(dāng)od600值達(dá)到0.6時，將iptg以1mm的終濃度添加到培養(yǎng)物中，然后，在25℃進(jìn)一步孵育4小時以誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。然后，當(dāng)od600值達(dá)到4時，收集細(xì)菌細(xì)胞。

186、將由此獲得的細(xì)菌細(xì)胞懸浮在400μl含有50mm?tris-hcl(ph?7.5)、300mm?nacl、5％甘油和0.15％?triton?x-100的溶液(以下稱為緩沖液s)中，并使用超聲波儀(由sonic&materials制造)在4℃進(jìn)行三次30秒超聲波處理。由此，懸浮液變得透明。超聲波處理后，將懸浮液在4℃以11000x?g離心10分鐘，并收集上清液。將由此獲得的粗提取物進(jìn)行ni樹脂純化。

187、ni樹脂的純化如下進(jìn)行。具體而言，將50μl?ni-nta瓊脂糖(由qiagen制造)置于1.5ml管中，用250μl無菌蒸餾水洗滌兩次，且然后用250μl的緩沖液a(50mm?tris-hcl?ph7.5、300mm?nacl、5％甘油和5mm咪唑)平衡兩次。將平衡的ni-nta瓊脂糖懸浮在400μl粗提物中，且允許其靜置30分鐘。然后，將懸浮液在4℃下以12000rpm離心10分鐘。除去上清液后，將ni-nta瓊脂糖用100μl緩沖液a洗滌3次。然后，用100μl緩沖液b(50mm?tris-hcl?ph7.5，300mm?nacl、5％甘油和300mm咪唑)，從ni-nta瓊脂糖上洗脫吸附物。將由此獲得的洗脫液作為錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液用于如下的實驗中。

188、(1-2)異二聚體型錯配核酸內(nèi)切酶突變體的制備

189、基于編碼(1-1)中制備的突變體的基因，制備編碼異二聚體型錯配核酸內(nèi)切酶突變體的基因。以與(1-1)相同的方式，通過將編碼gg特異性錯配核酸內(nèi)切酶突變體的基因與編碼tt特異性錯配核酸內(nèi)切酶突變體的基因經(jīng)由接頭(seq?id?no:35)串聯(lián)連接，來制備人工基因。

190、(2)錯配核酸內(nèi)切酶突變體的底物特異性評價(2-1)核酸

191、通過已知方法化學(xué)合成nucs-模板-t(seq?id?no:31)、nucs-模板-g(seq?id?no:32)、nucs-探針-t(seq?id?no:33)，和nucs-探針-g(seq?id?no:34)，作為核酸形成底物的雙鏈dna。使用由模板和探針的組合構(gòu)成的雙鏈dna作為底物。分別向兩個探針的5'端和3'端加入fam和eclipse(注冊商標(biāo))暗猝滅劑。

192、(2-2)切割特異性

193、通過混合2.5μl的10x緩沖液、1μl的25μm模板、1.5μl的5μm探針、5μl的錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液和15μl的無菌水，制備總共25μl的混合物。使用熱循環(huán)儀，將55℃60秒的一個循環(huán)重復(fù)60個循環(huán)?；蛘?，使用熱循環(huán)儀，將55℃15秒的一個循環(huán)重復(fù)60個循環(huán)。所述10x緩沖液的組成為500mm?tris-hcl(ph?9.2)、140mm(nh4)2so4、100mm?kcl、25mm?mgcl2和0.1％?bsa。用于酶稀釋的緩沖液的組成為25mm?tris-hcl(ph?8.0)、50mm?kcl、0.1mm?dtt、0.01％明膠、0.5％?nonidet?p-40、0.5％吐溫-20和0.09％?bsa。

194、實施例1：錯配核酸內(nèi)切酶突變體的制備

195、(1)錯配核酸內(nèi)切酶突變體s47k+n76d

196、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第47位的絲氨酸和第76位的天冬酰胺分別被替換為賴氨酸和天冬氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:6和seq?id?no:21中。

197、(2)錯配核酸內(nèi)切酶突變體s47r+n76d+l123a

198、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第47位的絲氨酸、第76位的天冬酰胺和第123位的亮氨酸分別被替換為精氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?id?no:7和seq?id?no:22中。

199、(3)錯配核酸內(nèi)切酶突變體s47r+n76d+l123g

200、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第47位的絲氨酸、第76位的天冬酰胺和第123位的亮氨酸分別被替換為精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?id?no:8和seq?id?no:23中。

201、(4)錯配核酸內(nèi)切酶突變體q78r+l123s

202、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第78位的谷氨酰胺和第123位的亮氨酸分別被替換為精氨酸和絲氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:9和seq?id?no:24中。

203、(5)錯配核酸內(nèi)切酶突變體q78r+l123t

204、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第78位的谷氨酰胺和第123位的亮氨酸分別被替換為精氨酸和蘇氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:10和seq?id?no:25中。

205、(6)錯配核酸內(nèi)切酶突變體q78r+l123m

206、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第78位的谷氨酰胺和第123位的亮氨酸分別被替換為精氨酸和甲硫氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:11和seq?id?no:26中。

207、(7)錯配核酸內(nèi)切酶突變體q78r+l123c

208、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第78位的谷氨酰胺和第123位的亮氨酸分別被替換為精氨酸和半胱氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:12和seq?id?no:27中。

209、(8)錯配核酸內(nèi)切酶突變體q78r+l125v

210、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第78位的谷氨酰胺和第125位的亮氨酸分別被替換為精氨酸和纈氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:13和seq?id?no:28中。

211、(9)錯配核酸內(nèi)切酶突變體q78r+l125a

212、根據(jù)實驗方法1(1-1)，制備編碼突變蛋白的人工基因，其中來自激烈熱球菌的多肽pf_rs00065的第78位的谷氨酰胺和第125位的亮氨酸分別被替換為精氨酸和丙氨酸，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seq?idno:14和seq?id?no:29中。

213、(10)異二聚體型錯配核酸內(nèi)切酶突變體

214、根據(jù)實驗方法1(1-2)，制備能夠經(jīng)由接頭(seq?id?no:35)表達(dá)作為單一多肽的突變體1(s47r+n76d+l123a；seq?id?no:7)和突變體2(q78r+l123m；seq?id?no:11)的人工基因，以制備錯配核酸內(nèi)切酶突變體溶液。突變蛋白的氨基酸序列和核酸序列分別顯示在seqid?no:15和seq?id?no:30中。

215、實施例2：錯配核酸內(nèi)切酶突變體的底物特異性評估

216、使用實施例1(1)-(9)中制備的錯配核酸內(nèi)切酶突變體，和野生型錯配核酸內(nèi)切酶(pfunucs)及其突變體w77f，根據(jù)實驗方法1(2)進(jìn)行底物特異性評價。結(jié)果顯示在表2中。

217、[表2]

218、 突變體名稱 底物特異性 gg-特異性/tt-特異性 無突變(野生型) tt,gg,tg - w77f gg>tg>>tt - s47k+n76d gg gg-特異性 s47r+n76d+l123a gg gg-特異性 s47r+n76d+l123g gg gg-特異性 q78r+l123s tt tt-特異性 q78r+l123t tt tt-特異性 q78r+l123m tt tt-特異性 q78r+l123c tt tt-特異性 q78r+l125v tt tt-特異性 q78r+l125a tt tt-特異性

219、。

220、如表2中所示，獲得了底物特異性與野生型錯配核酸內(nèi)切酶不同的gg特異性錯配核酸內(nèi)切酶突變體和tt特異性錯配核酸內(nèi)切酶突變體。

221、實施例3：異二聚體型錯配核酸內(nèi)切酶突變體的底物特異性評價使用實施例1(10)中制備的異二聚體型錯配核酸內(nèi)切酶突變體，根據(jù)實驗方法1(2)進(jìn)行底物特異性評價。

222、結(jié)果，所述異二聚體型錯配核酸內(nèi)切酶突變體顯示出gt/tg錯配特異性底物特異性，所述底物特異性不同于野生型錯配核酸內(nèi)切酶的底物特異性，并且不同于實施例1(1)至(9)中制備的錯配核酸內(nèi)切酶突變體的底物特異性。

223、工業(yè)適用性

224、本發(fā)明可用于包括遺傳技術(shù)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域在內(nèi)的廣泛領(lǐng)域。

225、序列表自由文本

226、seq?id?no:1：來自激烈熱球菌的錯配核酸內(nèi)切酶pf0012的氨基酸序列

227、seq?id?no:2：錯配核酸內(nèi)切酶pf0012?w77f變體的氨基酸序列

228、seq?id?no:3：來自thermococcus?barophilus的錯配核酸內(nèi)切酶termp_01877的氨基酸序列

229、seq?id?no:4：來自詹氏甲烷球菌的錯配核酸內(nèi)切酶mj_0225的氨基酸序列

230、seq?id?no:5：來自thermococcus?kodakarensis的錯配核酸內(nèi)切酶tko?nucs的氨基酸序列seq?id?no:6：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體s47k+n76d的氨基酸序列

231、seq?id?no:7：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體s47r+n76d+l123a的氨基酸序列

232、seq?id?no:8：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體s47r+n76d+l123g的氨基酸序列

233、seq?id?no:9：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123s的氨基酸序列

234、seq?id?no:10：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123t的氨基酸序列

235、seq?id?no:11：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123m的氨基酸序列

236、seq?id?no:12：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123c的氨基酸序列

237、seq?id?no:13：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l125v的氨基酸序列

238、seq?id?no:14：來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l125a的氨基酸序列

239、seq?id?no:15：來自變體s47r+n76d+l123a和變體q78r+l123m的錯配核酸內(nèi)切酶變體異二聚體的氨基酸序列

240、seq?id?no:16：編碼來自激烈熱球菌的錯配核酸內(nèi)切酶pf0012的基因的核酸序列

241、seq?id?no:17：編碼錯配核酸內(nèi)切酶pf0012?w77f變體的基因的核酸序列

242、seq?id?no:18：編碼來自thermococcus?barophilus的錯配核酸內(nèi)切酶termp_01877的基因的核酸序列

243、seq?id?no:19：編碼來自詹氏甲烷球菌的錯配核酸內(nèi)切酶mj_0225的基因的核酸序列

244、seq?id?no:20：編碼來自thermococcus?kodakarensis的錯配核酸內(nèi)切酶tkonucs的基因的核酸序列

245、seq?id?no:21：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體s47k+n76d的基因的核酸序列seq?id?no:22：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體s47r+n76d+l123a的基因的核酸序列

246、seq?id?no:23：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體s47r+n76d+l123g的基因的核酸序列

247、seq?id?no:24：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123s的基因的核酸序列seq?id?no:25：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123t的基因的核酸序列seq?id?no:26：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123m的基因的核酸序列seqid?no:27：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l123c的基因的核酸序列seq?idno:28：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l125v的基因的核酸序列seq?id?no:29：編碼來自pf0012的錯配核酸內(nèi)切酶變體q78r+l125a的基因的核酸序列seq?id?no:30：編碼來自變體s47r+n76d+l123a和變體q78r+l123m的錯配核酸內(nèi)切酶變體異二聚體的基因的核酸序列

248、seq?id?no:31：合成的寡核苷酸“nucs-模板-t”

249、seq?id?no:32：合成的寡核苷酸“nucs-模板-g”

250、seq?id?no:33：合成的寡核苷酸“nucs-探針-t”。5'端用fam標(biāo)記且3'端用eclipse標(biāo)記。seq?id?no:34：合成的寡核苷酸“nucs-探針-g”。5'端用fam標(biāo)記且3'端用eclipse標(biāo)記。

251、seq?id?no:35：接頭的氨基酸序列

252、seq?id?no:36：編碼接頭的核酸序列。