本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種基于一碳單位供應(yīng)的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法，以及所述高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌在微生物發(fā)酵制備d-泛酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、泛酸，也稱為維生素b5，是輔酶a的組成成分之一，在能量代謝以及檸檬酸循環(huán)等重要生化反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。因此，作為一種重要的維生素及前體物質(zhì)，d-泛酸在飼料、醫(yī)藥以及化妝品等方面得到廣泛應(yīng)用。在已知的d-泛酸合成方法中，生物發(fā)酵法生產(chǎn)d-泛酸具有底物廉價、易分離、毒性小等優(yōu)勢而受到關(guān)注。但目前利用生物法生產(chǎn)d-泛酸仍存在缺陷，例如發(fā)酵過程不穩(wěn)定、產(chǎn)量不高等問題。因此，構(gòu)建一株更高產(chǎn)的d-泛酸菌株仍是一大挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵合成d-泛酸產(chǎn)量不高的技術(shù)問題，本發(fā)明運(yùn)用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在底盤菌基因組中強(qiáng)化甘氨酸裂解系統(tǒng)與葉酸合成途徑，對絲氨酸路徑進(jìn)行調(diào)控并強(qiáng)化泛解酸合成路徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，得到一株高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌，并將該基因工程菌應(yīng)用于微生物發(fā)酵制備d-泛酸中。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：基于一碳單位供應(yīng)的一種高產(chǎn)d-泛酸基因工程菌的構(gòu)建方法，所述方法包括：運(yùn)用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在底盤菌基因組中：過表達(dá)gcvthp基因；強(qiáng)化folp基因；整合sera與glya基因簇并在seraglya基因簇后增加一分子panb基因拷貝，所述seraglya基因簇受動態(tài)調(diào)控元件調(diào)控；增加異源密碼子優(yōu)化的alss基因，制得高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。

3、本發(fā)明在底盤菌zjutdpap2(e.coli?w3110,trc-ecilvd*/bspanba*/cgpanc*/alss*/bspanb*/nacgtg/δp345ptsh/gltagtg/gltattg/trc-ppfkb，已在cn116590209a中公開)的基礎(chǔ)上，綜合運(yùn)用系統(tǒng)代謝工程策略，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，將gcvthp基因原位啟動子替換為ptrc啟動子，以此消除了gcva、purr基因?qū)cvthp基因的轉(zhuǎn)錄抑制，強(qiáng)化了甘氨酸裂解系統(tǒng)，并加強(qiáng)了大腸桿菌生物體內(nèi)一碳輔因子供應(yīng)，進(jìn)一步使碳通量流向d-泛酸的合成。在此基礎(chǔ)上，為繼續(xù)增強(qiáng)碳通量流向d-泛酸的合成，本發(fā)明還對thf合成途徑相關(guān)基因進(jìn)行強(qiáng)化。一方面是通過在lafu假基因位點增加一分子folp基因拷貝來增強(qiáng)葉酸的合成，為一碳單位提供甲基載體。另一方面利用apt2#82甘氨酸核糖體開關(guān)根據(jù)胞內(nèi)甘氨酸濃度實時控制seraglya基因簇的表達(dá)，實現(xiàn)了對絲氨酸路徑關(guān)鍵基因的適度強(qiáng)化，以合理地調(diào)控絲氨酸合成速率。同時，為響應(yīng)甲基的供應(yīng)，在seraglya基因簇后又增加了受ppanb啟動子調(diào)控的panb基因拷貝數(shù)。最后，通過引入異源密碼子優(yōu)化的alss改善基因工程菌的表達(dá)效率，增加d-泛酸的產(chǎn)量，最終得到一株無質(zhì)粒、無抗生素添加用于高產(chǎn)d-泛酸的工程菌株。

4、表1.基因編輯所涉及的基因及相應(yīng)途徑

5、

6、作為優(yōu)選，所述過表達(dá)gcvthp基因的方法包括：將gcvthp基因原位啟動子替換為ptrc啟動子。通過強(qiáng)啟動子激活甘氨酸裂解系統(tǒng)，可以消除gcva與purr對一碳單位供應(yīng)的影響，為d-泛解酸路徑提供了5,10-亞甲基四氫葉酸，可有效增加d-泛酸的合成。

7、作為優(yōu)選，所述強(qiáng)化folp基因的方法包括：在lafu假基因位點增加一分子folp基因拷貝。過表達(dá)folp基因可進(jìn)一步促進(jìn)paba與gtp途徑的結(jié)合，是加強(qiáng)葉酸合成為一碳單位提供甲基載體的有效策略。

8、作為優(yōu)選，所述動態(tài)調(diào)控元件為核糖體開關(guān)apt2#82。核糖體開關(guān)apt2#82可根據(jù)胞內(nèi)甘氨酸濃度來控制sera及glya過表達(dá)。當(dāng)甘氨酸積累到一定程度時，會折疊覆蓋住核糖體位點，阻遏基因簇seraglya的翻譯；當(dāng)甘氨酸胞內(nèi)含量較少時，會暴露出核糖體位點強(qiáng)化翻譯。利用核糖體開關(guān)實時控制glya的表達(dá)，可以實現(xiàn)對絲氨酸路徑關(guān)鍵基因的適度強(qiáng)化。該策略能夠合理地調(diào)控絲氨酸合成速率，使胞內(nèi)甘氨酸維持在較低水平，有效促進(jìn)d-泛酸的合成。

9、作為優(yōu)選，所述panb基因受ppanb啟動子調(diào)控。在seraglya基因簇后再增加一分子panb基因拷貝，可更好地響應(yīng)甲基供應(yīng)，促進(jìn)d-泛酸的合成。

10、作為優(yōu)選，所述alss基因來源于枯草芽孢桿菌并經(jīng)過密碼子優(yōu)化。乙酰乳酸合酶(acetolactate?synthase，alss)催化兩分子丙酮酸形成α-乙酰乳酸，乙酰乳酸合酶參與了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成。通過在基因組上引入異源alss基因，并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可以改善基因在宿主中的表達(dá)效率，并且對菌株負(fù)擔(dān)較小，在不添加丙酮酸的前提下，促進(jìn)搖瓶中d-泛酸產(chǎn)量的提升。

11、作為優(yōu)選，所述底盤菌為：e.coli?w3110,trc-ecilvd*/bspanba*/cgpanc*/alss*/bspanb*/nacgtg/δp345ptsh/gltagtg/gltattg/trc-ppfkb，記為dpah2。

12、作為優(yōu)選，受ptrc啟動子調(diào)控的gcvthp基因、folp基因、alss基因核苷酸序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3所示；受apt2#82核糖體開關(guān)調(diào)控的seraglya基因簇序列如seq?id?no.4所示；受ppanb啟動子調(diào)控的panb基因核苷酸序列如seq.id.no.5所示。

13、更具體地，所述高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：

14、(1)以工程菌dpap2為出發(fā)菌株并將其命名為h2，運(yùn)用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在其基因組中將gcvthp基因的原位啟動子替換為trc啟動子，刪除轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，得到工程菌dpah3?derivative，trc-gcvthp，記為工程菌dpah3；

15、(2)以工程菌dpah3為出發(fā)菌株，運(yùn)用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在lafu假基因位點增加一分子folp基因拷貝，得到工程菌dpah6?derivative，lafu::folp，記為工程菌dpah6；

16、(3)以工程菌dpah6為出發(fā)菌株，運(yùn)用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組上整合sera與glya基因簇，在基因簇后再增加一分子panb基因拷貝，得到工程菌dpah7derivative，yeep::trc-apt2#82-seraglya-ppanb-panb，記為工程菌dpah7；

17、(4)以工程菌dpah7為出發(fā)菌株，運(yùn)用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組中通過基因敲入方式增加受啟動子ptrc調(diào)控的枯草芽孢桿菌alss基因拷貝數(shù)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到工程菌dpah8?derivative，gapc::trc-alss*，記為工程菌dpah8，即所述的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。

18、本發(fā)明還提供了通過上述任一方法構(gòu)建得到的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。通過上述方法，本發(fā)明構(gòu)建得到了一株發(fā)酵過程中無質(zhì)粒、無抗生素添加的工程菌e.coli?w3110,trc-ecilvd*/bspanba*/cgpanc*/alss*/bspanb*/nacgtg/δp345ptsh/gltagtg/gltattg/trc-ppfkb/trc-gcvthp/lafu::folp/yeep::trc-apt2#82-seraglya-ppanb-panb/gapc::trc-alss*，該菌株搖瓶效價達(dá)到6.85g/l，相比出發(fā)菌株提高了31.7％，最終運(yùn)用5-l發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵92小時，d-泛酸產(chǎn)量能夠達(dá)到112.6g/l，大幅度提高d-泛酸的合成，縮短了發(fā)酵周期。

19、本發(fā)明還提供了所述的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌在微生物發(fā)酵制備d-泛酸中的應(yīng)用。

20、作為優(yōu)選，所述應(yīng)用的方法包括：將所述高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～37℃、300～450rpm、ph?6.7～6.9、溶氧10％～30％條件下進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)72～96h，發(fā)酵結(jié)束后分離純化得到所述d-泛酸。

21、作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖10～30g/l、硫酸銨10～25g/l、無水甜菜堿1～5g/l、酵母粉1～5g/l、磷酸二氫鉀1～5g/l、無水硫酸鎂0.5～2g/l、β-丙氨酸1～5g/l，1～5ml/l微量元素溶液，溶劑為去離子水，ph值自然；微量元素溶液組成為：10g/lcucl2、10g/l?feso4·7h2o、10g/lznso4·7h2o、0.2g/l?cuso4、0.02g/lnicl2·7h2o，溶劑為去離子水。

22、作為優(yōu)選，所述應(yīng)用的方法包括：在5l發(fā)酵罐中裝入體積為1～3l發(fā)酵培養(yǎng)基，115℃滅菌30min，將所述基因工程菌菌株接種至1～3l發(fā)酵培養(yǎng)基中，28～37℃、初始通氣量3～6l/min、初始攪拌速度300～450rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，氨水調(diào)節(jié)ph，同時添加終濃度為0.1～0.4mm的iptg，終濃度為5mg/lvb1、2mg/lvb12，以及10～40g/l異亮氨酸5～10ml；發(fā)酵過程中使用溶氧串聯(lián)轉(zhuǎn)速將溶氧維持10％～30％，用氨水作中和劑維持ph?6.7～6.9，通過ph聯(lián)動補(bǔ)料將補(bǔ)料培養(yǎng)基加入罐內(nèi)，葡萄糖濃度控制在5g/l以下，28～37℃培養(yǎng)72～96小時，得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液上清分離純化得到所述d-泛酸。其中，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖500g/l、硫酸銨5～25g/l、無水甜菜堿2～8g/l、酵母粉1～5g/l、磷酸二氫鉀10～20g/l、無水硫酸鎂5～15g/l、β-丙氨酸40～100g/l，1～5ml/l微量元素溶液，溶劑為去離子水，ph值自然。

23、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明運(yùn)用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在現(xiàn)有工程菌的基礎(chǔ)上強(qiáng)化了甘氨酸裂解系統(tǒng)與葉酸合成途徑，為泛解酸合成路徑提供一碳單位、豐富甲基載體。另一方面利用apt2#82甘氨酸核糖體開關(guān)精細(xì)控制絲氨酸及甘氨酸合成速率，并進(jìn)一步強(qiáng)化了d-泛解酸生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，為整個反應(yīng)體系持續(xù)供應(yīng)甲基。得到了一株無質(zhì)粒且發(fā)酵過程中無需添加抗生素的高產(chǎn)菌株；本發(fā)明菌株搖瓶效價達(dá)到6.85g/l，相比出發(fā)菌株提高了31.7％，最終運(yùn)用5l發(fā)酵罐發(fā)酵92小時，d-泛酸產(chǎn)量能夠達(dá)到112.6g/l，大幅度提高d-泛酸的合成，縮短了發(fā)酵周期。