本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種基于正電荷吸附分離外泌體的方法。
背景技術(shù)：
外泌體屬于細(xì)胞外囊泡的一種，尺寸約為30-150nm，在多種生物狀態(tài)與疾病中發(fā)揮著重要的生理病理學(xué)功能。外泌體結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，由磷脂雙分子層構(gòu)成，厚度約為5nm，成分主要包含神經(jīng)酰胺、膽固醇、鞘脂以及含有長(zhǎng)飽和脂肪鏈的甘油磷脂。外泌體表面及內(nèi)部富含各種蛋白質(zhì)，并且含有多重核酸等重要的生物大分子物質(zhì)，這些生物大分子物質(zhì)可以被用來(lái)檢測(cè)反映包括腫瘤在內(nèi)等疾病的狀態(tài)。近些年研究表明外泌體可以作為分泌母細(xì)胞生物信息指紋，激起了研究人員的極大興趣。雖然人們還沒(méi)有完全理解外泌體的生物學(xué)功能，但是越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，外泌體在細(xì)胞間通訊、抗原呈遞以及蛋白質(zhì)核酸物質(zhì)交換等起到重要的作用。特別是外泌體參與的細(xì)胞通訊方面尤為重要，外泌體通過(guò)參與細(xì)胞間免疫信號(hào)、血管生成、增值和分化等功能，直接影響了諸如癌癥、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)表明，外泌體直接參與了腫瘤的發(fā)生，包括血管生成，免疫抑制，轉(zhuǎn)移等。因此可以通過(guò)對(duì)外泌體內(nèi)容物的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)或者無(wú)創(chuàng)的疾病生物靶標(biāo)信號(hào)的早期診斷及預(yù)后評(píng)估等。綜上，怎樣能夠分離定量得到外泌體成為對(duì)其研究和臨床應(yīng)用的首要面臨問(wèn)題。
目前的外泌體分離主要有超速離心、過(guò)濾、免疫親和抓取以及peg沉淀等五種方法。這些分離技術(shù)主要根據(jù)外泌體自身所具有的物理和生物學(xué)特點(diǎn)發(fā)展而來(lái)。雖然這些分離方法為研究外泌體提供了極大的方便，但是也都存在較為明顯的缺點(diǎn)。超速離心法是目前分離外泌體最常用的方法，可以簡(jiǎn)單方便的根據(jù)樣品的尺寸大小對(duì)樣品進(jìn)行分離。超速離心法的缺點(diǎn)是，超速離心機(jī)和耗材價(jià)格昂貴，不適合大范圍應(yīng)用推廣，并且得到的外泌體中含有大量的蛋白質(zhì)污染，另外由于離心過(guò)程中離心力的作用，也會(huì)造成外泌體的破裂。過(guò)濾法通常分為兩種，一種是濾膜過(guò)濾，一種是體積排阻法。濾膜過(guò)濾法雖然已經(jīng)有產(chǎn)品推出，但分離的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)堵塞膜孔，外泌體破裂等一系列問(wèn)題。體積排阻法則需要專門的儀器，并且極其耗時(shí)。免疫親和抓取的方法雖然可以獲得較高純度的外泌體，但是所用抗體價(jià)格較貴，抓取效率不高，也不適合大量的應(yīng)用。peg沉淀法是目前成本最低，步驟最簡(jiǎn)單的分離外泌體的方法，但是問(wèn)題也較多，例如沉淀時(shí)間較長(zhǎng)，往往需要過(guò)夜，沉淀中雜質(zhì)較多，沉淀后如果需要進(jìn)一步得到較為純凈的外泌體，仍然需要其他實(shí)驗(yàn)方法的配合，例如采用超速離心法進(jìn)一步的純化等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于正電荷吸附外泌體的方法。
本發(fā)明利用硅烷化試劑(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)，通過(guò)硅烷化反應(yīng)，對(duì)玻璃器皿進(jìn)行正電荷修飾。當(dāng)加入帶有外泌體的樣品時(shí)，帶有負(fù)電菏的外泌體會(huì)通過(guò)靜電力相互作用與修飾有正電荷的玻璃皿結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的抓取。抓取后利用緩沖液pbs進(jìn)行沖洗，可以去除其他雜質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體介紹如下。
一種基于正電荷吸附分離外泌體的方法，其首先利用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷aptes和玻璃器皿表面發(fā)生硅烷化反應(yīng)，對(duì)玻璃器皿表面進(jìn)行正電荷修飾；然后向修飾有正電荷的玻璃器皿中加入帶有外泌體的樣品，實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的抓??；最后利用緩沖液pbs對(duì)玻璃器皿表面進(jìn)行沖洗，得到吸附于玻璃器皿表面的純外泌體，實(shí)現(xiàn)外泌體分離的目的。
本發(fā)明中，玻璃器皿是玻璃瓶或玻璃皿。
本發(fā)明中，帶有外泌體的樣品為血液、唾液或尿液。
本發(fā)明中，基于正電荷吸附分離外泌體的方法，具體包括以下步驟：
(1)將(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷aptes溶解到無(wú)水乙醇中配成體積百分比為4～20％的表面修飾液；
(2)將上述表面修飾液加入到清潔后的玻璃器皿中，避光，室溫孵育5～10分鐘；去除表面修飾液，用大量純水沖洗，去除沒(méi)有結(jié)合的aptes；清洗后晾干備用；
(3)在步驟(2)的晾干后玻璃器皿中加入帶有外泌體的樣品，在37℃的溫度下?lián)u床孵育5～10分鐘，孵育結(jié)束后，pbs沖洗，得到吸附于玻璃器皿表面的純外泌體，實(shí)現(xiàn)外泌體分離的目的。
本發(fā)明中，步驟(2)中，玻璃器皿是玻璃瓶時(shí)，表面修飾液的加入量是玻璃瓶體積的2/3以上；玻璃器皿是玻璃皿時(shí)，表面修飾液的加入量至少覆蓋玻璃皿的底部。
和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明方法可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成對(duì)外泌體的抓取分離，所用試劑aptes價(jià)格便宜，分離效率較高；
本發(fā)明方法允許各種后續(xù)分子分析，包括elisa，westernblot，基因組的提取，鑒定，擴(kuò)增和測(cè)序。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明用aptes進(jìn)行外泌體分離的原理示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)闡述。
圖1是本發(fā)明用aptes進(jìn)行外泌體分離的原理示意圖。
實(shí)施例1
1、2ml玻璃瓶等離子清洗機(jī)清洗2分鐘，清潔表面。
2、aptes溶解到無(wú)水乙醇溶液中(需要現(xiàn)用現(xiàn)配)配成表面修飾液，濃度為4％(v/v)。加入到清潔后的者玻璃瓶中。玻璃瓶加入三分之二以上。
3、避光，室溫孵育5分鐘。去除表面修飾液，用大量純水沖洗，去除沒(méi)有結(jié)合的aptes。清洗后晾干備用。
4、取1.5ml全血，4℃下2500g離心2分鐘，取出上層血漿備用。
5、取800μl血漿，加入到玻璃瓶中，37℃搖床孵育10分鐘。
6、去除血漿，pbs沖洗三遍。外泌體吸附于正電修飾的表面。
7、將0.1％sds溶液加入到玻璃瓶中裂解外泌體，提取裂解后溶液中核酸，利用armspcr法檢測(cè)核酸的量，結(jié)果顯示在20個(gè)循環(huán)后，熒光曲線進(jìn)入對(duì)數(shù)期，表明這種分離外泌體的方法可以得到充足的外泌體核酸物質(zhì)，并可以用于后續(xù)的其他實(shí)驗(yàn)分析。
實(shí)施例2
1、35mm玻璃皿等離子清洗機(jī)清洗2分鐘，清潔表面。
2、aptes溶解到無(wú)水乙醇溶液中(需要現(xiàn)用現(xiàn)配)配成表面修飾液，濃度為20％(v/v)。加入到清潔后玻璃皿中。玻璃皿加入三分之二以上。
3、避光，室溫孵育10分鐘。去除表面修飾液，用大量純水沖洗，去除沒(méi)有結(jié)合的aptes。清洗后晾干備用。
4、取1.5ml唾液，4℃下2500g離心2分鐘，取出上層液體備用。
5、取800μl上層液體，加入玻璃皿中，37℃搖床孵育5分鐘。
6、去除液體，pbs沖洗三遍。外泌體吸附于正電修飾的表面。
7、用10％dph無(wú)水乙醇磷脂膜熒光探針?lè)肿訉?duì)外泌體進(jìn)行染色，雖然外泌體尺寸過(guò)小，無(wú)法觀察到單個(gè)外泌體，但是可以明顯的發(fā)現(xiàn)玻璃皿上的熒光強(qiáng)度比沒(méi)有吸附外泌體的熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。說(shuō)明這種方法得到的外泌體可以進(jìn)行elisa實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例3
1、35mm玻璃皿等離子清洗機(jī)清洗2分鐘，清潔表面。
2、aptes溶解到無(wú)水乙醇溶液中(需要現(xiàn)用現(xiàn)配)配成表面修飾液，濃度為10％(v/v)。加入到清潔后玻璃皿中。玻璃皿加入三分之二以上。
3、避光，室溫孵育7分鐘。去除表面修飾液，用大量純水沖洗，去除沒(méi)有結(jié)合的aptes。清洗后晾干備用。
4、取1.5ml尿液，4℃下2500g離心2分鐘，取出上層液體備用。
5、取800μl上層液體，加入玻璃皿中，37℃搖床孵育8分鐘。
6、去除液體，pbs沖洗三遍。外泌體吸附于正電修飾的表面。
7、利用0.1％sds溶液對(duì)外泌體裂解后，提取蛋白質(zhì)。利用考馬斯亮藍(lán)法定性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有蛋白質(zhì)的存在。說(shuō)明此種方法獲得的外泌體，可用于蛋白質(zhì)分析檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。