本發(fā)明屬于天然藥物、中草藥中活性成分提取及純化領(lǐng)域。本發(fā)明從生姜中提取和純化6-姜烯酚。

背景技術(shù)：

姜是姜科植物姜的鮮嫩莖。生姜藥食兩用，能解表散熱，溫中止嘔。在《本草綱目》中有記載，生姜能夠治療“瘧疾寒熱(脾胃聚痰，發(fā)為寒熱)、寒熱痰嗽、霍亂轉(zhuǎn)筋，入腹欲死、胸脅滿痛(心胸、脅下，硬痛脹滿)、大便不通、濕熱發(fā)黃、滿口爛瘡、牙齒疼痛、中藥毒、刀斧傷、閃扭手足、跌打損傷、腋下狐臭、赤白癜風(fēng)、兩耳凍瘡、諸毒痔漏，久不結(jié)痂”。(趙文竹,張瑞雪,于志鵬,等.生姜的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[j].食品工業(yè)科技,2016,(11):383-389.)。生姜提取物廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、日化品中。6-姜烯酚是生姜中的活性成分之一，分子結(jié)構(gòu)如式ⅰ。它具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)活性。[周萍，彭詠波，李萍，6-姜烯酚抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展，中南藥學(xué)，2012，10(7)：536-537；najy，songk，leejw，kims，kwonj，pretreatmentof6-shogaolattenuatesoxidativestressandinflammationinmiddlecerebralarteryocclusion-inducedmice，europeanjournalofpharmacology，2016，788:241-247。]

現(xiàn)有技術(shù)中，6-姜烯酚的提取純化方法主要有以下幾種：

(1)將姜超臨界流體萃取物(6-姜烯酚的含量約為2.5％)與含乙醇的酸水液混合后加熱回流，再分離、精制。酸水反應(yīng)處理后提取物中6-姜烯酚的含量可達(dá)20％。[李萍；彭詠波；馬江；齊煉文；劉慧；成小蘭；一種6-姜烯酚的制備方法，申請?zhí)枺篶n200910232593.3。]

(2)姜超臨界流體萃取物或干姜提取物經(jīng)含乙醇的酸水加熱回流提取，回收乙醇，酸水液用乙酸乙酯萃取，減壓回收乙酸乙酯得到萃取后濃縮物，濃縮物過硅膠色譜柱、用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脫，收集洗脫液濃縮，即得。硅膠柱層析分離得到的姜烯酚類組合物，含量可達(dá)60～65％。[齊煉文；李萍；馬江，一種姜烯酚提取物的制備方法及其醫(yī)藥用途，申請?zhí)枺篶n201110148248.9]。

(3)從天堂椒中提取分離6-姜烯酚的方法。原料天堂椒粉碎，采用亞臨界萃取，得油浸膏；將油浸膏采用乙醇溶解，然后采用溶劑萃取，濃縮至浸膏；采用柱分離，根據(jù)薄層斑點(diǎn)，收集含有6-姜烯酚的洗脫液，濃縮，放置結(jié)晶。所獲粗品進(jìn)一步重結(jié)晶，干燥后即得6-姜烯酚。[肖紅；王曉瑩；張瑜；肖金霞；郭文華；一種天堂椒的用途及從天堂椒中提取分離6-姜烯酚的方法，cn201611104828.7].

(4)以生姜95％乙醇提取物用石油醚脫脂,乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯相過d4020型大孔吸附樹脂,依次用25％、50％、75％乙醇溶液洗脫得組分fra和frb。frb以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(12：10：15：10,v/v/v/v)為溶劑系統(tǒng),經(jīng)高速逆流色譜hsccc-d1200分離得到組分6-姜烯酚。[喬慶亮，生姜中酚類化合物的分離制備研究，碩士學(xué)位論文，浙江工商大學(xué),杭州市，2011。]

(5)干姜樣品的乙酸乙酯提取物，經(jīng)硅膠柱層析分離得到6-姜烯酚粗品，再經(jīng)高速逆流色譜分離，得到純度較好的6-姜烯酚，純度可以以¹hnmr表征結(jié)構(gòu)。[徐美霞，王曉，劉建華，耿巖玲，王岱杰，劉峰，高速逆流色譜結(jié)合硅膠柱色譜法分離制備干姜中的6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚，2013,26(2)：61-65.]

上述方法(1)和方法(2)的提取方法為超臨界流體萃取；方法(1)的分離和純化過程采用了酸水反應(yīng)，方法(2)在方法(1)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步用石油醚、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析。但這兩種方法的產(chǎn)物的純度分別是20％，和60-65％，非純品，不適合用于藥理實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)品不適于作為標(biāo)準(zhǔn)品。

上述方法(3)在柱層析的基礎(chǔ)上利用重結(jié)晶的方法純化。因6-姜烯酚的熔點(diǎn)低，室溫下易液化，重結(jié)晶的過程中難以析出固體，對后續(xù)過濾造成困擾，并且從理論上說產(chǎn)品在這一步驟中在母液中有一定的溶解度，因此損失大。上述方法(4)和方法(5)兩種方法均經(jīng)過了兩步純化。在制備中使用了高速逆流色譜，成本高，單次處理的樣品量小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從生姜中提取純化6-姜烯酚的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)提取效率不高、成本高和純度不高的問題。

解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種6-姜烯酚的提取純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)以生姜、干姜為原料，將所述原料粉碎并加入70％的乙醇中于40-55℃下浸泡提取10～23h；其中，所述原料與溶劑的質(zhì)量體積比為1g:6～15ml；

2)步驟1)浸泡完成后，紗布過濾，濾液再用布氏漏斗抽濾，除去固體殘渣；將浸提液轉(zhuǎn)入燒瓶中，搭建好減壓蒸餾裝置，開始進(jìn)行減壓蒸餾，待所述餾出液的體積為所述溶劑的70％～80％時停止減壓蒸餾，得浸提液的濃縮溶液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中；

3)向步驟2)所得的濃縮液中，加入石油醚萃取，所用石油醚與濃縮液的的體積比為1:1～1:3；石油醚萃取后的下層溶液用乙酸乙酯萃取，所述乙酸乙酯與下層溶液的體積比為1:1～1:3；萃取3次，合并上相萃取液；經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去溶劑得棕色油狀物；

4)向步驟3)所得棕色油狀物進(jìn)行硅膠柱層析；硅膠用量與棕色油狀物的質(zhì)量比為15：1～40:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為淋洗劑，其體積比為6:1～2:1，進(jìn)行梯度洗脫；以石油醚+乙酸乙酯(3:1)為展開劑，對收集的柱后淋洗液進(jìn)行薄層層析，收集rf＝0.38的組分，得粗制品；

5)對步驟4)中所得粗制品以薄層制備色譜進(jìn)一步純化；

(1)制備薄層層析硅膠板：稱取薄層層析硅膠放入研缽中，硅膠與樣品的質(zhì)量比為50:1～30:1；按照與硅膠質(zhì)量比為3:1的比例加入5‰的羧甲基纖維素鈉的水溶液，用研磨棒研磨均勻，直至沒有氣泡；將上述硅膠勻漿均勻平鋪在洗凈干燥的玻璃板上，自然晾干；于110℃下活化2小時，待冷卻后取出；

(2)純化：將粗制6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中進(jìn)行薄層展開，粗制6-姜烯酚與步驟(1)所述薄層層析硅膠板的質(zhì)量比為1:50～1:30；展開劑為石油醚：乙酸乙酯5:1～2:1。

進(jìn)一步，所述步驟1)中所述生姜原料與水的質(zhì)量體積比為1g:6～10ml；所述干姜原料與水的質(zhì)量體積比為1g:10～15ml。

進(jìn)一步，步驟4)柱層析分離中，硅膠用量與膏狀物的質(zhì)量比為20:1；以石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑為淋洗劑，依次進(jìn)行梯度洗脫，石油醚:乙酸乙酯(體積比6:1)，用量與硅膠量比為5ml:1g；石油醚:乙酸乙酯(體積比5:1)，用量與硅膠量比為2.5ml:1g，石油醚:乙酸乙酯(4:1)，用量與硅膠量比為2.5ml:1g；石油醚:乙酸乙酯(3:1)，用量與硅膠量比為3ml:1g，石油醚:乙酸乙酯(2:1)，用量與硅膠量比為2.0ml:1g。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明采用柱層析后，以硅膠薄層制備的方法進(jìn)一步純化6-姜烯酚，方法簡單，不需要儀器操作，單次處理樣品量大，目標(biāo)成分幾乎不損失，回收率高，所需的薄層制備硅膠板可以自己制作或者商品板，價格低廉。該方法所得樣品純度極高，可以作為6-姜烯酚樣品鑒別和含量測定中的標(biāo)準(zhǔn)品。

2、本發(fā)明在6-姜烯酚粗品進(jìn)一步精制純化的過程中，采用薄層色譜制備的方法，比傳統(tǒng)的重結(jié)晶方法損失小，收率高；所得6-姜烯酚產(chǎn)品可用作含姜、姜烯酚的醫(yī)藥制劑、藥理研究、化妝品、日化品等的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品。與采用高速逆流色譜的純化方法相比，該發(fā)明制備6-姜烯酚純品不需要使用儀器，單次分離量高，節(jié)約了人力、物力成本；與制備hplc精制純化的方法相比，操作簡單，材料成本低廉，節(jié)約時間，純度好。與其它提取純化方法比，該發(fā)明在純化過程中，幾乎不損失目標(biāo)成分，收率高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明6-姜烯酚的提取方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中6-姜烯酚的¹hnmr圖譜；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中6-姜烯酚的¹³cnmr圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

參見圖1，一種6-姜烯酚的提取純化方法，以生姜、干姜為原料，將所述原料粉碎采用70％乙醇，40-55℃水浴浸提。過濾藥渣后，提取液經(jīng)減壓蒸餾得濃縮液。濃縮液分別經(jīng)石油醚萃取去除雜質(zhì)、乙酸乙酯萃取6-姜烯酚成分。上述萃取液除去溶劑后，乙酸乙酯萃取部分經(jīng)硅膠柱層析，石油醚：乙酸乙酯(6:1～2:1)梯度洗脫，分離收集rf＝0.38(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)的組分，得硅膠柱層析分離6-姜烯酚粗品。6-姜烯酚粗品進(jìn)一步經(jīng)薄層制備層析分離得6-姜烯酚純品，純品經(jīng)¹hnmr和¹³cnmr表征。

具體實(shí)施例步驟如下：

1、溶劑浸提法提取生姜中的有效成分

取無損傷、無霉變、無腐爛的新鮮生姜洗凈，削去表皮，切成薄片，剁成姜末，備用。

稱取新鮮生姜末1350.0g，加入13500ml70％乙醇，55℃水浴浸提6-15h，抽濾，得黃色提取液13000ml。在t＝55℃下減壓蒸餾，將上述黃色提取液中的多數(shù)溶劑蒸出。

2、有效成分初步萃取分離

以石油醚(60-90℃)對上述生姜粗提液進(jìn)行萃取，重復(fù)三次，將萃取之后石油醚層合并，得到5000ml淡黃色液體。在t＝20℃下采用真空蒸發(fā)，將上述淡黃色液體中的多數(shù)溶劑蒸出，濃縮至約4ml移入西林瓶中，為黃色澄清透明狀液體。在西林瓶中加入無水mgso4固體(3.5g)，密封，靜止1天，過濾，用石油醚洗滌三次，將濾液合并。真空蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥，稱重，得到3.2317g淡黃色油狀物，為石油醚萃取液。

3、乙酸乙酯萃取

對上述石油醚萃取后的下層液以乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取三次，將萃取之后的乙酸乙酯層合并，得到6000ml金黃色液體。在30℃下真空蒸發(fā)蒸出溶劑，濃縮至約5ml移入西林瓶中，得到棕色溶液。在西林瓶中加入無水mgso4固體(3.0g)，密封，靜置1天，過濾，以乙酸乙酯洗滌三次，將濾液溶劑真空蒸發(fā)后，稱重，得到4.8724g深棕色液體，為乙酸乙酯萃取液。

4、硅膠柱層析分離6-姜烯酚

稱取70.0g柱層析硅膠，加入適量洗脫劑(石油醚:乙酸乙酯為6:1)，使二者混合均勻，裝柱。乙酸乙酯萃取液以石油醚:乙酸乙酯為6:1溶解樣品上樣。分別以石油醚:乙酸乙酯(6:1)(300ml)、石油醚:乙酸乙酯(5:1)(280ml)、石油醚:乙酸乙酯(4:1)(100ml)、石油醚:乙酸乙酯(3:1)(120ml)進(jìn)行洗脫。以薄層色譜(tlc)檢測洗脫液中的有效成分，合并含組分rf＝0.38(以石油醚:乙酸乙酯(5:1)展開)洗脫液。以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸發(fā)，得到粗制6-姜烯酚79.7mg。

5、6-姜烯酚的薄層色譜法精制

薄層層析硅膠板的制備：稱取10.0g薄層層析硅膠放入研缽中，以1:3的比例加入30ml5‰的羧甲基纖維素鈉水溶液，用研磨棒研磨均勻，直至沒有氣泡；用藥匙將適量上述硅膠勻漿均勻平鋪在洗凈干燥的玻璃板上，自然晾干。于110℃下活化2小時，待冷卻后取出。

將粗制6-姜烯酚在石油醚+乙酸乙酯中進(jìn)行薄層展開。將rf＝0.38的硅膠帶刮下，置于100ml錐形瓶中。以乙酸乙酯提取活性成分(15ml×3)，合并提取液，過濾。濾液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸發(fā)，得黃色油狀液體，干燥，稱重70.3mg。¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ:6.82(d,j＝8.0hz,1h),6.80(dd,j＝15.9,6.7hz,1h),6.68(d,j＝2.0hz,1h),6.66(dd,j＝2.0,8.0hz,1h),6.04(d,j＝15.9hz,1h),3.87(s,3h),3.20(t,j＝7.5hz,2h),2.58(t,j＝7.5hz,2h),2.24(m,2h),1.20-1.35(m,6h),0.88(t,j＝6.9hz,3h).¹³cnmr(600mhz,cdcl3)δ:194.26,146.34,145.76,143.92,132.63,129.99,120.78,114.26,110.84,55.85,40.52,34.06,31.31,29.31,27.18,22.64,14.09。

由此可見，本發(fā)明在6-姜烯酚粗品進(jìn)一步精制純化的過程中，采用薄層色譜制備的方法，最終6-姜烯酚的收率為52.1mg/kg，與文獻(xiàn)([肖紅；王曉瑩；張瑜；肖金霞；郭文華；一種天堂椒的用途及從天堂椒中提取分離6-姜烯酚的方法，cn201611104828.7])中報道的生姜中6-姜烯酚的含量約為0.005％相近(與生姜的栽培、產(chǎn)地等因素相關(guān))，說明該法收率高。產(chǎn)品的純度高，圖2中¹hnmr圖顯示，除了掃描nmr圖譜時人為加入的氘代氯仿溶劑產(chǎn)生的化學(xué)位移7.26ppm峰外，未見其它含h原子的雜質(zhì)所產(chǎn)生的峰，圖3中¹³cnmr譜進(jìn)一步證實(shí)了該產(chǎn)品純度好。產(chǎn)品6-姜烯酚純度滿足研究藥理活性、生姜提取物質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品的要求。

該方法比高速逆流色譜、制備hplc精制純化的方法相比，操作簡單，材料成本低廉，節(jié)約時間。所得6-姜烯酚產(chǎn)品可用作含姜、姜烯酚的醫(yī)藥制劑、藥理研究、化妝品、日化品等的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。