專利名稱：在膜上提取和純化核酸的方法
在膜上提取和純化核酸的方法本發(fā)明涉及使用包含胍鹽和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)的組合的裂解組合物提 取核酸的方法，其可適用于過濾在膜上的極少量的微生物。這種方法使得可以收集適于以特定方式通過雜交或者擴(kuò)增而檢測形式的所述微 生物的核酸。在工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域，水和空氣以及使用或者廢棄的工具和材料的微生物質(zhì)量控制 需要符合越來越嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。因此，業(yè)內(nèi)人士和衛(wèi)生官員需要具有其可自行支配的工具以能盡可能快地檢測微 生物污染，由此可以迅速地且低成本采取補(bǔ)救措施。按照慣例，微生物監(jiān)測是在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行。這種類型的培養(yǎng)便于實施，可以用 肉眼計數(shù)微生物。其還可以保存活微生物，并且如果需要，可以贏得鑒定時間以定義所存在 的不同微生物的屬或種。這些鑒定檢測通常包括提取微生物中包含的核酸，并且以特定方式擴(kuò)增所述核 酸，所述擴(kuò)增方式如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多種鏈反應(yīng)技術(shù)之一(PCR 聚合酶鏈反應(yīng)， 或者LCR:連接鏈反應(yīng))。然而，盡管通過核酸擴(kuò)增的鑒定檢驗具有高水平可靠性，但是需要很長時間進(jìn)行 包括微生物培養(yǎng)、提取其核酸以及進(jìn)行PCR的步驟。為了可以肉眼觀測，微生物必須培養(yǎng)至少24小時及有時更長時間以延緩微生物 如甲基桿菌(methylobacterium sp.)的生長，或者微生物被環(huán)境條件刺激。此外，核酸的提取不能在瓊脂糖上直接進(jìn)行，這意味著在提取核酸之前必須取出 微生物。在這種情況中，檢測成為定性檢測且不再是定量檢測。近年來，基于使用固定在固體支持物上的核酸探針的雜交技術(shù)的lab-on-a-chip 裝置的進(jìn)展，使得可以贏得時間進(jìn)行微生物鑒定步驟。然而，這些技術(shù)仍是高成本的，且未 提供完全免除核酸提取和轉(zhuǎn)移步驟。在這些條件下，仍必須培養(yǎng)24小時以上以計數(shù)和鑒定微生物，這在需要持續(xù)監(jiān)測 產(chǎn)品質(zhì)量的工業(yè)背景中是太長的時間。為了加速檢測液體或者氣體介質(zhì)中或者其表面上存在的微生物，本申請人 (Millipore Corporation)幾年來開發(fā)了一種檢測微生物的通用方法，以Milliflex Rapid 之名銷售。這種方法在專利申請WO 92-00145中描述。其包括通過使液體或者氣體經(jīng)過膜而 將該溶液或者氣體中包含的微生物保留在所述膜的表面。將所述膜表面的微生物與瓊脂培 養(yǎng)基接觸培養(yǎng)一段使得用肉眼無法觀測的小菌落形成必需的時間。然后將形成該小菌落的 細(xì)胞裂解以釋放其包含的三磷酸腺苷(ATP)。釋放的ATP用作標(biāo)記以通過ATP-生物發(fā)光技 術(shù)鑒別和定量活細(xì)胞。ATP作為產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶底物，由此獲得光信號，然后使用合 適的視頻接口裝置(video interface)(例如IXD相機(jī))檢測。獲得信號形成圖像，使得可 以原位觀測所述膜上的發(fā)生微生物的位置，與在瓊脂培養(yǎng)基中皮氏培養(yǎng)皿上進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)計 數(shù)方法相似。這種接口裝置使得也可以量化分析的液體或者氣體樣品中最初存在的微生物的數(shù)目。在Milliflex 系統(tǒng)中微生物的檢測被稱作是“通用的”，因為其使用ATP (三磷酸腺 苷)，這是包含于所有活細(xì)胞中的底物。這種技術(shù)使得可以迅速檢測例如在工業(yè)生產(chǎn)線上或 者在無塵室中污染物的存在，無論微生物如何甚至以極低濃度存在，由此可以在短時間內(nèi) 采取必要的去污染措施。然而，使用Milliflex 系統(tǒng)目前不能同時獲得關(guān)于檢測的微生物特性的可靠信
肩、O但是這種鑒別可用于更詳細(xì)地確定污染來源以及界定解決方案。這種鑒定的主要障礙在于在Milliflex 系統(tǒng)中實施的ATP-生物發(fā)光檢測破壞包 含的微生物。事實上，在通過生物發(fā)光檢測期間，首先使用基于乙醇的溶液處理微生物，以提取 ATP分子，然后通過生物發(fā)光試劑處理。此外，在這兩個步驟之間使所述膜干燥，以進(jìn)行生物 發(fā)光反應(yīng)。這些處理的結(jié)果是微生物被殺死，由此阻止其隨后被培養(yǎng)以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)鑒定檢測 (抗生素抗性、代謝標(biāo)記、革蘭氏反應(yīng)等)。因此，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人著手鑒定通過拯救生物發(fā)光處理的微生物的核酸而 檢測的微生物，以通過雜交或者通過擴(kuò)增、特別是通過PCR繼續(xù)進(jìn)行其特異性檢測。然而，核酸的擴(kuò)增或者雜交技術(shù)需要純化的DNA或者RNA樣品，這些樣品被充分濃 縮以可以可靠地進(jìn)行希望的檢測反應(yīng)。在濾膜上檢測的特定情況中，回收這些核酸存在許多困難，特別是由于如下事實 所致-微生物以一或多個小菌落的形式被分散在膜的表面，每個菌落包含少量微生物， 通常少于IO3個細(xì)胞；以及_干燥含有待提取的核酸的細(xì)胞，以及另外用能抑制或者降低雜交或者PCR反應(yīng) 產(chǎn)量的制劑和鹽預(yù)先處理。這些限制意味著核酸必須在膜上回收在溶液中、純化以及濃縮?，F(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中有許多提取、純化和濃縮細(xì)胞中包含的核酸的技術(shù)，這些技術(shù)因 核酸的性質(zhì)即RNA或DNA而不同。大多數(shù)這些技術(shù)需要最初用裂解緩沖液處理，然后在溶液中沉淀核酸的步驟。裂 解緩沖液的目的是破壞細(xì)胞膜及溶解蛋白質(zhì)，而沉淀使得可以在溶液中分離核酸與其它細(xì) 胞成分。最常用的提取RNA(比DNA更易損壞)的方法是例如已知的“苯酚_氯仿”方法。根據(jù)這種技術(shù)，將細(xì)胞首先置于與包含去污劑_蛋白酶K混合物的裂解緩沖液接 觸，目的是解離細(xì)胞成分以及釋放核酸。通常使用的裂解緩沖液包含作為去污劑的十二烷基硫酸鈉(SDS)，其是細(xì)胞裂解 齊U，以及包含作為蛋白酶K激活劑的Sark0Syl、Tween 20或者Nonidet P40。獲得的細(xì)胞裂解物中包含的核酸然后通過應(yīng)用苯酚(其是強(qiáng)力脫蛋白質(zhì)劑)和氯 仿(其是有機(jī)溶劑)的混合物而與蛋白質(zhì)分離。在離心后，核酸在有機(jī)相中溶解，同時在水 相與有機(jī)相之間的界面收集蛋白質(zhì)。在將水相移至另一試管中之后，用氯仿-異戊醇混合物處理核酸。這種處理的結(jié)果是消除微量的苯酚，苯酚是一種有機(jī)化合物，具有不僅是毒性產(chǎn)物而且還是某些酶包括 聚合酶的抑制劑的缺點。然后通過加入沉淀劑沉淀核酸，所述沉淀劑典型為-20°C的純乙醇，體積是裂解緩 沖液的2. 5倍，或者所述沉淀劑是異丙醇，體積是0. 7倍。隨后在70%乙醇中洗滌沉淀的核酸是除去鹽的不可或缺的步驟。然后將沉淀物置于較低離子濃度的緩沖液中，通常是Tris-EDTA緩沖液 (10/lmM)。盡管在核酸提取中提及苯酚/氯仿方法，但是其具有包括許多步驟且使用苯酚和 氯仿的缺點，苯酚和氯仿是易揮發(fā)且毒性產(chǎn)物，必須小心處理。當(dāng)試圖提取比RNA分子更 易損壞的基因組DNA時，因此傾向于使用裂解緩沖液，所述裂解緩沖液典型包含4-6M硫氰 酸胍、IOmM EDTA,2-6% NLS 和 50mM Tris-HCI (中性 pH)(所謂的經(jīng)修改的 Crude Susan 方 法)[Chirgwin，J. et al. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid fromsources enriched in ribonuclease, Biochem. 18 :5294_5299]。這禾中類型的裂角軍 緩沖液使得可以不用苯酚-氯仿而直接在細(xì)胞裂解物中進(jìn)行核酸的沉淀[Jeanpierre， Μ. (1987)A rapid method for the purification of DNA from blood, Nucleic Acids Research 15(22) :9611]。然而，在這些條件下獲得的核酸的質(zhì)量以及反應(yīng)的產(chǎn)量不恒定，特別是當(dāng)較大體 積水相和細(xì)胞成分荷載時，根據(jù)微生物的性質(zhì)是可變的。然后可能需要進(jìn)行核酸的二次沉 淀，以獲得良好質(zhì)量的 DNA[De Nedjma, A. (2005) Principe de Biologie Moleculaire in Biologie Clinique, Elsevier &Masson]。某些技術(shù)使用含有硅珠的微型柱，以便于核酸的洗滌和回收步驟。然而，原理是相 同的，因為也需要在吸附相的核酸沉淀步驟。上述技術(shù)不適于制備和檢測少量的核酸。事實上，如上所述，當(dāng)核酸太稀釋時，其 沉淀變得更隨機(jī)，且存在核酸在純化期間喪失的危險增加。因此，本發(fā)明的目的是提供一種簡便的、快速且有效的方法從少量微生物中制備 核酸(DNA和RNA)，用以隨后對其進(jìn)行鑒定。因此，本申請揭示了一種提取和純化基因組DNA的方法，其可用于例如過濾在膜 上的細(xì)胞，由此在溶液中使用鹽酸胍和限量的NLS處理所述細(xì)胞。根據(jù)這種方法，在膜上純 化核酸而不用繼續(xù)純化步驟，將由所述膜保留的DNA以適于通過雜交或者PCR檢測的形式 回收在純水或者緩沖的水中。令人驚奇地，本發(fā)明人在組合物中使用比在裂解組合物中通常所見更低濃度的 NLS獲得最佳檢測結(jié)果。特別注意到，在這個更低濃度，NLS使得可以避免在純化步驟期間 與膜堵塞相關(guān)的問題，而且還便于在該方法的后期拯救核酸。本發(fā)明目的更特別在于通過PCR鑒定過濾在膜上的極少量微生物，直至 Milliflex 快速檢測系統(tǒng)的ICFU檢測閾值。然而，本發(fā)明可用于超出膜微生物學(xué)的特定范 圍制備核酸，無論細(xì)胞類型如何，特別是用于進(jìn)行雜交或者擴(kuò)增反應(yīng)。獲得的核酸制備物可 用于例如進(jìn)行PCR反應(yīng)或者LAMP型等溫擴(kuò)增反應(yīng)，或者包含RNA分子的反應(yīng)如NASBA或者 TMA型擴(kuò)增，應(yīng)理解通過逆轉(zhuǎn)錄步驟可以將RNA序列轉(zhuǎn)錄為DNA。下圖舉例說明了在本申請書中描述的實施例的結(jié)果。


圖1 用于通過PCR檢測微生物的裂解組合物1-7的效力對比。在所有情況中，在 通過相應(yīng)的裂解組合物處理細(xì)胞之后，DNA在包含于(Microcon )離心管中的纖維素膜上 純化。在培養(yǎng)取樣的新鮮細(xì)胞(懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞)、在PVDF濾膜上取樣的新鮮細(xì)胞或者在 用ATP-生物發(fā)光處理(根據(jù)Milliflex 快速檢測方法)之后的PVDF膜上取樣的細(xì)胞上進(jìn) 行實驗。對于PCR抑制對照組，將純DNA導(dǎo)入裂解組合物中，然后在膜上純化，如在其它制 備物的情況中一樣。每個實驗至少檢測所述組合物兩次。檢測的細(xì)胞是大腸桿菌。PCR結(jié) 果以照片形式提供，示出擴(kuò)增的再現(xiàn)性和強(qiáng)度。+ 陽性擴(kuò)增；-陰性擴(kuò)增；1/2 無再現(xiàn)性； ND 未進(jìn)行；NA 在膜上陰性結(jié)果。圖2 本發(fā)明的核酸提取和檢測方法的結(jié)果，涉及白色念珠菌和釀酒酵母。瓊脂糖 凝膠示出通過PCR擴(kuò)增的良好再現(xiàn)性?？资菑淖笙蛴揖幪?。1 陽性PCR對照(純白色念 珠菌DNA) ；2-6 (凝膠上部)或者2-5 (凝膠下部)檢測的不同樣品；7 (第一個凝膠)或者 6(第二個凝膠)1000bp plus梯。使用通用的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，使得可以檢測單細(xì)胞真 菌。在所述膜的合成圖像的中心，示出對每個PCR檢測樣品進(jìn)行的通過ATP-生物發(fā)光通用 檢測的結(jié)果。圖3 本發(fā)明的核酸提取和檢測方法的檢測結(jié)果，其涉及革蘭氏陽性菌(A)金黃色 葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和革 蘭氏陰性菌(B)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、大腸桿菌、腸道沙門氏菌(S. enterica)的 基因組DNA。瓊脂糖凝膠的孔從左至右編號。1:陽性PCR對照；2-4:使用革蘭氏陽性菌或 者革蘭氏陰性菌通用的引物對3個獨立樣品進(jìn)行PCR ;5:100pb plus梯。在所述膜的合成 圖像的中心，示出對每個PCR檢測樣品進(jìn)行的通過ATP-生物發(fā)光技術(shù)的通用檢測結(jié)果。圖4 本發(fā)明的核酸提取和檢測方法的檢測結(jié)果，其涉及包含大腸桿菌與表皮葡 萄球菌的混合物的細(xì)胞群的基因組DNA。A 在Milliflex 方法之后通過ATP-生物發(fā)光技 術(shù)在三個細(xì)胞群中計數(shù)細(xì)胞混合物。B 在瓊脂糖凝膠上觀測的根據(jù)本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增 檢測。1 陽性對照；2-4 對于三個細(xì)胞群的每一群進(jìn)行的PCR ；5 陰性對照；6 IOOpb plus 梯。第一列使用通用引物對大腸桿菌和表皮葡萄球菌進(jìn)行的PCR;第二列使用特異性引 物對大腸桿菌進(jìn)行的PCR ；第三列使用特異性引物對表皮葡萄球菌進(jìn)行的PCR ；第四列 使用特異性引物對枯草芽孢桿菌進(jìn)行的PCR。圖5 通過ATP-生物發(fā)光技術(shù)(Mi 11 if lex Rapid )及隨后通過PCR和本發(fā)明的 微測序進(jìn)行檢測。A:13CFU的表皮葡萄球菌和9CFU的枯草芽孢桿菌的計數(shù)。B 在對純化 自與在A中的膜上檢測的那些細(xì)胞相同的表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌細(xì)胞的基因組DNA 的提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的凝膠上進(jìn)行觀測。C 在B中觀測的擴(kuò)增產(chǎn)物上進(jìn)行的微測
序結(jié)果。圖6 關(guān)于本發(fā)明的PCR檢測單細(xì)胞真菌和細(xì)菌的靈敏性檢測結(jié)果。提取相應(yīng)于 ICFU的基因組DNA，首先通過生物發(fā)光檢測，然后根據(jù)本發(fā)明的方法通過PCR檢測。A 使用 特異于細(xì)菌的通用引物對細(xì)菌樣品(大腸桿菌)進(jìn)行PCR的獲得的陽性結(jié)果。B:對3個不 同的單細(xì)胞真菌樣品(釀酒酵母)進(jìn)行PCR獲得的陽性結(jié)果。圖7 通過ATP生物發(fā)光技術(shù)和PCR檢測革蘭氏陽性菌痤瘡丙酸桿菌(P. acnes)。 Α:在三個樣品中通過ATP生物發(fā)光技術(shù)的檢測結(jié)果，使得可以評定在5和6CFU檢測的細(xì)菌 數(shù)目。B 使用通過本發(fā)明的提取方法分別提取自這三個樣品的核酸制備物獲得的PCR陽性
7結(jié)果。 圖8 得自通過TMA擴(kuò)增提取自銅綠假單胞菌的兩個核制備物中包含的RNA的RNA 擴(kuò)增片段的實時累積圖。所述制備物分別相應(yīng)于大約30和300CFU的細(xì)菌。本發(fā)明的目的因此是提供一種在膜上提取和檢測核酸的方法，使得可以鑒別在液 體或者氣體介質(zhì)中或者甚至在表面上低濃度存在的微生物。本發(fā)明的方法更特別涉及檢測移至膜上的微生物，通過將液體或者氣體樣品通過 所述膜過濾或者通過將所述膜與能含有或者包含微生物的介質(zhì)或者表面接觸。所述方法更 特別針對解決鑒別分散在膜表面上的微生物的問題。本發(fā)明的方法特別適于鑒別預(yù)先在膜 上檢測的微生物，例如使用非特異性方法如在Milliflex快速檢測方法中使用的ATP生物 發(fā)光技術(shù)。本發(fā)明的方法包括提取和純化較少量的細(xì)胞(活的或者死的細(xì)胞)的核酸。除 了在膜上檢測微生物的特定情況之外，其可用于從中以快速和有效方式提取核酸的任何細(xì) 胞。這種方法可特別用于獲得適于進(jìn)行為鑒定其必需的雜交或者擴(kuò)增反應(yīng)形式的RNA和/ 或DNA核酸。這種方法包括如下步驟，其中a)將細(xì)胞用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)在溶液中處理，以使細(xì)胞裂解以 及釋放其中包含的核酸；b)從通過將所述裂解物經(jīng)過膜過濾獲得的細(xì)胞裂解物中分離核酸；c)將由所述膜保留的核酸回收在水溶液或者弱離子化水溶液中。如本文所述，“細(xì)胞”是指小的生物實體，其包含由膜劃界的細(xì)胞質(zhì)以及含有核酸 形式的遺傳物質(zhì)。在本發(fā)明中，“微生物”是指具有顯微粒徑的細(xì)胞，即大小在0. 5-5微米之間，具有 代謝和繁殖潛力，如藻類、單細(xì)胞真菌、原生動物、霉菌、細(xì)菌以及配子。所述微生物更特別是如下菌屬的革蘭氏陽性或者革蘭氏陰性致病菌假單胞菌 屬，埃希氏菌屬，軍團(tuán)菌屬，沙門氏菌屬，利斯特氏桿菌屬，桿菌屬，鏈球菌屬，弧菌屬，耶爾 森氏菌屬，葡萄球菌屬，分支桿菌屬，志賀氏菌屬，梭菌屬，彎曲桿菌屬，或者氣單胞菌屬；賈 第蟲屬、內(nèi)阿米巴屬、隱孢子蟲屬、圓孢子蟲病屬原生動物；支原體(Mycoplasma)和解脲支 原體屬支原體，酵母屬、曲霉屬、念珠菌屬或者青霉屬真菌。在步驟a)中通過鹽酸胍和N-十二烷基_肌氨酸處理細(xì)胞可以用一種化合物及然 后再用另一化合物進(jìn)行，或者甚至同時處理。根據(jù)本發(fā)明一優(yōu)選方面，所述處理是使用裂解 組合物進(jìn)行，所述裂解組合物包含的NLS濃度是所述組合物總重量的0. 1-1 %。所述鹽酸胍是用作裂解劑的一種離液劑。其具有使蛋白質(zhì)特別是膜蛋白質(zhì)變性以 及產(chǎn)生滲透壓休克(osmotic shock)的雙重功效。其通常使用的濃度是每升裂解組合物 3_8mo 1 e,優(yōu)選 4_6mo 1 e。N-十二烷基-肌氨酸(Sarkosyl NL-97或者NLS)是N-甲基_N_ (1_氧代十二烷 基(oxododecyl))甘氨酸的鈉鹽(C15H28NO3Na)15這個分子是與蛋白酶K組合在裂解緩沖液 中常用的去污劑以溶解蛋白質(zhì)、特別是膜蛋白質(zhì)，其濃度為每升幾摩爾。根據(jù)本發(fā)明，NLS不用作或者至少不主要用作裂解劑。事實上，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選 NLS以裂解組合物最終重量的0. 1-1%的濃度使用，更優(yōu)選0. 1-0.5%，即在其中細(xì)胞裂解 被限制的濃度。
如在本發(fā)明申請書的實施例中所示(特別見圖1的結(jié)果)，加入在這個濃度的NLS 似的可以改善提取和純化產(chǎn)量，特別是在上述方法的步驟b)和c)中，因此隨后可以使用獲 得核酸制備物進(jìn)行微生物的鑒定。NLS是一種陰離子去污劑，其使得蛋白質(zhì)中幾乎所有非共 價相互作用變性，且趨于使該蛋白質(zhì)溶解。不受理論所限，本發(fā)明人認(rèn)為NLS在細(xì)胞裂解物 通過膜過濾期間以及在隨后的DNA漂洗時促進(jìn)DNA和蛋白質(zhì)的分離。如本文所用，“細(xì)胞裂解物”是指使用裂解組合物完成步驟a)的處理后在溶液中裂 解的細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的裂解組合物還包含0. 1-lmmol/l的乙二胺四乙酸(EDTA)。盡 管認(rèn)為EDTA是能抑制許多酶、特別是PCR反應(yīng)中的聚合酶活性的物質(zhì)，但是在本發(fā)明人進(jìn) 行的實驗中發(fā)現(xiàn)存在EDTA使得不僅可以改善革蘭氏陰性微生物的裂解，也可以改善革蘭 氏陽性微生物的裂解。原則上，EDTA通過螯合二價離子而可以使細(xì)菌細(xì)胞膜不穩(wěn)定。在本申請書中，“膜”是指具有兩個表面的一種合成的支持物，其，其孔徑具有已知 的平均直徑。這種膜具有高表面/體積比率。所述膜的厚度通常是恒定的，在90-200微米 之間。這種膜可以是單層或者多層的。其通常由選自如下的一或多種材料組成聚四氟 乙烯，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚碳酸酯，聚酰胺，聚酯，聚醚砜，醋酸纖維素和硝化纖維。在本發(fā)明的DNA提取方法的步驟b)中指定的膜通常是稱作的超濾膜的由纖維 素制成的膜，即膜的分子量標(biāo)稱限制(nominal limit)是3，000-100，000道爾頓，優(yōu)選 50，000-100，000道爾頓。舉例的這種類型的膜是與microcon 離心管(Millipore公司) 一起提供的膜。根據(jù)本發(fā)明，在負(fù)壓或者正壓的作用下通過所述膜從細(xì)胞裂解物中分離核酸。例 如，可以通過使用真空泵使所述膜的一面處于低壓而使所述裂解物通過該膜。這可以在離 心的作用下進(jìn)行，即對在膜表面的細(xì)胞裂解物應(yīng)用離心力。所述離心作用通常通過將所述 膜置于離心機(jī)中放置的支持物如離心管上而獲得。本發(fā)明另外提供了在所述方法的步驟b)與C)之間，可以進(jìn)行洗滌由所述膜保留 的核酸的步驟，使用洗滌溶液如水或者弱離子化水溶液洗滌。所述洗滌溶液在經(jīng)過所述膜 后被除去。在步驟C)中，可以與在步驟b)中所用或者甚至上述另外的洗滌步驟相反方向，使 所述水或者弱離子化水溶液通過該膜。當(dāng)通過應(yīng)用負(fù)壓或者正壓或者甚至通過離心而便于 步驟C)進(jìn)行時，需要將其上固定了所述膜的支持物以與其最初表面相反方向放置，并且在 所述膜的表面上滴一滴弱離子化溶液。通過壓力或者離心發(fā)揮的壓力使得水通過所述膜孔，并且從膜中釋放核酸。然后 將所述核酸以水滴滴入收集在離心管底部。在這種情況中，弱離子化溶液是指這樣的溶液，其每升鹽濃度低于10_2mOle/L，更 優(yōu)選低于 5. l(T3mole/L。更具體地，本發(fā)明涉及一種在液體或者氣體介質(zhì)中檢測一或多種細(xì)胞的方法，特 征在于其包括如下步驟a)將所述液體或者氣體介質(zhì)樣品通過膜過濾，以使所述樣品中含有的細(xì)胞保留在 所述膜上；b)將在步驟a)中的細(xì)胞用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)在溶液中處理，
9獲得含有從所述細(xì)胞中釋放的核酸的細(xì)胞裂解物；c)將在步驟b)中獲得的細(xì)胞裂解物的核酸通過使所述裂解物通過所述膜或者另 一膜過濾而分離；d)將在步驟C)中由所述膜保留的核酸回收在水或者弱離子化溶液中；e)檢測在步驟d)中回收的核酸。所述檢測方法的步驟b)至d)優(yōu)選相應(yīng)于本發(fā)明的核酸提取和純化方法，即在上 述方法的步驟a)至c)進(jìn)行的那些步驟。所述檢測方法的目的是計數(shù)液體介質(zhì)如水或者氣體介質(zhì)如空氣中存在的細(xì)胞、更 特別是微生物，同時盡可能地確定其特性(家族、種屬、物種等)。液體或者氣體介質(zhì)是指能 通過施加壓力差而被過濾通過膜的任何液體，所述膜孔的平均直徑通常為0. 1-1. 5微米， 優(yōu)選0. 15-0. 8微米，更優(yōu)選0.2-0. 6微米。這種液體可由組成生產(chǎn)無菌產(chǎn)物一部分的純?nèi)?液組成，也可以是復(fù)合溶液(飲用水、血清、尿液、羊水等)，或者也可以是氣體混合物如空 氣。本發(fā)明的方法可用于診斷領(lǐng)域，以分析源自動物或者患者的樣品。在所述檢測方 法的步驟a)中，細(xì)胞轉(zhuǎn)移通常在所謂的濾膜上進(jìn)行，即可以使液體或者氣體介質(zhì)透過的 膜，然而其平均孔徑使得保留至少80%、優(yōu)選90%的尋求的細(xì)胞或者微生物。優(yōu)選地，這種 膜主要由PVDF(聚偏氟乙烯)、纖維素或者聚苯砜組成。更優(yōu)選地，其是由PVDF制成的、由 Millipore公司以Milliflex商標(biāo)銷售的濾膜，以及提及的MXHVWP124或者RMHVMFX24。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，用于在步驟C)中分離裂解組合物的核酸的膜與在 步驟a)中使用的膜不同。在步驟a)中使用的膜可另外置于與營養(yǎng)介質(zhì)接觸，由此在步驟 a)與b)之間由所述膜保留的細(xì)胞或者微生物可以在其表面上生長。所述營養(yǎng)介質(zhì)通常是 瓊脂糖介質(zhì)，其營養(yǎng)成分通過毛細(xì)管作用到達(dá)細(xì)胞。在所述膜的表面上繁殖時，細(xì)胞形成小 菌落。本發(fā)明還提供了 Milliflex技術(shù)，這是可以計數(shù)膜上微生物的檢測步驟，其可以 在步驟b)中細(xì)胞裂解之前提前實施，例如通過在步驟a)與b)之間從細(xì)胞中提取ATP以及 使該ATP與包含螢光素和螢光素酶的生物發(fā)光試劑反應(yīng)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，提取的核酸由RNA和DNA組成，特別是由信使RNA和核糖體RNA以及 基因組DNA組成。本發(fā)明的方法具有能使用根據(jù)本發(fā)明的方法從細(xì)胞中提取的RNA以及 DNA的優(yōu)勢。在步驟e)中檢測核酸優(yōu)選通過使用能被特異性標(biāo)記的引物或者探針特異性雜交 在步驟d)中回收的所有或者部分核酸進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，探針是指能識別并組合上述核酸類別之一的大分子，使得其可以標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明，引物是指能識別并組合上述核酸類別之一的大分子，以起始所述核 酸的擴(kuò)增反應(yīng)。使用的探針或者引物通常是能與提取的核酸中存在的DNA或者RNA序列以一定 程度的特異性雜交的大分子。本發(fā)明展望了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可以與核酸特異性 雜交任何類型的探針或者引物，所述核酸例如是簡單的寡核苷酸，2' 0-甲基-RNA型寡 核苷酸，PNA型探針或者引物(由嘌呤和嘧啶堿基取代的多肽鏈組成的探針)[NielsenP. E. et al. Science(1991)254 :1497-1500]或者 LNA(包含一或多個 2' -0-4' -C-亞甲 基- β -D-核糖呋喃糖基(ribofuranosyl)單體的寡核苷酸)，如專利EP 1013661所述。擴(kuò)增反應(yīng)是指可以從所述核酸中合成大分子的酶反應(yīng)，其存在可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法 檢測，例如通過在瓊脂糖凝膠或者丙烯酰胺上層析、顯微測序或者熒光性。本發(fā)明的方法因此可以在步驟e)中包括擴(kuò)增在步驟d)中回收的所有或者部分核 酸的步驟，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)之一進(jìn)行，如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，或者根據(jù)本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行等溫擴(kuò)增反應(yīng)，例如NASB[Compton，J.，Nature (1991) 350 91-92]、TMA 或者 LAMP 類型[Notomi T. ,Nucleic Acids Research (2000), 28 (12) :e63]擴(kuò)
+飽
+曰ο這種擴(kuò)增通過增加可用于檢測目的的核酸的數(shù)量而可用于優(yōu)化微生物的檢測。如 果這個擴(kuò)增步驟是高度特異性的，其還可以高選擇性鑒別微生物。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得核酸制備物特別適于通過擴(kuò)增檢測核酸。本發(fā)明還提供了提取核酸的試劑盒，特征在于其包含膜，優(yōu)選由纖維素或者 PVDF制成的膜；以及如前文所述裂解組合物。此外，這種試劑盒可有利地包含一或多種特 異性探針或者引物，以對提取的核酸進(jìn)行檢測，特別是通過雜交或者通過PCR檢測。任選 地，這種試劑盒還可包含另一種膜以過濾液體或者氣體介質(zhì)。這種試劑盒使得可以實施本 發(fā)明的方法。這種試劑盒可特別用于實施DNA的提取和純化方法，以及隨后在先前限定的條件 下鑒別所述細(xì)胞或者微生物。如下實施例用于補(bǔ)充本發(fā)明的描述，無任何限制本發(fā)明之意義。 實施例材料和方法檢測的微生物在后文描述的檢測檢驗中使用的微生物得自美國典型微生物保藏中心ATCC。菌株 的參考編號在表1中提供。表1:使用的微生物
權(quán)利要求
裂解組合物，特征在于其包含鹽酸胍和N 十二烷基 肌氨酸(NLS)，其中包含的所述NLS濃度相對于所述組合物的總重量在0.1 1％之間。
2.權(quán)利要求1的裂解組合物，特征在于包含的所述鹽酸胍濃度在3-8mol/l之間。
3.權(quán)利要求1或2的裂解組合物，特征在于其還包含EDTA。
4.權(quán)利要求3的裂解組合物，特征在于所述組合物包含的EDTA的濃度在0.1-lmmol/l 之間。
5.權(quán)利要求1-4任一項的裂解組合物，特征在于其以溶液形式存在。
6.提取一或多種細(xì)胞的核酸的方法，特征在于其包括如下步驟a)用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)溶液處理所述細(xì)胞，使細(xì)胞裂解及釋放其包 含的核酸；b)經(jīng)過膜過濾步驟a)中獲得的細(xì)胞裂解物而從所述裂解物中分離核酸；c)將通過所述膜保留的核酸回收在水溶液或者弱離子化水溶液中。
7.權(quán)利要求6的方法，特征在于所述溶液中使用的NLS的濃度在0.1-1%之間。
8.權(quán)利要求6或7的方法，特征在于鹽酸胍和NLS同時用于權(quán)利要求5的裂解組合物中。
9.權(quán)利要求6-8任一項的方法，特征在于步驟b)中使用的從細(xì)胞裂解物中分離核酸的膜是纖維素膜。
10.權(quán)利要求6-9任一項的方法，特征在于步驟b)中使用的膜的分子量標(biāo)稱限制在 3，000-100, 000道爾頓之間，優(yōu)選在50，000-100, 000道爾頓之間。
11.權(quán)利要求6-10任一項的方法，特征在于在負(fù)壓或者正壓的作用下通過膜從細(xì)胞裂 解物中進(jìn)行核酸分離。
12.權(quán)利要求6-10任一項的方法，特征在于在離心作用下通過膜從細(xì)胞裂解物中進(jìn)行 核酸分離。
13.權(quán)利要求6-12任一項的方法，特征在于在步驟b)和c)之間進(jìn)一步包括使用洗滌 溶液如水或者弱離子化水溶液洗滌由所述膜保留的核酸的步驟，這個洗滌溶液在經(jīng)過所述 膜之后被清除。
14.權(quán)利要求6-13任一項的方法，特征在于在步驟c)中，通過使所述水或者弱離子化 水溶液以與步驟b)中所用的方向相反的方向經(jīng)過所述膜而回收所述核酸，優(yōu)選在負(fù)壓或 正壓或者離心作用下進(jìn)行。
15.檢測液體或者氣體介質(zhì)中一或多種細(xì)胞的方法，特征在于其包括如下步驟a)將所述液體或者氣體介質(zhì)樣品通過膜過濾以使所述樣品中含有的細(xì)胞保留在膜上；b)將在步驟a)中保留的細(xì)胞用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)溶液處理，以獲 得含有從所述細(xì)胞中釋放的核酸的細(xì)胞裂解物；c)通過所述膜或者通過另一膜過濾所述裂解物，從而從在步驟b)中獲得的細(xì)胞裂解 物中分離核酸；d)將在步驟c)中由所述膜保留的核酸回收在水或者弱離子化水溶液中；e)檢測在步驟d)中回收的核酸。
16.權(quán)利要求15的方法，特征在于使用探針或者特異性標(biāo)記的引物通過與在步驟d)中2回收的所有或者部分核酸進(jìn)行特異性雜交而進(jìn)行步驟e)中的核酸檢測。
17.權(quán)利要求15或16的方法，特征在于步驟e)中核酸的檢測包括擴(kuò)增在步驟d)中回 收的所有或者部分核酸的步驟。
18.權(quán)利要求17的方法，特征在于所述擴(kuò)增步驟包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
19.權(quán)利要求18的方法，特征在于所述擴(kuò)增步驟包括等溫擴(kuò)增，如LAMP、NASBA或者 TMA型擴(kuò)增。
20.權(quán)利要求15-19任一項的方法，特征在于步驟e)中的核酸檢測包括RNA逆轉(zhuǎn)錄為 DNA的步驟。
21.權(quán)利要求15-20任一項的方法，特征在于在步驟c)中用于分離裂解組合物的核酸 的膜與步驟a)中使用的膜不同。
22.權(quán)利要求15-21任一項的方法，特征在于根據(jù)權(quán)利要求6-14任一項的方法的步驟 a)至c)進(jìn)行步驟b)至d)。
23.權(quán)利要求15-22任一項的方法，特征在于步驟a)中使用的膜置于與營養(yǎng)介質(zhì)接觸， 由此在步驟a)和b)之間微生物可以在所述膜的表面上生長。
24.權(quán)利要求15-23任一項的方法，特征在于通過使提取自微生物的ATP與生物發(fā)光試 劑反應(yīng)在步驟a)和b)之間進(jìn)行檢測步驟，所述檢測步驟使得可以計數(shù)微生物，所述生物發(fā) 光試劑如包含螢光素和螢光素酶的試劑。
25.提取核酸的試劑盒，特征在于其包含-過濾膜，-權(quán)利要求1-5任一項的裂解組合物。
26.檢測微生物的試劑盒，特征在于其包含-過濾膜，-權(quán)利要求1-5任一項的裂解組合物，-用于通過雜交或者通過PCR檢測提取的核酸的一或多種特異性引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在膜上提取和檢測核酸的方法，使得可以鑒別液體或者氣體介質(zhì)中低濃度存在的微生物，本發(fā)明還涉及一種新的裂解組合物，其包含鹽酸胍以及0.1-1％的N-十二烷基-肌氨酸(NLS)，使得可以實施這種方法。
文檔編號C12N15/10GK101978058SQ200980110269
公開日2011年2月16日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月21日
發(fā)明者F·馬克, R·伊薩克 申請人:米利波爾公司