本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其應用。

背景技術：

中山杉是江蘇省中國科學院植物研究所從落羽杉×墨杉雜交組合中選育出來的優(yōu)良無性系，具有速生，耐水淹，耐鹽堿，抗病蟲害等優(yōu)點。由于其突出的耐水淹能力，近年來已在云南滇池、安徽巢湖和三峽庫區(qū)等地區(qū)的濕地生態(tài)系統(tǒng)構建中發(fā)揮著重要作用。重慶萬州三峽庫區(qū)消落帶的試驗表明：經過最長149d基部淹水，最長122d沒頂淹水，最大沒頂深度達12m，中山杉仍能獲得90%的造林保存率，樹木年平均胸徑和樹高生長量分別達1.3cm/a和0.60m/a，因而中山杉可以作為一種研究木本耐水淹特性的優(yōu)良材料。前期關于植物耐水淹機制研究主要集中在草本模式植物擬南芥以及糧食作物水稻中，中山杉的耐水淹特性研究也主要集中在形態(tài)學和生理學方面，無法深入揭示其耐淹機理。因而挖掘出中山杉響應水淹脅迫的關鍵基因對于探究其耐水淹特性及揭示木本植物耐淹機制均具有重要意義。

植物在水淹脅迫下可誘導糖酵解發(fā)生進而適應缺氧環(huán)境，整個過程既可以為植物體提供能量又可以減少低氧對植物毒害。因而糖酵解途徑相關的基因被廣泛分離、鑒定，其中乙醇脫氫酶編碼基因adh備受關注。水稻中過量表達adh1雖沒有對植株水淹耐受力產生明顯影響，但是adh1一旦突變或缺失，植物的厭氧耐受力就大大降低。玉米和擬南芥adh無效突變體以及水稻rda（低活性的adh）突變體內發(fā)酵能力顯著降低，根細胞胞質ph值迅速下降，突變體明顯早于野生型死亡。將水稻的adh1基因轉入煙草中，煙草轉基因植株耐淹能力顯著增強，且adh1酶的活性也隨淹水時間增加而升高。中山杉水淹脅迫的轉錄組測序結果也顯示，水淹程度越高，adh基因的rpkm值也會隨之升高。綜上可知：adh基因對于草本植物響應低氧脅迫發(fā)揮著重要的作用，而木本植物中研究較少，在中山杉中尚未有相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)在技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的應用。

技術方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

含有所述的調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的載體。

所述的調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的表達蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述的調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物育種中的應用。

所述的調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物抗?jié)持械膽谩?/p>

本發(fā)明以中山杉406葉片為材料，通過race技術克隆了中山杉thadh4。同時，采用通路克隆技術構建其過量表達載體ph35gs-thadh4，該基因位于啟動子p35s之后，在啟動子p35s的驅動下，thadh4在楊樹中高效表達，并伴隨著表型出現(xiàn)變異，轉基因植株生長速率加快，節(jié)間明顯變長。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過將thadh4基因轉入木本模式植物楊樹中，過量表達thadh4的轉基因楊樹，生長速率加快，節(jié)間明顯變長，且水淹脅迫下，基因的表達量呈幾百倍上升。說明thadh4基因是植物響應水淹脅迫的重要基因，在林木基因工程領域有重要的應用價值。

附圖說明

圖1是植物過表達載體ph35gs示意圖；

圖2是過量表達thadh4轉基因楊樹與未轉基因楊樹整體表型對比圖，圖中左為未轉基因楊樹，圖中右為轉基因楊樹；

圖3是過表達thadh4轉基因植株在水淹脅迫下的基因表達變化圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

以下實施例中，未詳細敘述的操作均為常規(guī)生物學實驗操作，可參照分子生物學實驗手冊以及現(xiàn)有公開的期刊文獻等進行。

實施例1通過race技術克隆thadh4基因

1）rna的提取及cdna的反轉

以中山杉406葉片為材料，使用rneasyplantminikit（qiagen公司），中山杉總rna的提取，由于葉片內含有較多的酚類化合物，對操作步驟進行了改良。在進行提取rna操作前，所有的槍頭，離心管，研缽均應用0.1%depc水浸泡過夜，高壓滅菌40min后烘干。所有溶液均應采用0.1%depc水配制。用nanodrop1000進行總rna濃度和純度的測定。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行總rna的分離，一個完整性較好的rna應當可以觀測到三條清晰的條帶，其中5.8srna稍暗，而28srna的條帶亮度約為18srna的兩倍左右，表明rna沒有被降解，后采用clontech公司的smarter?pcrcdnasynthesiskit，advantage?2pcrkit進行反轉錄。

2）thadh4基因目的片段的獲得

根據(jù)中山杉轉錄組測序結果進行篩選thadh4的unigene序列，使用oligo6設計特異性的引物擴增thadh4基因的目的片段，其中，thadh4目的片段的正向引物為：5’-gaagtgatgagaagagcaggtt-3’，5’-aggcctggtataatacgttggtat-3’。pcr反應體系：takaralataq(5u/μl)0.5μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺free)5.0μl，mgcl2（25mm）5.0μl，dntpmixture（2.5mmeach）8.0μl，forwardprimer(10μm)2.0μl，reverseprimer(10μm)2.0μl，cdnatemplate1.0μl，milli-qwater26.5μl。反應程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，35cycles；72℃10min；4℃forever。對產物進行測序，獲得的thadh4基因目的片段序列如seqidno.3所示。

依據(jù)上述thadh4基因目的片段分別設計3’race和5’race擴增，pcr篩選后進行克隆測序，最后將獲得3’race片段及5’race片段進行拼接。

3）3’race

3’race反轉錄：以總rna為模板，反應體系如下：totalrna1μg（xμl），5×m-mlvbuffer2μl，dntpmixture（10mmeach）1μl，3'raceadaptor（5′-ctgatctagaggtaccggatcc-3′）（5μm）1μl，reversetranscriptasem-mlv(rnaseh)(200u/μl)0.25μl，rnaseinhibitor（40u/μl）0.25μl，rnasefreeh2o5.5-xμl，總體積10μl。反應程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。獲得3’racecdna4℃儲存，進入下一個步驟。

3’race巢氏pcr：3’race巢氏pcr分為3’raceouterpcr和3’raceinnerpcr兩輪，在獲得10μl3'race反轉錄產物后，可以進行適當?shù)南♂?，一般是稀釋?0μl用于后續(xù)反應。

3'raceouterpcr是反應體系如下：稀釋過的反轉錄反應液2μl，3'raceouterprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，總體積50μl。反應程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。反應產物取5μl稀釋適當倍數(shù)后用于innerpcr反應，其余的用于瓊脂糖凝膠電泳檢測。

引物序列如下：thadh43'raceouterprimer：5'-taccgtcgttccactagtgattt-3'；genespecificouterprimer：5'-cctcaaagataataggaataga-3'。

3'raceinnerpcr是反應體系如下：稀釋過的3'raceinnerpcr產物2μl，3'raceinnerprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，總體積50μl。反應程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，32cycles；72℃10min；4℃forever。

引物序列如下：thadh43'raceinnerprimer：5'-cagcttcgaatgcattggaaatacca-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3'。

pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段，利用切膠試劑盒回收后，連接于takara公司的pmd19-tsimplevector，轉化takara公司的top10大腸桿菌感受態(tài)，通過含有amp的lb篩選培養(yǎng)板進行篩選，將篩選出的單克隆菌落pcr檢測后送至金斯瑞公司測序鑒定。

4）5’race

5’race反轉錄：去磷酸化反應是5’race的第一步反應，由alkalinephosphatase催化完成的。反應體系如下：totalrna2-5μg（xμl），10×alkalinephosphatasebuffer（mgcl2free）5μl，alkalinephosphatase（calfintestine）（16u/μl）0.6μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，rnasefreedh2o43.4-xμl，總體積50μl。50℃反應1h，向上述反應液加入20μl的3mch3coona（ph5.2），130μl的rnasefreedh2o后充分混勻，加入200μl的酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉移至新的1.5ml的離心管中，加入200μl的氯仿，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉移至新的1.5ml的離心管中，加入2μl的nacarrier后均勻混合，再加入200μl的異丙醇，充分混勻后，-40℃放置2h以上，4℃13000g離心20min，棄上清，加入500μl的75%的預冷乙醇漂洗，4℃，13000g離心5min，棄上清后干燥，加入7μl的depc水溶解沉淀，得到ciap-treatedrna。

5’race的第二步反應是去帽子反應，用tobaccoacidpyrophosphatase去掉mrna的5’帽子結構，并保留一個磷酸基團。反應體系：ciap-treatedrna7μl，10×tapreactionbuffer1μl，tobaccoacidpyrophosphatase（0.5u/μl）1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，totalvolume10μl。37℃反應1h，取5μl用于5’raceadaptor連接反應，剩余的5μl保存于-80℃。5’adaptor的連接反應體系如下：ciap/tap-treatedrna5μl，5’raceadaptor（15μm）1μl，rnasefreedh2o4μl，65℃反應5min后冰上放置2min，加入下列試劑：5×rnaligationbuffer8μl，40%peg600020μl，t4rnaligase1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，總體積40μl，16℃反應1h，4℃過夜。向上述反應液中加入20μl的3mch3coona（ph5.2），140μl的rnasefreedh2o后，充分混勻，加入200μl的苯酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉移至新的1.5ml的離心管中，加入200μl的氯仿，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉移至新的1.5ml的離心管中，加入2μl的nacarrier后充分混勻；再加入200μl的異丙醇，-40℃放置2h，加入500μl的75%的預冷乙醇漂洗，4℃，13000g離心5min，棄上清后再離心1min后徹底吸干溶液后干燥，加入7μl的rnasefreedh2o溶解沉淀，得到ligatedrna。

ligatedrna反轉錄反應，反應體系：ligaterna6μl，5×m-mlvbuffer2μl，dntp（10μmeach）1μl，random9mers（50μm）0.5μl，reversetranscriptasem-mlv（rnaseh）（200u/μ）0.25μ，rnaseinhibitor（40u/μ）0.25μ，總體積10μl。反應程序：30℃10min；42℃1h；70℃15min；4℃forever。獲得5’racecdna4℃儲存，進入下一個步驟。

5’race巢氏pcr也分為5’raceouterpcr和5’raceinnerpcr兩輪，反應體系，反應條件與3’race巢氏pcr一致。

引物序列如下：thadh45’raceouterprimer：5'-acacaagcataatccacgactgtata-3'，genespecificouterprimer：5'-cgcggatccatggctacatgctgacagccta-3'。thadh45’raceinnerprimer：5'-tggtacaccggcttcccacccaaaga-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3'。

pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段，利用切膠試劑盒回收后，連接于takara公司的pmd19-tsimplevector，轉化takara公司的top10大腸桿菌感受態(tài)，通過含有amp的lb篩選培養(yǎng)板進行篩選，將篩選出的單克隆菌落pcr檢測后送至金斯瑞公司測序鑒定。

將測序獲得的3'race及5’race產物利用bioedit軟件進行拼接，獲得含有1506bp堿基的目的基因，blast確認目的基因和水稻/擬南芥adh4基因高度同源，命名為thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其包含一個1212bp的完整編碼閱讀框，其所編譯表達蛋白序列如seqidno.2所示。

實施例2thadh4基因植物表達載體構建

利用gateway定向克隆技術，將目的基因片段轉移到目的表達載體上，包含bp反應和lr反應兩部分。本實施例所用的載體圖如圖1所示。

1）bp反應的目的是將基因片段轉移到入門載體上，反應體系：vectorthadh4orf片段10-20ng，saltsolution1μl，pcrtm8/gw/topotmvector（入門載體）1μl，加nuclease-freewater至總體積6μl，輕輕混勻，22℃反應60min后轉移至冰上；將前步6μl反應產物轉化到top10感受態(tài)細胞中，涂于lb篩選培養(yǎng)平板，挑取單克隆進行菌液pcr檢測，所用引物為基因特異性上游引物和載體上的t7引物，檢測后的陽性克隆進一步測序驗證。

2）lr反應的目的在于將已經重組入門載體的目標基因再克隆到目的載體中，反應體系：入門載體純化后的質粒100ng，目的載體（100ng/μl）1.5μl，lrclonaseiienzymemix2μl，加1×te（ph8.0）至總體積8μl，渦旋后短暫離心，25℃溫浴1h，加入1μlproteinaseksolution，混勻，37℃溫浴10min以終止反應；取2μllr反應產物轉化top10感受態(tài)細胞，涂于lb篩選培養(yǎng)平板，挑取單克隆進行菌液pcr檢測，所用引物為thadh4基因特異性上游引物和載體上的35s引物，檢測后的陽性克隆進一步測序驗證。驗證后，回收純化lr反應后的重組載體，即得到目的基因的表達載體，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3thadh4基因的遺傳轉化

通過液氮凍融法將thadh4基因轉化農桿菌，后用葉盤法轉化雜種山新楊。操作步驟：在eha105感受態(tài)細胞中加入至少100ng回收純化的表達載體，輕輕混勻，冰浴30min，液氮速凍1min，37℃熱擊3min，迅速置于冰上1-2min，加入800μllb培養(yǎng)基，28℃，100rmp復蘇3h，4000rmp離心3min，吸掉800μllb培養(yǎng)基，混勻剩余菌液，涂抹于含有抗生素的lb平板，28℃倒置培養(yǎng)30-48h，pcr檢測陽性克隆，將陽性克隆菌落擴繁，接種于120ml含相應抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃搖菌（220rmp）培養(yǎng)24h左右，至od600值約0.5，將菌液分裝于50ml的離心管中，1400rcf離心10min，收集菌體，用一定體積的ms（不加蔗糖）溶液重懸菌體至od600值0.5，乙酰丁香酮（as）至終濃度為20μm，25℃溫和振蕩（90rmp）菌液45min，將生長勢基本一致，4-6周的山新楊組培苗，取頂芽下的2-3片舒展的葉片，延葉的邊緣剪出傷口，片剪成大小合適的不等邊形，轉入制備好的浸染液中25℃溫和振蕩30min（250ml的三角瓶，90rmp），取出葉盤，用濾紙吸干殘余菌液，轉入不含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上暗培養(yǎng)48h，洗菌后轉入不含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上光培養(yǎng)1w，再將葉盤轉入入含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上，進行篩選培養(yǎng)，當葉盤邊緣長出抗性不定芽時，將其轉入含抗生素的ms2莖伸長培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，當抗性不定芽在莖伸長培養(yǎng)基中生長至1cm左右時，將其剪下轉入含有抗生素的ms培養(yǎng)平板上進行抗性植株生根篩選，從而獲得完整植株，扦插抗性植株的苗干于ms培養(yǎng)基上，進行插條的表型觀測。生長4w后，從圖2可以看出，thadh4的過量表達對植株的表型產生了一定的影響，較對照植株，轉基因植株生長速度變快，節(jié)間發(fā)生變異，節(jié)間長度明顯長于對照植株。

實施例4轉基因植株水淹脅迫后的分子檢測

對篩選培養(yǎng)基上表型發(fā)生變異的轉thadh4基因楊樹及對照楊樹進行沒頂淹水實驗，1w后對照楊樹葉片呈現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃，而轉基因楊樹未有明顯變化，取樣進行實時定量分子檢測。實時定量引物采用oligo6.6軟件設計，擴增產物長度156bp，引物tm值在60℃，引物序列：qadh4f:5'-cataatagagagcgtgg-3'qadh4r:5'-tgactgttctcatgatt-3'。實時定量pcr的內參基因采用已篩選出的18s基因。實時定量在abi7500realtimepcrsystems上完成，每反轉錄樣品三次重復，數(shù)據(jù)提取分析采用7500systemsdssoftware。反應體系如下：sybrpremixextaqtm（2×）10μl，pcrforwardprimer（10μm）0.4μl，pcrreverseprimer（10μm）0.4μl，roxreferencedyeⅱ（50×）0.4μl，dna模板2μl，dh2o6.8μl，總體積20μl。反應程序：94℃30s；94℃5s，60℃34s，95℃15s，40cycles；60℃1min，95℃15s。實時定量結果如圖3所示：水淹脅迫1w后，對照植株葉片呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，而轉基因植株長勢良好。thadh4基因的表達量在轉基因植株中較對照高出220倍-506倍，說明中山杉thadh4基因和耐水淹特性密切相關，預測其在林木基因工程領域將有重要的應用價值。

sequencelisting

<110>江蘇省中國科學院植物研究所

<120>一種調控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其應用

<130>100

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1506

<212>dna

<213>中山杉406

<400>1

gaaaaatgggggaaggattttgaggtttagcaattagaagagaactgcaaatctcaggtc60

gagaattctttttgacagtgttttctatccttcgatttttgctctgttgtttggacaatg120

gagatacagaatggaatagaaattgactctttcagtaagagttttcagagtacaaatggc180

aaagtccctctgtctcttgcagaaactgctggtaaagtcatcacttgcaaagctgcagta240

gcatggggagtgaagcaacctctggtaatagaagatgttcaggtggatcctccaaaatca300

atggaagtccgcattaaaatcacccacacctctctctgccacaccgatattacattctgg360

atgggaggggaagaaagcacgtttcctcgcatattgggccatgagggtgctggcataata420

gagagcgtgggtgagggcataacagatcttgtgcctggagatcacgtgattccaacatac480

caaggagagtgtagagattgtgggtgttgcaaatctaagaaaaccaatcagtgtgacaag540

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gattatgcttgtgttgtcaaaattaatcctaaagctcctttagacaaagcctgcttgctt720

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ctaagaggagcctcaaagataataggaatagataccaatccaaataagttcgccaaagcc900

aaagtattgggggtaaccgactgcatcaatccaaaagaccatgagaagcccattcaagaa960

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ggactggacgctagtcctcgcaagatatgcctccatcccttggaattattttcagggaga1140

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tcagaaatcaacaaagcatttgaattgttgttggaaggcaattgtttgagatgtgttctt1320

cacttctagacaaatttgaaggaatggaagatctatttctgaatggcagatagaaagaca1380

tttaggtagttggctaaaattacttctaaaacatgtgatggtcttaagaatgtccttgtg1440

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<210>2

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<212>prt

<213>中山杉406

<400>2

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151015

glnserthrasnglylysvalproleuserleualagluthralagly

202530

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354045

leuvalilegluaspvalglnvalaspproprolyssermetgluval

505560

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65707580

trpmetglyglyglugluserthrpheproargileleuglyhisglu

859095

glyalaglyileilegluservalglygluglyilethraspleuval

100105110

proglyasphisvalileprothrtyrglnglyglucysargaspcys

115120125

glycyscyslysserlyslysthrasnglncysasplysphelysile

130135140

aspilemetargthrvalmetargseraspglulysserargpheser

145150155160

leuglyglylysprovaltyrhisphemetalathrserthrpheser

165170175

glutyrthrvalvalasptyralacysvalvallysileasnprolys

180185190

alaproleuasplysalacysleuleuglycysglyvalalathrgly

195200205

pheglyalavalmetasnleuthraspilegluvalglyserthrval

210215220

alavalpheglyleuglythrvalglyleualavalalaglualaala

225230235240

serleuargglyalaserlysileileglyileaspthrasnproasn

245250255

lysphealalysalalysvalleuglyvalthraspcysileasnpro

260265270

lysasphisglulysproileglngluvalilealaglumetthrasn

275280285

glyglyvalasptyrserpheglucysileglyasnthrasnvalleu

290295300

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305310315320

leuglyleuaspalaserproarglysilecysleuhisproleuglu

325330335

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355360365

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370375380

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385390395400

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<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>正向引物

<400>3

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<212>dna

<213>artificial

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<223>正向引物

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<213>artificial

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ctgatctagaggtaccggatcc22

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<212>dna

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<220>

<223>thadh43'raceouterprimer

<400>6

taccgtcgttccactagtgattt23

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>artificial

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<223>genespecificouterprimer

<400>7

cctcaaagataataggaataga22

<210>8

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