本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中水稻對氮素吸收相關(guān)基因分子標記的應(yīng)用。具體的說，本發(fā)明涉及水稻氮高效利用相關(guān)基因qhn2的分子標記的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，稻米是世界半數(shù)以上人口的主要食糧。中國是世界上人口最多的國家，也是水稻種質(zhì)資源最豐富的國家之一。但是，我國也是世界上施用含氮化肥最多的國家，而水稻是我國消耗氮肥總量最多的作物。

研究表明，我國每公頃水稻生產(chǎn)的純氮肥施用量平均達199.3公斤，比世界平均水平的103公斤/公頃高94％。目前在我國水稻對氮肥的利用率平均僅在30％～40％之間，約有60％～70％的氮分別以no、n2o等形式排入環(huán)境而損失。排放到環(huán)境中的no、n2o嚴重地干擾了自然界中氮的良性循環(huán)，污染了大氣和河流及地下水。還有相當一部分的氮，通過食物鏈，作為人的排泄物進入生活污水，也造成嚴重的環(huán)境污染。同時，釋放的氧化亞氮與大氣平流層的臭氧發(fā)生反應(yīng)，高濃度的氨作為有毒物質(zhì)進入大氣，加劇全球氣候變暖過程。

據(jù)預(yù)測，到2025年世界人口將增加到100億，意味著在未來的8年內(nèi)糧食產(chǎn)量要相應(yīng)地增長才能滿足世界人口對糧食的需求，糧食需求的增長無疑對持續(xù)農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護的協(xié)調(diào)發(fā)展提出了重大的挑戰(zhàn)。同時，隨著氮肥生產(chǎn)所需的化石燃料生產(chǎn)成本的增加，糧食生產(chǎn)的經(jīng)濟投入也勢必相應(yīng)增加。因此，通過改善作物的氮素利用效率從而減少氮肥的使用不但具有現(xiàn)實的經(jīng)濟意義，更為重要的是，還具有重要的戰(zhàn)略意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定或輔助鑒定水稻對氮素利用的分子標記方法。通過檢測與水稻氮高效利用相關(guān)基因qhn2緊密連鎖的分子標記，可以確定水稻是否為氮高效利用的水稻品種，加快氮高效利用水稻新品種的選育進度。

本發(fā)明中所述氮高效利用水稻品種中的氮高效利用是相對于雜交稻親本水稻而言。如果兩個雜交親本水稻對氮素利用相同，所述氮高效利用水稻品種是指對氯酸鹽(硝酸鹽的毒性類似物)處理后的存活率可等于或低于雜交親本水稻的存活率；如果兩個雜交親本水稻對氮素的利用不同，所述氮高效利用水稻品種是指對氯酸鹽(硝酸鹽的毒性類似物)處理后的存活率可等于或低于兩個雜交親本水稻存活率較低的雜交親本水稻。

本發(fā)明中所述氮高效利用水稻品種是指對氯酸鹽處理后的存活率具體可小于40％。

本發(fā)明要解決的一個技術(shù)問題是如何鑒定或輔助鑒定水稻對氮素的利用。

為了實現(xiàn)以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下實驗步驟：

1)提取待測水稻的基因組dna；

2)用下表中的一對引物，對水稻基因組dna進行pcr擴增；

3)檢測pcr擴增產(chǎn)物，如果擴增出對應(yīng)大小的特異性分子標記片段，即184bp，則為氮高效利用水稻品種。

pcr反應(yīng)體系以20μl計為：10×pcrbuffer:2μl，dntp0.5μl，10mm引物f和r各0.5μl，dna聚合酶0.2μl，dna20ng，加ddh2o補足至20μl。

pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，16℃保溫。

本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是如何進行水稻育種。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:

1)所述分子標記r2id3262在水稻育種中的應(yīng)用。

2)上述鑒定或輔助鑒定水稻對氮素利用的方法在水稻育種中的應(yīng)用

3)水稻育種方法包括：用上述分子標記r2id3262擴增水稻基因組dna，選擇pcr擴增長度為184bp的水稻作為親本進行育種。

上述應(yīng)用中，所述水稻育種為培育氮高效利用水稻品種。

本發(fā)明中所述氮高效利用水稻品種是指對氯酸鹽處理后的存活率具體可小于40％。

上述3)中所述水稻的育種方法可用于培育氮高效利用水稻品種。用分子標記r2id3262擴增水稻基因組dna，通過pcr產(chǎn)物的大小來判斷是否為氮高效利用水稻品種。

實驗證明，用分子標記r2id3262擴增水稻基因組dna，91.84％的pcr擴增產(chǎn)物大小為184bp的水稻品種對氯酸鹽處理后的存活率都低于40％，而86.67％的pcr產(chǎn)物大小為148bp的水稻品種對氯酸鹽處理后的存活率都高于50％，說明本發(fā)明的r2id3262是水稻氮高效利用相關(guān)的分子標記，可用于水稻對氮素利用的早期預(yù)測和篩選，可用于水稻分子標記輔助選擇育種，可用于氮高效利用水稻的選育。r2id3262分子標記直接以dna的形式表現(xiàn)，在水稻的各個組織及各個發(fā)育階段均可檢測到，有利于更方便快捷的預(yù)測水稻對氮素的吸收。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中利用分子標記r2id3262檢測各供試水稻材料的電泳圖。

m：分子量marker；1-94分別為不同的水稻品種；箭頭所示為184bp的目的條帶。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、r2id3262是與水稻氮高效利用相關(guān)的分子標記

一、r2id3262的發(fā)現(xiàn)

對氯酸鹽不敏感的近等基因系與tq回交，獲得f2，將724個f2家系進行水培氯酸鹽處理，考察每個家系的存活率，也就是對氯酸鹽的敏感程度,進行qtl分析。最終將qhn2定位在32.34-32.62mb，區(qū)間為大小為280kb，其基因序列尚無相關(guān)報道。r2id3262是qhn2的連鎖indel分子標記。

二、氯酸鹽處理表1中的94個水稻品種

搜集94個國內(nèi)外水稻品種，其種質(zhì)資源可從中國作物種質(zhì)資源信息網(wǎng)獲取(http://icgr.caas.net.cn/pztest.htm)，部分材料具體信息可在正式出版著作(中國稻種資源及其核心種質(zhì)研究與利用，李自超，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社；第1版，2013年5月1日)中查詢，品種詳細信息如表1所示。將94個水稻品種分三個重復(fù)進行水培實驗,每個品種8株為一個重復(fù)。水培條件：2mmkno3,1mmkcl,0.36mmcacl2,0.54mmmgso4,0.18mmkh2po4,40umfe(ⅱ)-edta,18.8umh3bo3,13.4ummncl2,0.32umcuso4,0.3umznso4,0.03umna2moo4,ph:6.0。12小時光照(28℃)、12小時黑暗(25℃)。94個品種的種子在水中浸泡兩天，催芽兩天，播種到96孔去底的pcr板上，幼苗正常生長一周后用2mm的氯酸鉀(硝酸鹽毒性類似物)處理4天，再用正常水培液恢復(fù)5天，統(tǒng)計幼苗存活率，結(jié)果如(表1)所示。氮高效利用率越高，對氯酸鹽越敏感，存活率越低。

如圖1所示為本發(fā)明實施例中利用分子標記r2id3262檢測各供試水稻材料的電泳圖。其中，m：分子量marker；1-94分別為不同的水稻品種；箭頭所示為184bp的目的條帶。

三、分子標記r2id3262檢測表1中94個水稻品種的pcr產(chǎn)物大小

從表1的94個水稻品種的葉片中提取基因組dna，用seqidno.1和seqidno.2所示的特異性引物對其進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測pcr擴增產(chǎn)物的大小。94個水稻品種的pcr擴增產(chǎn)物大小結(jié)果如表1所示。表1結(jié)果表明，有49個水稻品種的pcr擴增產(chǎn)物大小為184bp，其中有45個水稻品種經(jīng)氯酸鹽處理后的存活率均低于40％；94個水稻品種中的另外45個水稻品種的pcr擴增產(chǎn)物均為148bp，其中有39個水稻品種經(jīng)氯酸鹽處理后的存活率均高于50％。因此，91.84％的pcr擴增產(chǎn)物大小為184bp的水稻品種為氮高效利用品種，86.67％的pcr擴增產(chǎn)物大小為148bp的水稻品種為氮低效利用品種。說明本發(fā)明的r2id3262是水稻氮高效利用相關(guān)的分子標記，可用于水稻氮素利用的早期預(yù)測和篩選。表1為94個水稻品種的r2id3262擴增產(chǎn)物大小及氮素高效利用率圖。

表1、94個水稻品種的r2id3262擴增產(chǎn)物大小及氮素高效利用率

表2按r2id3262擴增產(chǎn)物大小統(tǒng)計的94個水稻品種在氯酸鹽處理后的存活率

序列表

<110>中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院

<120>水稻氮高效利用相關(guān)基因qhn2的分子標記的應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcctcttttggatccggac19

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<213>人工序列

<400>2

caacggcacaagcccaaac19