本發(fā)明涉及生物技術(shù)及作物病害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及zmpgk基因在玉米矮花葉病防治中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米是我國主要糧食作物，但由甘蔗花葉病毒(sugarcanemosaicvirus，scmv)侵染引起的玉米矮花葉病(maizedwarfmosaicdisease,mdmd)對(duì)我國玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。scmv是造成我國北方玉米產(chǎn)區(qū)玉米矮花葉病的主要病原，常引起玉米30％以上的產(chǎn)量損失。由于scmv強(qiáng)致病力株系的出現(xiàn)，一些原有的抗病毒品種喪失抗性，在生產(chǎn)上導(dǎo)致更大的危害。亟需鑒定新的抗病基因或抗性材料，以便可持續(xù)、更有效地控制scmv及其危害，保證玉米生產(chǎn)安全。

植物病毒作為一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生物，在侵染、增殖過程中必須依賴和借助寄主因子完成病毒脫殼、基因組復(fù)制、蛋白表達(dá)、病毒顆粒組裝和向鄰近細(xì)胞移動(dòng)等生命過程。因此，鑒定參與植物病毒侵染、增殖過程中的寄主因子能夠幫助我們深入了解病毒的侵染和致病機(jī)制，從而為病毒病的防控提供新的材料和理論基礎(chǔ)。后基因組時(shí)代，各種組學(xué)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于寄主與生物脅迫或非生物脅迫互作研究，并已成為探尋病毒致病機(jī)制及尋找抗病基因的主要手段之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供zmpgk基因在玉米矮花葉病防治中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制甘蔗花葉病毒在玉米中復(fù)制和增殖的方法。

本發(fā)明利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification,itraq)蛋白組學(xué)技術(shù)，篩選scmv侵染玉米后上部第一片和第二片系統(tǒng)侵染葉片中顯著差異表達(dá)的蛋白，鑒定到一個(gè)在兩片葉片中均顯著差異表達(dá)的蛋白zmpgk。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供zmpgk基因在玉米矮花葉病防治中的應(yīng)用，其是利用基因工程的方法，通過抑制zmpgk基因在玉米中的表達(dá)，從而提高作物對(duì)玉米矮花葉病的抗病性。

本發(fā)明所述玉米矮花葉病是指由scmv侵染引起的玉米矮花葉病害。

本發(fā)明中，zmpgk基因來自玉米，所述zmpgk基因?yàn)椋?/p>

i)seqidno:2所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:2第234-1439位所示的核苷酸序列；或

iii)seqidno:2第234-1442位所示的核苷酸序列；或

iv)在嚴(yán)格條件下與i)～iii)任一序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴(yán)格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

v)與i)～iii)任一序列具有90％以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

由所述zmpgk基因編碼的蛋白為：

a)seqidno:1所示的氨基酸序列；或

b)seqidno:1所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

前述應(yīng)用包括向玉米中導(dǎo)入用于抑制所述zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)。

本發(fā)明中，所述用于抑制zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)包括但不限于shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反義rna/dna。

優(yōu)選地，所述用于抑制zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)是由seqidno:2第990-1200位所示的核苷酸序列編碼的rna。

更優(yōu)選地，所述用于抑制zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)是攜帶有由seqidno:2第990-1200位所示核苷酸序列編碼的rna的重組雀麥花葉病毒。

當(dāng)用于抑制所述zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)為核酸分子時(shí)，含有編碼所述核酸分子的dna片段的載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

攜帶有所述目的片段的表達(dá)載體可通過使用ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463頁；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本發(fā)明還提供一種抑制甘蔗花葉病毒在玉米中復(fù)制和增殖的方法，其是向玉米中導(dǎo)入用于抑制zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)，從而抑制甘蔗花葉病毒在玉米中的復(fù)制和增殖。

本發(fā)明還提供一種用于防治玉米矮花葉病的藥劑或組合物，其活性成分為抑制zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于抑制甘蔗花葉病毒在玉米中復(fù)制和增殖的藥劑或組合物，其活性成分為抑制zmpgk基因表達(dá)的物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，抑制zmpgk基因在玉米中表達(dá)的具體方法如下：

1、提取玉米自交系va35的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna。

2、以步驟1得到的cdna為模板，用zmpgk-silencing-f和zmpgk-silencing-r組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

zmpgk-silencing-f：5'-gacctaggtctcttattgagaaggc-3'

zmpgk-silencing-r：5'-tcccatggggccgttccaaat-3'

3、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切步驟2的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切載體pc13/f3-13m，回收約5000bp的載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pc13/f3-13m-pgk。

6、將重組載體pc13/f3-13m-pgk和載體pc13/f1+2共轉(zhuǎn)染本生煙葉片，培養(yǎng)后得到含有重組雀麥花葉病毒(bromemosaicvirus,bmv)的病毒粒子的葉片。

7、從步驟6的煙草葉片中提純重組bmv病毒粒子。

8、在兩葉期，選取生長(zhǎng)良好的且第2片葉(第一片真葉)基本完全展開的va35玉米苗，在第2片葉上撒上少許金剛砂，用提純的重組bmv病毒粒子進(jìn)行摩擦接種，進(jìn)而瞬時(shí)沉默zmpgk基因。

在玉米葉片中瞬時(shí)沉默zmpgk基因后接種scmv，雖然其發(fā)病時(shí)間與在未沉默zmpgk基因的玉米葉片上接種scmv的發(fā)病時(shí)間和侵染癥狀無明顯差異，但沉默zmpgk基因后顯著抑制了scmv的積累(表現(xiàn)在scmv基因組rna水平和cp的蛋白水平均顯著降低)。由此推測(cè)，zmpgk可能是scmv侵染過程中必要的寄主因子，在侵染過程中被病毒招募，參與scmv復(fù)制增殖過程，是玉米編碼的抗scmv的隱性抗病毒基因。zmpgk基因可能在防治由scmv引起的玉米矮花葉病害中發(fā)揮重要作用。

本發(fā)明首次通過基因功能試驗(yàn)和驗(yàn)證，沉默zmpgk基因?qū)е铝藄cmv復(fù)制和增殖水平顯著降低，表明玉米蛋白zmpgk及其編碼基因在scmv侵染、增殖中發(fā)揮重要作用，是玉米編碼的抗scmv的隱性抗病毒基因，可以用于玉米抗scmv的分子育種等工作。本發(fā)明將為研究植物蛋白在病毒侵染中的作用，玉米抗病毒育種等領(lǐng)域提供依據(jù)，提高我國玉米抗病毒研究水平，促進(jìn)和保證我國玉米生產(chǎn)安全。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中scmv在沉默zmpgk玉米植株上的侵染表型；其中，bmv-pgk為zmpgk基因沉默植株，bmv-gfp為對(duì)照。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中沉默zmpgk基因抑制了scmv在玉米植株中的復(fù)制和增殖；其中，(a)scmv接種后7天和14天，zmpgk在對(duì)照組(bmv-gfp)和處理組(bmv-pgk)系統(tǒng)侵染的葉片中相對(duì)積累量；(b)scmv基因組rna相對(duì)積累量；(c)scmvcp相對(duì)積累量；(d)利用imagej軟件對(duì)scmvcp相對(duì)積累量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

圖2(c)中cbb表示考馬斯亮藍(lán)染色；將對(duì)照組的積累量設(shè)定為1，0.676和0.768分別表示處理組中蛋白相對(duì)于對(duì)照組的積累量。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

本發(fā)明中使用的生物材料如下：

玉米自交系va35：參見dingxs,schneiderwl,chaluvadisr,etal.characterizationofabromemosaicvirusstrainanditsuseasavectorforgenesilencinginmonocotyledonoushosts.molplant-microbeinteract,2006,19:1229-1239.

本生煙：參見goodinmm,zaitlind,naiduraetal.nicotianabenthamiana:itshistoryandfutureasamodelforplant-pathogeninteractions.molplant-microbeinteract,2008,21(8):1015-1026。

載體pc13/f1+2：參見zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

載體pc13/f3-13m-gfp：參見zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

載體pc13/f3-13m：參見zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

載體pc13/f1+2和載體pc13/f3-13m共轉(zhuǎn)染煙草后，表達(dá)雀麥花葉病毒(bmv)的病毒粒子。雀麥花葉病毒的病毒粒子由三條rna鏈組成,載體pc13/f1+2含有rna1和rna2，載體pc13/f3-13m含有rna3，二個(gè)載體共轉(zhuǎn)染煙草后擴(kuò)繁bmv的重組病毒粒子。

甘蔗花葉病毒(scmv)：參見fanzf,chenhy,liangxm,etal.completesequenceofthegenomicrnaoftheprevalentstrainofapotyvirusinfectingmaizeinchina.archvirol,2003,148:773-782。

實(shí)施例1zmpgk蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)

利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification,itraq)蛋白組學(xué)技術(shù)和方法，篩選scmv侵染玉米后上部第一片和第二片系統(tǒng)侵染葉片中顯著差異表達(dá)的蛋白，鑒定到一個(gè)在兩片葉片中均顯著差異表達(dá)的蛋白zmpgk，序列如seqidno:1所示。將編碼zmpgk蛋白的基因命名為zmpgk基因，序列如seqidno:2所示。

實(shí)施例2構(gòu)建重組質(zhì)粒pc13/f3-13m-pgk

1、提取玉米自交系va35的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna。

2、以步驟1得到的cdna為模板，用zmpgk-silencing-f和zmpgk-silencing-r組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

zmpgk-silencing-f：5'-gacctaggtctcttattgagaaggc-3'

zmpgk-silencing-r：5'-tcccatggggccgttccaaat-3'

3、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切步驟2的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切載體pc13/f3-13m，回收約5000bp的載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pc13/f3-13m-pgk。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組載體pc13/f3-13m-pgk進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在載體pc13/f3-13m的ncoi和avrii酶切位點(diǎn)插入了seqidno:2第990-1200位所示的雙鏈dna分子。

zmpgk基因的瞬時(shí)沉默載體由重組載體pc13/f3-13m-pgk、載體pc13/f1+2組成。

實(shí)施例3zmpgk基因的瞬時(shí)沉默實(shí)驗(yàn)

一、在本生煙中擴(kuò)繁bmv的病毒粒子

1、用攜帶bmv載體的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)本生煙

(1)將測(cè)序正確的pc13/f3-13m-pgk載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌c58c1感受態(tài)細(xì)胞中；同時(shí)將-80℃保存的攜帶pc13/f1+2和pc13/f3-13m-gfp的農(nóng)桿菌菌種于lb平板(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)上劃線，28℃培養(yǎng)48h左右。挑取lb平板上的單菌落接種于3～4ml的lb液體培養(yǎng)基(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)中，28℃，180rpm培養(yǎng)14～18h；

(2)按1:100的比例取200～300μl的菌液轉(zhuǎn)接于20～30mllb液體培養(yǎng)基(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)中，28℃，180rpm培養(yǎng)10～12h；

(3)室溫，4500rpm離心8min收集菌體，用20ml浸潤(rùn)緩沖液(10mmmes，ph5.7，10mmmgcl2，200μm乙酰丁香酮)懸浮沉淀，用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的濃度，用浸潤(rùn)緩沖液調(diào)整菌懸液濃度至最終濃度為od600＝2.0。

(4)將攜帶pc13/f1+2的菌懸液分別和等體積的攜帶pc13/f3-13m-pgk與pc13/f3-13m-gfp的菌懸液混勻后，室溫放置3h。用無針頭的1ml注射器浸潤(rùn)本生煙葉片的下表皮。

(5)浸潤(rùn)后的本生煙置于22～24℃的人工氣候室中培養(yǎng)3天后取樣，取樣時(shí)將樣品用錫箔紙包好迅速置于液氮中冷凍，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、zmpgk插入片段的檢測(cè)

取0.1g左右的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的本生煙葉片，用trizol法提取煙草葉片的總rna，用oligodt(5'-tttttttttttttttttt-3')引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板用引物xsd198/199(xsd198：5'-cttgtgttgctgagaaac-3'；xsd199：5'-tcttgtaagaggtctgc-3')進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，用pc13/f3-13m空載體質(zhì)粒為對(duì)照，檢測(cè)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的本生煙葉片中重組bmv病毒攜帶的外源插入片段是否發(fā)生丟失。將攜帶完整外源插入片段的bmv重組病毒的煙草葉片，在液氮中研磨，磨成粉末后分裝到2ml離心管中(每管0.4g左右)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、bmv病毒粒子的粗提純

(1)取適量(根據(jù)需接種的玉米植株數(shù)量而定)的-80℃保存的煙草葉片樣品粉末，每管中加入800μlbmv提取緩沖液，混勻后置冰上孵育20～30min；

(2)4℃，8000g離心10min，取上清，按照每200μl上清液加入46μl40％peg/nacl溶液的比例加入相應(yīng)體積的40％peg/nacl溶液，充分混勻后置于冰上，在搖床上低轉(zhuǎn)速孵育1h；

(3)4℃，13000g離心15min，棄上清，每管用100μlbmv儲(chǔ)存緩沖液懸浮沉淀，即得到粗提純的bmv病毒粒子，用于后續(xù)的摩擦接種實(shí)驗(yàn)。

4、病毒粒子接種va35玉米和挑戰(zhàn)接種scmv

用nanodrop^tm分光光度計(jì)檢測(cè)bmv病毒粒子的濃度，od260的值約等于病毒粒子的濃度(μg/μl)。在兩葉期，選取生長(zhǎng)良好的且第2片葉(第一片真葉)基本完全展開的va35玉米苗，在第2片葉上撒上少許金剛砂，每棵用20μg粗提純的bmv病毒粒子進(jìn)行摩擦接種。bmv-pgk與bmv-gfp(作為對(duì)照)接種相同數(shù)量的植株。將接種后的玉米植株置于透光的塑料罩內(nèi)，在18～20℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天后移去塑料罩，在第二片葉(第一片真葉)挑戰(zhàn)接種scmv，并將接種后的植物置于24℃/22℃光照培養(yǎng)箱或人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于scmv接種后7天和14天檢測(cè)目標(biāo)基因的沉默效率和對(duì)應(yīng)的scmvrna和cp(外殼蛋白)的積累量。

二、瞬時(shí)沉默zmpgk基因降低了scmv復(fù)制和積累水平

1、病毒粒子接種va35玉米和挑戰(zhàn)接種scmv

用nanodrop^tm分光光度計(jì)檢測(cè)bmv病毒粒子的濃度，od260的值約等于病毒粒子的濃度(μg/μl)。在兩葉期，選取生長(zhǎng)良好的且第2片葉(第一片真葉)基本完全展開的va35玉米苗，在第2片葉上撒上少許金剛砂，每棵用20μg粗提純的bmv病毒粒子進(jìn)行摩擦接種。bmv-pgk與bmv-gfp(作為對(duì)照)接種相同數(shù)量的植株。將接種后的玉米植株置于透光的塑料罩內(nèi)，在18～20℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天后移去塑料罩，在第二片葉(第一片真葉)挑戰(zhàn)接種scmv，并將接種后的植物置于24℃/22℃光照培養(yǎng)箱或人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于scmv接種后7天和14天檢測(cè)目標(biāo)基因的沉默效率和對(duì)應(yīng)的scmvrna和cp的積累量。

2、scmv接種后第7天和第14天，取上部第二片系統(tǒng)侵染葉片，提取總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna作為模板，采用康為世紀(jì)熒光定量pcr試劑和，采用ubiquitin基因作為內(nèi)參基因，rt-qpcr鑒定zmpgk基因的相對(duì)表達(dá)量和scmv基因組rna的含量，采用ubiquitin基因作為內(nèi)參基因。

用于鑒定zmpgk基因的引物對(duì)如下：

zmpgk-qrt-f：5'-aaggctaaggtttactcctccaca-3'

zmpgk-qrt-r：5'-aattccagtcacttcacccaca-3'

用于鑒定ubiquitin基因的引物對(duì)如下：

ubi-qrt-f：5'-ggaaaaaccataaccctgga-3'

ubi-qrt-r：5'-atatggagagagggcaccag-3'

用于鑒定scmv的引物對(duì)如下：

scmv-cp-qrt-f：5'-ggcgagactcaggagaataca-3'

scmv-cp-qrt-r：5'-acacgctacaccagaagacact-3'

得到的數(shù)據(jù)用2^-△△ct法進(jìn)行分析，步驟如下：

首先，對(duì)實(shí)驗(yàn)組樣本(test)和對(duì)照組樣本(calibrator)，用參照基因(ref)的ct值歸一目標(biāo)基因(target)的ct值：

△ct(test)＝ct(target,test)-ct(ref,test)

△ct(calibrator)＝ct(target,calibrator)-ct(ref,calibrator)

其次，用對(duì)照組樣本的△ct值歸一實(shí)驗(yàn)組樣本的△ct值：

△△ct＝△ct(test)－△ct(calibrator)

最后，計(jì)算表達(dá)水平比率：

2^-△△ct＝表達(dá)量的比值

scmv基因組rna的相對(duì)含量見圖2(b)，zmpgk基因的相對(duì)表達(dá)量見圖2(a)。

結(jié)果表明，scmv接種后第7天和第14天，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組zmpgk積累量分別下降了約60％和65％左右，scmv基因組rna的積累量均為對(duì)照組的60％左右。scmvcp的積累量分別為對(duì)照組的0.7和0.8倍。

5、scmv接種后第7天和第14天，取上部第二片系統(tǒng)侵染葉片，提取總蛋白，以scmvcp抗血清為一抗，ap標(biāo)記的羊抗兔為二抗，進(jìn)行westernblot分析，見圖2(c)和圖2(d)。結(jié)果表明，結(jié)果表明，在zmpgk沉默效率分別約為60％和65％的植株上，scmvcp的積累量明顯減少，僅為對(duì)照組的0.7倍和0.8倍。

以上結(jié)果表明，在玉米葉片中瞬時(shí)沉默zmpgk基因后接種scmv，雖然其發(fā)病時(shí)間與在未沉默zmpgk基因的玉米葉片上接種scmv的發(fā)病時(shí)間和侵染癥狀無明顯差異(圖1)，但沉默zmpgk基因?qū)е铝藄cmv復(fù)制和增殖水平顯著降低(圖2)，表明玉米蛋白zmpgk及其編碼基因在scmv侵染、增殖中發(fā)揮重要作用，是玉米編碼的抗scmv的隱性抗病毒基因，可以用于玉米抗scmv的分子育種等工作。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>zmpgk基因在玉米矮花葉病防治中的應(yīng)用

<130>khp171112947.3

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>402

<212>prt

<213>玉米

<400>1

metalathrlysargservalglythrleuglyglualaaspleulys

151015

glylyslysvalphevalargalaaspleuasnvalproleuaspasp

202530

alaglnlysilethraspaspthrargileargalaservalprothr

354045

ilelyspheleuleuglulysglyalalysvalileleualaserhis

505560

leuglyargprolysglyvalthrprolystyrserleulysproleu

65707580

valproargleusergluleuleuglyvalgluvalvalmetalaasn

859095

aspcysileglyglugluvalglulysleualaalaalaleuproglu

100105110

glyglyvalleuleuleugluasnvalargphetyrlysglugluglu

115120125

lysasngluprogluphealalyslysleualaservalalaaspleu

130135140

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