本發(fā)明涉及應用重組dna技術(shù)生產(chǎn)基因工程蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高效重組人皮膚橋蛋白成熟肽段(rhdpt)及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

皮膚橋蛋白(dermatopontin,dpt)基因定位于人染色體1q12-1q23，它是由183個氨基酸殘基構(gòu)成的分泌型蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量為22kda。dpt中富含絡(luò)氨酸殘基且1/2被硫酸化，絡(luò)氨酸的硫酸化可能與dpt對膠原纖維形成的影響和其與細胞表面受體的結(jié)合有關(guān)。dpt在哺乳動物的組織中分布廣泛，豬和嚙齒類動物的皮膚、骨骼、心、肺、腎、軟骨、骨中均有dpt存在，人體中的dpt主要分布于肌肉、心臟、胰腺、肺等組織的成纖維細胞中。最新的研究發(fā)現(xiàn)dpt在哺乳動物的皮膚、角膜、前列腺等組織的細胞外基質(zhì)中也有分布。

dpt的生理功能主要與細胞粘附相關(guān)，lewandowska等人用balb/c3t3細胞及胎牛和人的皮膚成纖維細胞研究發(fā)現(xiàn)，dpt有促進這3種細胞粘附的活性。體外研究發(fā)現(xiàn)dpt可促進膠原纖維的形成，并使新形成的膠原纖維更加穩(wěn)定。dpt的表達主要受tgfβ和il-4的調(diào)節(jié)，tgfβ可使dpt的mrna和蛋白水平同時升高而il-4的作用則與之相反。dpt與tgfβ結(jié)合后可增強tgfβ的活性，包括抑制內(nèi)皮細胞和上皮細胞的增生、調(diào)節(jié)多種細胞的分化、促進膠原蛋白和蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)蛋白表達的作用。dpt的異常表達與心肌梗死、子宮平滑肌瘤、前列腺癌等疾病密切相關(guān)。最新研究報道發(fā)現(xiàn)dpt可在體外維持造血干細胞的擴增，此外真皮細胞分泌的dpt可通過促進角質(zhì)化細胞的遷移的方式促進傷口的愈合。

總之，dpt是廣泛存在于細胞基質(zhì)中的一種重要分泌蛋白，通過核心蛋白多糖、tgfβ、ⅰ型膠原蛋白等作用具有細胞粘附、促進膠原纖維形成等功能，在多種和細胞外基質(zhì)相關(guān)的生理和病理過程中發(fā)揮作用，然而dpt在和胞外基質(zhì)相關(guān)的生理和病理過程中的作用機制仍有待深入研究。目前，還沒有dpt在體外大量表達純化的相關(guān)報導。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效穩(wěn)定生產(chǎn)重組人皮膚橋蛋白成熟肽段的方法，根據(jù)該方法可穩(wěn)定高水平分泌表達rhdpt，且其是經(jīng)糖基化修飾的rhdpt糖蛋白，還具有很好的生物學活性。

解決上述技術(shù)問題的具體技術(shù)方案如下：

一種重組人皮膚橋蛋白成熟肽段的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：

(1)制備質(zhì)粒rhdpt/pmd-20t：獲得堿基序列如seqidno.1所示的人dpt基因，將所述人dpt基因連接到pmd-20t載體，得質(zhì)粒rhdpt/pmd-20t；

(2)構(gòu)建重組載體ppiczαa/dpt：將ppiczαa原始載體和所述質(zhì)粒rhdpt/pmd-20t分別用ecorⅰ和notⅰ進行雙酶切，再純化回收，將回收的ppiczαa載體基因片段與rhdpt基因片段用solutionⅰdna連接酶連接，得重組載體ppiczαa/dpt；

(3)轉(zhuǎn)化重組載體至真核酵母宿主中：將所述重組載體ppiczαa/dpt用sacⅰ單酶切線性化，再轉(zhuǎn)入畢氏酵母x-33宿主中，再經(jīng)過含zeocin的ypdz平板篩選得到陽性克隆；

(4)高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選：將所述陽性克隆轉(zhuǎn)接至含zeocin的ypdz平板中，利用zeocin濃度梯度篩選得到高抗性酵母轉(zhuǎn)化子，再用bmgy培養(yǎng)基培養(yǎng)，甲醇誘導，得高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子；

(5)純化：用鎳親和層析柱對rhdpt進行純化，得重組蛋白rhdpt。

在其中一些實施例中，步驟(4)所述高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選的具體方法為：將所述陽性克隆轉(zhuǎn)接至含zeocin的ypdz平板中，利用zeocin濃度梯度篩選得到高抗性酵母轉(zhuǎn)化子，再用bmgy培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心收集細胞，用bmmy培養(yǎng)基重懸細胞，得細胞液，并調(diào)節(jié)所述細胞液中甲醇終濃度為0.95-1.05％，誘導70-74h，得高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子。

在其中一些實施例中，步驟(4)所述的zeocin濃度梯度篩選的具體方法為：將所述陽性克隆轉(zhuǎn)接至含有490-510μg/mlzeocin的ypdz平板中，篩選到抗性為500μg/mlzeocin的酵母轉(zhuǎn)化子，再將所述酵母轉(zhuǎn)化子用新鮮的ypd液體培養(yǎng)基洗下，經(jīng)稀釋后涂布到含有1490-1510μg/mlzeocin的ypdz平板中，再將含有1490-1510μg/mlzeocin的ypdz平板中生長的酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)稀釋后涂布到含有2990-3010μg/mlzeocin的ypdz平板中，篩選得到抗性為3000μg/mlzeocin的高抗性酵母轉(zhuǎn)化子。

在其中一些實施例中，步驟(4)所述的誘導的時間為72h。

在其中一些實施例中，步驟(4)所述的誘導的溫度為28℃-32℃。

在其中一些實施例中，步驟(4)所述的誘導的轉(zhuǎn)速為180-220rpm。

在其中一些實施例中，步驟(5)所述的純化的具體方法為：將所述高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子進行擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清液先用緩沖液a透析，再利用鎳親和層析柱于akta-hplc系統(tǒng)中純化，即得；所述緩沖液a為含有0.2mnacl、50mm咪唑、20mmtris的緩沖液，其ph為8.0。

在其中一些實施例中，利用鎳親和層析柱于akta-hplc系統(tǒng)中純化時，先用緩沖液a漂洗，再利用緩沖液b線性洗脫，收集mau大于100的洗脫液，即得；所述緩沖液b為含有0.2mnacl、0.5m咪唑、20mmtris的緩沖液，其ph為8.0。

在其中一些實施例中，步驟(3)所述的ypdz平板中zeocin的濃度為95-105μg/ml。

本發(fā)明還提供了一種重組人皮膚橋蛋白成熟肽段。

具體技術(shù)方案如下：

根據(jù)上述生產(chǎn)方法制備得到的重組人皮膚橋蛋白成熟肽段。

本發(fā)明的重組人皮膚橋蛋白成熟肽段及其生產(chǎn)方法具有以下優(yōu)點和有益效果：

(1)本發(fā)明所述方法經(jīng)發(fā)明人大量的實驗和研究，得出：以如seqidno.1所示的人dpt基因為外源基因，首次利用畢氏酵母x-33成功實現(xiàn)了rhdpt的大量穩(wěn)定高效表達，具體為：將dpt基因放入原始載體ppiczαa，并以畢氏酵母x-33為宿主菌，實現(xiàn)了rhdpt的大量高效穩(wěn)定表達；該方法既能夠防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解、減輕宿主細胞代謝負荷以及表達產(chǎn)物對宿主的毒性作用，還可促進分泌蛋白按適當?shù)姆绞秸郫B、恢復其天然構(gòu)象。

(2)采用本發(fā)明所述生產(chǎn)方法制得的表達產(chǎn)物帶有his及c-myc標簽，易于純化和檢測表達產(chǎn)物，且其具有良好的生物活性。

附圖說明

圖1為真核表達載體ppiczαa/rhdpt的構(gòu)建示意圖；

圖2為rhdpt的鎳親和層析柱純化色譜圖；

圖3為純化的rhdpt蛋白sds-page電泳結(jié)果圖，其中ds和dl均為rhdpt；

圖4為rhdpt條帶的質(zhì)譜分析結(jié)果；其中a為rhdptds條帶質(zhì)譜分析結(jié)果；b為rhdptdl條帶質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖5為rhdpt對3t3-l1細胞增殖的影響結(jié)果示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明選用的畢氏酵母x-33菌株，整合性表達質(zhì)粒ppiczαa載體均購自美國invitrogen公司。

本發(fā)明所述的人工合成的人皮膚橋蛋白cdna，購自南京金斯瑞公司；其5’端引入ecor1酶切位點，3’端引入not1酶切位點，序列如seqidno.1所示；

seqidno.1：

atggacctcagtcttctctgggtacttctgcccctagtcaccatggcctggggccagtatggcgattatggatacccataccagcagtatcatgactacagcgatgatgggtgggtgaatttgaaccggcaaggcttcagctaccagtgtccccaggggcaggtgatagtggccgtgaggagcatcttcagcaagaaggaaggttctgacagacaatggaactacgcctgcatgcccacaccacagagcctcggggaacccacggagtgctggtgggaggagatcaacagggctggcatggaatggtaccagacgtgctccaacaatgggctggtggcaggattccagagccgctacttcgagtcagtgctggatcgggagtggcagttttactgttgtcgctacagcaagaggtgcccatattcctgctggctaacaatagaatatccaggtcactatggtgaggaaatggacatgatttcctacaattatgattactatatccgaggagcaacaaccactttctctgcagtggaaagggatcgccagtggaagttcataatgtgccggatgactgaatacgactgtgaatttgcaaatgtttag

本發(fā)明所用培養(yǎng)基配方如下：

1)酵母生長培養(yǎng)基(bmgy)：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容至700ml。121℃蒸汽高壓滅菌15-20min，冷卻至室溫，加入100ml1m磷酸鉀溶液，100mlynb，2ml500*biotin，100ml10*gy；

2)酵母誘導培養(yǎng)基(bmmy)：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容至700ml。121℃蒸汽高壓滅菌15-20min，冷卻至室溫，加入100ml1m磷酸鉀溶液，100mlynb，2ml500*biotin，100ml10*m；

3)ypd液體培養(yǎng)基：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，10g葡糖糖，定容到1000ml，121℃蒸汽高壓滅菌15-20min。(ypd固體培養(yǎng)基：向ypd液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂即可)。

以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1

本實施例一種高效rhdpt的表達純化方法，主要包括以下步驟：

1、克隆rhdpt全基因：

設(shè)計一對dpt特性擴增引物，以人工合成的dptcdna為模板特異性擴增出完整人皮膚橋蛋白成熟肽基因片段(rhdpt基因)，所述rhdpt基因的5’端引入ecor1酶切位點，3’端引入not1酶切位點(引入酶切位點的rhdpt基因的堿基序列如seqidno.1所示)以便后續(xù)對該rhdpt基因片段插入表達載體；pcr條件為：95℃預變性，5min，一個熱循環(huán)；95℃熱變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個熱循環(huán)；72℃復性10min。瓊脂糖電泳回收擴增rhdpt基因片段，將rhdpt基因片段連接到pmd-20t載體(購自廣州takara公司)，得質(zhì)粒rhdpt/pmd-20t，酶切和核酸測序鑒定，測定序列與genebank公布的dpt序列一致。

所述dpt特性擴增引物為：

dptfor：5’-gaattccagtatggcgattatggatac-3’，

dptfor：5’-gcggccgcaacatttgcaaattcacag-3’。

2、構(gòu)建畢氏酵母分泌型表達載體ppiczαa/rhdpt：

1)用ecorⅰ和notⅰ雙酶切重組質(zhì)粒pmd-20t/rhdpt，獲得目的基因片段rhdpt，反應體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購于thermo公司)：

2)用ecorⅰ和notⅰ雙酶切重組質(zhì)粒ppiczαa，獲得載體基因片段ppiczαa，反應體系如下(所用內(nèi)切酶及緩沖液均購于thermo公司)：

3)將1)、2)步驟所得的目的基因片段和載體基因片段用dna凝膠回收試劑盒進行純化回收，該試劑盒購自magen公司，具體操作按試劑盒說明書進行。

4)回收到的目的基因片段rhdpt和載體基因片段ppiczαa用solutionⅰ連接酶(購自大連takara公司，是takara公司的預混連接酶，與t4連接酶是同類產(chǎn)品)進行連接反應，目的基因rhdpt插入到含有分泌信號α-因子的分泌型載體ppiczαa的讀碼框內(nèi)，構(gòu)建示意圖見圖1(如圖所示，表達的重組蛋白含有6*his標簽和c-myc標簽)，反應體系如下：

載體ppiczαa基因片段0.5μl

rhdpt目的基因片段4.5μl

solutionⅰ5μl

得到重組載體ppiczαa/rhdpt。

3、轉(zhuǎn)化重組載體ppiczαa/rhdpt至畢氏酵母x-33：

將10μg經(jīng)ecorⅰ和notⅰ雙酶切驗證的ppiczαa/rhdpt重組載體sacⅰ線性化后溶解在50μlmilliq水中，按照invitrigen公司操作手冊licl轉(zhuǎn)化法將重組載體ppiczαa/rhdpt轉(zhuǎn)化到宿主畢氏酵母菌x-33中。轉(zhuǎn)化后用含100μg/mlzeocin抗生素的ypdz平板進行陽性克隆篩選。

4、高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子的篩選：

將陽性克隆轉(zhuǎn)接至含有500μg/mlzeocin的ypdz平板，篩選到了zeocin抗性的酵母轉(zhuǎn)化子；將含有500μg/mlzeocin的ypdz平板中的酵母轉(zhuǎn)化子利用新鮮的ypd液體培養(yǎng)基將ypdz平板的菌落洗下，經(jīng)稀釋后，涂布到含有1500μg/mlzeocin的ypdz平板中，再將含有1500μg/mlzeocin的ypdz平板中生長的酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)稀釋后涂布到含有3000μg/mlzeocin的ypdz平板中，最后得到最高抗性為3000μg/mlzeocin的高抗性酵母轉(zhuǎn)化子，以bmgy培養(yǎng)基培養(yǎng)至光密度值>10.0，離心收集細胞，用bmmy培養(yǎng)基重懸細胞并使其甲醇濃度為1.0％，30℃、200rpm條件下誘導72h后，經(jīng)sds-page分析，得到了高水平分泌表達rhdpt的酵母轉(zhuǎn)化子。搖瓶條件下，dpt酵母轉(zhuǎn)化子表達的rhdpt超過45mg/l。

5、rhdpt在搖瓶條件下的擴大表達

高水平分泌表達酵母轉(zhuǎn)化子于1lbmgy培養(yǎng)基培養(yǎng)至光密度值>10，離心收集細胞，用200mlbmmy培養(yǎng)基重懸細胞并使其甲醇濃度為1.0％，每24小時取樣一次并補加甲醇一次至終濃度為1％，經(jīng)誘導72小時后，測定各時間段的樣品總蛋白含量，搖瓶條件下，dpt酵母轉(zhuǎn)化子表達的rhdpt超過45mg/l。

6、rhdpt的鎳親合柱純化

誘導上清液于4℃離心，收集離心后的上清液，用含有0.2mnacl、50mm咪唑、20mmtris(ph8.0)的緩沖液進行透析后，利用鎳親合層析柱于atka-hplc系統(tǒng)中純化，先用含有0.2mnacl、50mm咪唑、20mmtris(ph8.0)的緩沖液進行漂洗，再利用含有0.2mnacl、500mm咪唑、20mmtris(ph8.0)的緩沖液進行線性洗脫并收集洗脫峰rhdpt蛋白樣品，收集mau(毫吸光度)大于100的洗脫液(色譜圖如圖2)。將收集到的蛋白樣品經(jīng)sds-page分析，結(jié)果表明，純化到的蛋白是2條主帶分別為約22kda和25kda的蛋白(如圖3)。說明表達的蛋白帶有正確的his×6標簽和c-myc標簽，能利用鎳親合層析柱有效純化得到該重組蛋白。

7、肽脂紋圖譜分析及比對：

鎳親合層析柱純化到的蛋白經(jīng)sds-page分析后，發(fā)現(xiàn)2條大小分別為22k和25k的蛋白，從膠上切下兩條主帶進行肽指紋圖譜分析，結(jié)果表明，兩蛋白都是dpt(如圖4)。

8、rhdpt的生物學活性分析：

rhdpt體外活性測定：

將3t3-l1細胞接種至96孔板，待細胞融合至70％時分別添加購買的dpt以及用上述方法表達純化到的不同濃度的rhdpt，分別在添加dpt后的第1天至第4天用mtt法測量活細胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的rhdpt(1ug/ml)就具有良好的抑制3t3-l1增殖的效果，1ug/ml濃度的rhdpt比5ug/ml購買的hdpt在抑制3t3-l1增殖效果方面更為顯著(如圖5所示：橫坐標為時間，縱坐標為細胞比例(測量點的活細胞數(shù)量與day0活細胞數(shù)量的比例))。該結(jié)果表明，本發(fā)明的方法表達純化到的rhdpt能抑制3t3-l1的體外增殖，具有良好的體外生物活性。

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。

sequencelisting

<110>中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院

<120>重組人皮膚橋蛋白成熟肽段及其生產(chǎn)方法

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>606

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggacctcagtcttctctgggtacttctgcccctagtcaccatggcctggggccagtat60

ggcgattatggatacccataccagcagtatcatgactacagcgatgatgggtgggtgaat120

ttgaaccggcaaggcttcagctaccagtgtccccaggggcaggtgatagtggccgtgagg180

agcatcttcagcaagaaggaaggttctgacagacaatggaactacgcctgcatgcccaca240

ccacagagcctcggggaacccacggagtgctggtgggaggagatcaacagggctggcatg300

gaatggtaccagacgtgctccaacaatgggctggtggcaggattccagagccgctacttc360

gagtcagtgctggatcgggagtggcagttttactgttgtcgctacagcaagaggtgccca420

tattcctgctggctaacaatagaatatccaggtcactatggtgaggaaatggacatgatt480

tcctacaattatgattactatatccgaggagcaacaaccactttctctgcagtggaaagg540

gatcgccagtggaagttcataatgtgccggatgactgaatacgactgtgaatttgcaaat600

gtttag606

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<212>dna

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