本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在診斷和預(yù)示腎癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腎細胞癌是發(fā)生于腎臟實質(zhì)的惡性腫瘤，簡稱腎癌，它來源于腎小管上皮，占成人惡性腫瘤的3％，腎臟惡性腫瘤的90％-95％，是目前最常見的腎臟惡性腫瘤。腎癌起病隱匿，早期的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，許多患者初診時即發(fā)生了轉(zhuǎn)移，既往典型的“血尿、腫塊、疼痛”三聯(lián)征出現(xiàn)時多屬腫瘤晚期，同時腎癌對放化療均不敏感，對晚期腎癌缺乏有效的治療手段，預(yù)后不良。因此，腎癌的早期診斷對腎癌病人的治療有極為重要的意義。目前腎癌的臨床診斷方式主要有：x線檢查(尿路平片、靜脈腎盂造影)、超聲、ct、mri、腎動脈造影、術(shù)中、術(shù)后病理活檢等。x線檢查通常對于典型的較晚期病例才會出現(xiàn)特征的影像學(xué)改變，因此平片的診斷價值不大；超聲檢查圖像無特異性，對于直徑小于2cm或不典型者，診斷上有一定困難，通常需要有經(jīng)驗的技師才能準確診斷，受主觀因素影響較大；ct及mri對于腎癌的診斷價值相似，是目前應(yīng)用最廣的腎癌診斷方式，但對少數(shù)病例在術(shù)前不能做到定性診斷，對于不典型及小腎癌有可能漏診、誤診,而且mri檢查不適用于體內(nèi)有金屬的患者；腎癌通常有豐富的血供，腎動脈造影可能清楚地顯示病變，而且可以同時進行選擇性腎動脈栓塞，有利于其后手術(shù)的進行，但屬于有創(chuàng)檢查，有可能會增加患者的痛苦；術(shù)后病理活檢為診斷金標準，有利于診斷，然而對于晚期患者來說其治療意義遠沒有診斷意義大。因此，研究更有效的腎癌標記物對提高腎癌的早期診斷，減少腎癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于：(1)提供檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在診斷和預(yù)示腎癌產(chǎn)品中的應(yīng)用；(2)調(diào)控fgl2基因或fgl2蛋白表達下調(diào)的物質(zhì)在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用；(3)檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在篩選治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：1、檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在診斷和預(yù)示腎癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。進一步，所述診斷和預(yù)示具體為：腎癌的發(fā)生、tnm分期的判斷、治療效果的動態(tài)監(jiān)測和預(yù)后判斷。進一步，所述檢測fgl2基因表達水平的物質(zhì)包含能夠特異性擴增fgl2基因的引物，所述引物的正向序列如seqidno.1所示；所述引物的反向序列如seqidno.2所示。進一步，所述檢測fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)包含可以特異性結(jié)合所述fgl2蛋白的抗體或所述抗體的片段。進一步，所述產(chǎn)品為試劑盒、芯片、試紙或高通量測序平臺中的一種。進一步，所述試劑盒為：(1)為基于染料法的fgl2mrna實時定量檢測試劑盒，包括能夠特異性擴增fgl2基因的引物，所述引物的正向序列如seqidno.1所示，所述引物的反向序列如seqidno.2所示；或(2)fgl2免疫組化試劑盒，包括抗fgl2蛋白單抗，酶標二抗及顯色劑；或(3)蛋白印跡試劑盒，包括固相載體、抗fgl2蛋白單抗、酶標二抗及顯色底物。進一步，所述基于染料法的fgl2mrna實時定量檢測試劑盒還包括內(nèi)參引物，所述內(nèi)參引物的上游引物如seqidno.3所示，下游引物如seqidno.4所示。2、調(diào)控fgl2基因或fgl2蛋白表達下調(diào)的物質(zhì)在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。3、檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在篩選治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在診斷和預(yù)示腎癌產(chǎn)品中的應(yīng)用，根據(jù)該物質(zhì)對fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的檢測結(jié)果，可以對腎癌進行早期診斷或者對腎癌預(yù)后作出預(yù)測，在減少腎癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量方面具有重要的意義。本發(fā)明還提供了調(diào)控fgl2基因或fgl2蛋白表達下調(diào)的物質(zhì)在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用，該藥物一方面可以從阻斷內(nèi)源性fgl2蛋白的過多表達和分泌及減弱fgl2蛋白的活性兩方面來治療因fgl2蛋白過表達介導(dǎo)的腎癌。另外，本發(fā)明還提供了檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在篩選治療腎癌的藥物中的應(yīng)用，通過該物質(zhì)對癌細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平來測定抗腫瘤藥物的治療效果，從而篩選出能治療腎癌的有效藥物。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：圖1為癌組織及對應(yīng)癌旁組織中fgl2mrna表達水平對比圖；圖2為利用imagej軟件分析癌組織及癌旁組織中fgl2蛋白條帶灰度圖；圖3為顯微鏡下(放大倍數(shù)為200倍)癌組織及癌旁組織中fgl2蛋白表達水平對比圖；圖4為利用kaplan-meier法和log-rank檢驗分析fgl2蛋白表達水平與腎細胞癌患者生存率之間的關(guān)系圖。具體實施方式下面將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例1檢測腎癌組織中fgl2mrna表達水平1、材料選取13例腎癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織，取樣來源于重慶西南醫(yī)院2015年10月到2015年12月期間行腎全切或部分切除的腎癌患者(病理確診)，手術(shù)切除后立即分離腎癌及癌旁組織，編號后放入液氮保存。2、提取組織樣本中rna采用trizol(takara，貨號9109)法提取組織中rna實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：(1)將13例腎癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織樣本分別放入已用液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末狀，分別收集于容量為1.5ml無rna酶離心管中：(2)分別向步驟(1)中無rna酶離心管中加入1mltrizol，18-25℃下放置10分鐘；(3)分別向步驟(2)無rna酶離心管中加入0.2ml氯仿，用力振蕩15s，充分混勻后18-25℃下靜置10分鐘；(4)將步驟(3)中各離心管以12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(約400ul)到對應(yīng)的另一新的容量為1.5ml無rna酶離心管中，分別加入等體積的異丙醇(約400ul)，充分顛倒混勻，冰上靜置10分鐘；(5)將步驟(4)中加入異丙醇的各離心管以12000rpm高速離10分鐘后棄去上清，分別加入1ml體積分數(shù)為75％的depc乙醇洗滌沉淀，輕輕震蕩，4℃下以7500rpm離心5分鐘；(6)棄去步驟(5)中各離心管中乙醇后18-25℃下放置5分鐘以充分晾干沉淀，再分別加入depc處理過的水溶解沉淀，獲得各樣本的rna；3、rna濃度、純度檢測分別取各離心管中rna2ul，利用nanodrop2000紫外分光光度計測量，13例腎癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織樣本的rnaod260/od280值見表1，由表1可知，所提取的13例腎癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織樣本的rna純度高、雜質(zhì)少。將各樣本rna置于-20℃下保存。表113例腎癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織樣本的rnaod260/od280值4、逆轉(zhuǎn)錄采用primescripttmrtreagentkit(takara，貨號rr047a)進行cdna反轉(zhuǎn)錄，具體操作如下：(1)取各樣本的rna1ul分別加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，采用20μl反應(yīng)體系。具體如下表：試劑劑量(ul)gdnaeraser1gdnaeraserbuffer2primescriptrtenzymemix1primescriptbuffer24rtprimermix1rnasefreeh2o10總rna1總體積20(2)在37℃孵育15min，85℃5s，然后迅速冷卻至4℃。逆轉(zhuǎn)的cdna存放于-20℃冰箱備用。5、real-timepcr(1)采用premixextaqtmii配制反應(yīng)液，如下表：(2)引物對和內(nèi)參基因引物對(3)儀器及分析方法用abi7500型熒光定量pcr儀，采用：95℃預(yù)變性30s；95℃變性30s，59℃退火34s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。利用公式2-δδct進行數(shù)據(jù)分析。實驗重復(fù)3次。所得數(shù)據(jù)如表2所示。分析結(jié)果如圖1所示，與癌旁對照組織相比，腎癌組織中fgl2基因mrna表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。表2rt-pcr檢測ccrcc患者癌和癌旁組織中fgl2mrna的相對表達水平實施例2檢測新鮮腎癌組織中fgl2蛋白表達水平1、樣本收集重慶西南醫(yī)院經(jīng)病理確診、手術(shù)切除的新鮮腎癌組織以及癌旁組織，納入病例術(shù)前均未經(jīng)任何治療，所有的臨床信息皆從患者病歷資料中收集得到。2、蛋白印跡檢測(westernblot)收集的腎組織使用ripa裂解液(beyotimebiotechnology)提取總蛋白，bca法測定總蛋白濃度。將十二烷基硫酸鈉(sds)上樣緩沖液與蛋白樣品按體積比1:4混合，將混合樣品置于沸水中10min使蛋白變性，冷卻至室溫。將蛋白樣品加入sds-page凝膠上樣孔中(30μg蛋白/孔)，電泳起始電壓為80v，待蛋白樣品電泳到分離膠后將電壓調(diào)整為120v，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。利用20v恒壓將目的蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜(轉(zhuǎn)膜時間1h)。tbs-t洗滌后，膜用體積分數(shù)為5％的bsa室溫封閉1h，fgl2鼠單克隆抗體(1:200，貨號：h00010875-m01，abnova)4℃孵育過夜。tbs-t洗滌膜，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1:5000，貨號：zb-2305，中杉金橋)在室溫下孵育1h。采用增強化學(xué)發(fā)光法(ecl，millipore)檢測蛋白質(zhì)。3、結(jié)果利用imagej軟件分析蛋白條帶灰度。如圖2所示，fgl2蛋白在新鮮腎癌組織中表達，而在癌旁組織中幾乎不表達，說明腎癌組織較癌旁組織中fgl2蛋白表達水平顯著升高。實施例3檢測石蠟包埋腎癌組織切片中fgl2蛋白的表達水平1、樣本收集重慶西南醫(yī)院2010年1月到2011年12月間經(jīng)病理確診、手術(shù)切除的腎癌組織(石蠟包埋，170例)以及癌旁組織(石蠟包埋，40例)。納入病例術(shù)前均未經(jīng)任何治療，所有的臨床信息皆從患者病歷資料中收集得到。2、免疫組織化學(xué)檢測各石蠟包埋塊行4μm連續(xù)切片，65℃下烘烤2h。二甲苯脫蠟2次(10min/次)，梯度酒精中復(fù)水，0.01m檸檬酸鹽緩沖液(ph值6.0)抗原修復(fù)20min(微波法)，體積分數(shù)為3％的過氧化氫室溫10min(去除內(nèi)源性過氧化物酶)，體積分數(shù)為5％的bsa抗原封閉1h，fgl2鼠單克隆抗體(1:200，貨號：h00010875-m01，abnova)4℃孵育過夜。設(shè)置不加抗體陰性對照組。pbs漂洗后，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1:800，貨號：zb-2305，中杉金橋)在室溫下孵育1h，pbs漂洗后dab顯色3min。切片經(jīng)蘇木素染色，脫水、透明、干燥和封片后顯微鏡下觀察。所有切片由2名獨立的病理科工作人員顯微鏡下(放大倍數(shù)為200)隨機選取4個視野進行評估。組織染色評分由染色強度和陽性細胞百分比的乘積確定，染色強度分為：0(陰性、1(弱陽性)、2(中度)和3(強陽性)；陽性細胞百分比分為：0(＜5％)、1(5-25％)、2(25-50％)、3(50-75％)、4(＞75％)。組織染色評分≥6提示fgl2蛋白高表達，評分≤4提示fgl2蛋白低表達。3、結(jié)果如圖3所示，fgl2蛋白主要表達于細胞質(zhì)和細胞膜，癌組織染色明顯高于癌旁組織。圖3a顯示，fgl2蛋白在癌旁組織中幾乎不表達；而在不同腎透明細胞癌患者的癌組織中，fgl2蛋白既有低表達(圖3b，染色評分≤4)，也可出現(xiàn)高表達(圖3c，染色評分≥6)。實施例4fgl2蛋白在腎透明細胞癌組織中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系1、分析方法利用spss19.0(spss，美國)統(tǒng)計軟件對臨床數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均值±標準差表示。根據(jù)數(shù)據(jù)處理的不同方法及統(tǒng)計學(xué)處理的不同要求，選用方差分析或t檢驗進行分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2、結(jié)果如表3所示，170例腎細胞癌標本中，103例強陽性染色，67例為弱陽性染色。利用cox回歸分析了fgl2蛋白表達與腎癌臨床病理特征之間的關(guān)系，fgl2蛋白表達上調(diào)與腎癌腫瘤大小(p＝0.002)、t分期(p＝0.003)以及tnm分期(p＝0.002)之間高度相關(guān)。然而與年齡、性別、fuhrman分級和壞死之間無相關(guān)性(p＞0.05)。表3fgl2蛋白在腎透明細胞癌組織中的表達與臨床病理特征之間的關(guān)系表實施例5fgl2蛋白表達與生存率之間的關(guān)系1、免疫組織化學(xué)檢測石蠟包埋塊行4μm連續(xù)切片，65℃下烘烤2h。二甲苯脫蠟2次(10min/次)，梯度酒精中復(fù)水，0.01m檸檬酸鹽緩沖液(ph值6.0)抗原修復(fù)20min(微波法)，3％過氧化氫室溫10min(去除內(nèi)源性過氧化物酶)，體積分數(shù)為5％的bsa抗原封閉1h，fgl2鼠單克隆抗體(1:200，貨號：h00010875-m01，abnova)4℃孵育過夜。設(shè)置不加抗體陰性對照組。pbs漂洗后，用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1:800，貨號：zb-2305，中杉金橋)在室溫下孵育1h，pbs漂洗后dab顯色3min。切片經(jīng)蘇木素染色，脫水、透明、干燥和封片后顯微鏡下觀察。所有切片由2名獨立的病理科工作人員高倍鏡下隨機選取4個視野進行評估。組織染色評分由染色強度和陽性細胞百分比的乘積確定，染色強度分為：0(陰性)、1(弱陽性)、2(中度)和3(強陽性)；陽性細胞百分比分為：0(＜5％)、1(5-25％)、2(25-50％)、3(50-75％)、4(＞75％)。組織染色評分≥6提示fgl2蛋白高表達，評分≤4提示fgl2蛋白低表達。2、生存分析利用kaplan-meier法和log-rank檢驗分析fgl2蛋白高表達對腎細胞癌患者生存的影響。首先，分析了腎透明細胞癌組織中fgl2蛋白的表達情況與患者術(shù)后生存率之間的關(guān)系，結(jié)果如圖4a-b所示，由圖4a-b可知：fgl2蛋白低表達組患者(n＝67)的os及rfs均明顯高于fgl2蛋白高表達組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(log-ranktest，p<0.001)，提示fgl2蛋白低表達患者預(yù)后明顯好于fgl2蛋白高表達者。然后，分別對早期(tnm分期，i+ii)和晚期(tnm分期，ii+iv)腎透明細胞癌癌患者腎組織中fgl2蛋白的表達與術(shù)后患者生存率之間的關(guān)系進行了分析。結(jié)果顯示，在早期腎透明細胞癌中(tnm，i+ii)，fgl2蛋白高表達組患者(n＝76)的os及rfs均明顯低于fgl2蛋白低表達組(n＝62)(log-ranktest，p<0.001)(圖4c-d)；而對于晚期腎透明細胞癌患者，fgl2蛋白高表達組患者的os及rfs與fgl2蛋白低表達組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(os:p＝0.327；rfs:p＝0.396)(圖4e-f)。提示fgl2蛋白的高表達對于早期腎癌預(yù)后的判定更為敏感。最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。sequencelisting<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院<120>檢測fgl2基因或fgl2蛋白表達水平的物質(zhì)在診斷和預(yù)示腎癌產(chǎn)品中的應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1aggcagaaacggactgttgt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ccaggcgaccatgaagtaca20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ctctgctcctcctgttcgac20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gcgcccaatacgaccaaatc20當(dāng)前第1頁12