本發(fā)明屬于生物工程與水產(chǎn)疫病檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自2009年以來，早期死亡綜合癥(EMS)，又稱急性肝胰腺壞死綜合癥(AHPNS)給亞洲，特別是東南亞和中國的對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了前所未有的沖擊。除了大規(guī)模減產(chǎn)外，該疾病還帶來了諸多負面問題，例如：對蝦養(yǎng)殖就業(yè)問題、社會福利問題、對蝦供求問題和全球?qū)ξr總體價格問題等等。

2013年5月，美國亞利桑那大學(xué)水產(chǎn)病理實驗室(UAZ-APL)定義急性肝胰腺壞死綜合癥(AHPNS)病原為副溶血弧菌的特異菌株，該菌株能夠產(chǎn)生毒素并誘導(dǎo)健康對蝦致病。2014年，在世界范圍內(nèi)普遍證實目前APHND的病因與副溶血弧菌所攜帶的毒素質(zhì)粒所表達的PirA和PirB兩種毒素相關(guān)。

目前針對該疾病的診斷集中在對毒素質(zhì)粒的基因檢測?，F(xiàn)階段已出現(xiàn)了一種商業(yè)化的基因檢測試劑盒和三種通過基礎(chǔ)研究得出的不同引物設(shè)計得到的診斷方法。

CN 103667498 A公開了副溶血性弧菌的檢測方法。所述方法用于副溶血性弧菌檢測的特異性引物是根據(jù)副溶血性弧菌種特異性基因tlh的保守區(qū)域所設(shè)計的一對外圍引物、一對交叉引物和一對特異性檢測探針；副溶血性弧菌種特異性基因tlh是編碼副溶血性弧菌不耐熱溶血毒素TLH的毒力基因。檢測方法：副溶血性弧菌模板DNA的提?。煌鈬锏尿炞C；交叉引物恒溫擴增反應(yīng)體系的建立；交叉引物恒溫擴增程序；擴增產(chǎn)物的檢測。CN 102747148 A公開一種副溶血性弧菌檢測用引物組，包括下列引物：F3引物：GACGTACCATGTACTAGATC；B3引物：GCCATCACTAGCCATAGCG；FIP引物：CGATCGCCAGCATGCGCGGCATGTCTATTGGTGAGAGGTCTTG；BIP引物：CATGATTTCAATGACGTCCCATTCTGAACCCAAAATCCGGGC。該發(fā)明還提供一種使用上述引物組檢測副溶血性弧菌的方法。

現(xiàn)階段的診斷方法存在的不足之處主要在三個方面：(1)基因診斷需要PCR儀器以及復(fù)雜的操作過程，且時間一般在4個小時以上，不利于基層以及現(xiàn)場對疫情的快速診斷。而且目前該診斷方法在國內(nèi)還沒有商品化的產(chǎn)品，全球范圍內(nèi)的三種基因檢測方法均由國外提供，其中一種已得到商品化。(2)基因診斷只能檢測是否存在毒素表達基因，并不能診斷出毒素是否得以表達。而急性肝胰腺壞死綜合癥得根本原因是表達的毒素蛋白對機體的損傷，因此只有檢測毒素蛋白才能更準(zhǔn)確地判斷疫病的爆發(fā)，減少假陽性。(3)目前的基因診斷技術(shù)只有95％的準(zhǔn)確性，還有待進一步提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供免疫診斷急性肝胰腺壞死綜合癥的蛋白卵黃抗體及其制備工藝和應(yīng)用。能夠?qū)毙愿我认賶乃谰C合癥這類疾病的防治及檢測提供了首創(chuàng)的免疫診斷技術(shù)。

為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體，以pirA和pirB蛋白作為抗原免疫產(chǎn)蛋禽類，并從其卵黃中提取，能夠與所述pirA和pirB蛋白特異性結(jié)合。

本發(fā)明的pirA和pirB蛋白可以通過在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_得到，也可以通過常規(guī)肽合成技術(shù)化學(xué)合成得到，優(yōu)選的是在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_得到。

本發(fā)明中，所述的pirA和pirB作為一種毒素蛋白，通過基因工程手段從副溶血弧菌中獲得，作為一種特異性可產(chǎn)生特異性抗體的蛋白，其產(chǎn)生的抗體具有抗急性肝胰腺壞死綜合癥，相比于直接用副溶血弧菌直接免疫產(chǎn)生抗體，以pirA和pirB蛋白免疫產(chǎn)生的抗體，專一性更強，效果更好；除此之外，通過pirA和pirB免疫產(chǎn)蛋禽類產(chǎn)生的卵黃抗體，相較于別的抗體，抗性更強，效率更高。

優(yōu)選地，所述pirA蛋白含有111個氨基酸。

優(yōu)選地，所述pirA蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1所示片段，所述序列如下：

優(yōu)選地，所述pirB蛋白含有438個氨基酸。

優(yōu)選地，所述pirB蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.2所示片段，所述序列如下：

第二方面，本發(fā)明還提供一種如第一方面所述的抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制備所述pirA和pirB蛋白抗原；

(2)使用所述pirA和pirB蛋白抗原及佐劑，對產(chǎn)蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋；

(3)取所述免疫蛋的蛋黃，分離純化IgY卵黃抗體。

優(yōu)選地，所述步驟(1)具體包括：

(a)通過PCR擴增技術(shù)獲得所述pirA和pirB的基因序列，并將pirA和pirB的基因序列重組到表達載體中，構(gòu)建重組載體；具體地，使用pirA基因序列的PCR擴增引物SEQ ID NO.3-4和pirB基因序列的PCR擴增引物SEQ ID NO.5-6，以提取的副溶血弧菌中的質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增得到SEQ ID NO.7所示的pirA和SEQ ID NO.8所示的pirB的基因序列，再將上述序列重組到表達載體中，可以為pET-28a(+)載體；

(b)將重組載體轉(zhuǎn)化到克隆菌中，篩選含有所述pirA和pirB基因序列的陽性轉(zhuǎn)化菌；具體地，克隆菌可以是DH5α大腸桿菌等，篩選可以通過X-Gal等方法篩選含有所述pirA和pirB基因序列的陽性轉(zhuǎn)化菌；

(c)從所述陽性轉(zhuǎn)化菌中提取所述重組載體，并轉(zhuǎn)化到表達菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的陽性表達菌，對所述陽性表達菌擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述pirA和pirB蛋白表達；具體地，表達菌可以是BL21大腸桿菌等，誘導(dǎo)可以通過IPTG等方法誘導(dǎo)所述pirA和pirB蛋白表達；

(d)分離純化所述pirA和pirB蛋白，具體地，可以通過Ni-NTA柱親和層析純化等方式分離純化所述pirA和pirB蛋白。

優(yōu)選地，所述PCR擴增的引物為：

其中，所述pirA基因序列的PCR擴增引物為：

上游引物：5’-CGCGGATCC ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’(SEQ ID NO.3)，

下游引物：5’-CCCGCGGCCGC TTAGTGGTAATAGATTGTACAGAAA-3’(SEQ ID NO.4)。

其中，所述pirB基因序列的PCR擴增引物為：

上游引物：5’-CGCGGATCC ATGACTAACGAATACGTTGTAACAA-3’(SEQ ID NO.5)，

下游引物：5’-CCCGCGGCCGC CTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3’(SEQ ID NO.6)。

優(yōu)選地，所述PCR退火溫度為57-58℃。

優(yōu)選地，步驟(2)所述免疫產(chǎn)蛋雞的方法為將純化后的pirA和pirB的重組抗原與弗氏佐劑按1:1混合乳化3-5h，進行四點肌肉注射免疫產(chǎn)蛋禽類。

優(yōu)選地，所述注射免疫進行五次，第三次免疫后的第二周開始收集雞蛋，并測定抗體效價，具體地，第一次免疫后隔兩周進行第二次免疫，再隔兩周進行第三次免疫，隔一個月后進行第四次免疫，最后隔40天進行第五次免疫；通過蒸餾水及硫酸銨溶液稀釋，然后沉淀并透析等方法提取所述IgY，最后用SDS-PAGE和Wester bolt電泳檢測純化后的抗體IgY的純度，用Dot blot檢測抗體的滴度，并用間接競爭ELISA檢測IgY的效價。

優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：

(1)制備所述pirA和pirB蛋白抗原，具體步驟如下：

(a)通過PCR擴增技術(shù)獲得所述pirA和pirB的基因序列，并將pirA和pirB的基因序列重組到表達載體中，構(gòu)建重組載體；

其中，所述pirA基因序列的PCR擴增引物為：上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示；

其中，所述pirB基因序列的PCR擴增引物為：上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示；

(b)將重組載體轉(zhuǎn)化到克隆菌種，篩選含有所述pirA和pirB基因序列的陽性轉(zhuǎn)化菌；

(c)從所述陽性轉(zhuǎn)化菌中提取所述重組載體，并轉(zhuǎn)化到表達菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的陽性表達菌，對所述陽性表達菌擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述pirA和pirB蛋白表達；

(d)分離純化所述pirA和pirB蛋白；

(2)使用所述pirA和pirB蛋白抗原及佐劑，對產(chǎn)蛋禽類進行注射免疫，檢取免疫禽類所產(chǎn)的免疫蛋，具體步驟如下：

所述免疫產(chǎn)蛋雞的方法為將純化后的pirA和pirB的重組抗原與佐劑按1:1混合乳化3-5h，進行四點肌肉注射免疫產(chǎn)蛋禽類；

其中，所述注射免疫進行五次，第三次免疫后的第二周開始收集雞蛋，并測定抗體效價；

(3)取所述免疫蛋的蛋黃，分離純化IgY卵黃抗體。

根據(jù)本發(fā)明，所述抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體的制備方法采用的是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體在制備抗急性肝胰腺壞死綜合癥的藥物和/或試劑中的應(yīng)用；

優(yōu)選地，所述綜合癥為抗對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥。

第四方面，本發(fā)明提供一種檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如第一方面所述的抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明通過制備pirA和pirB蛋白抗原；利用所述pirA和pirB蛋白抗原，對產(chǎn)蛋禽類進行注射免疫；然后從所述免疫蛋的蛋黃，提取抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體。本發(fā)明的免疫診斷技術(shù)為全國首創(chuàng)，制備得到的蛋白卵黃抗體具有良好的活性和特異性，具有良好的穩(wěn)定性和耐高滲性，同時制備方法是一種全新的效益高、安全、成本低、環(huán)保和高效預(yù)防等特點，為急性肝胰腺壞死綜合癥的防治及檢測提供有創(chuàng)造性的新方案。

具體實施方式

為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實施例來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。

實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：制備pirA和pirB蛋白

(1)副溶血性弧菌pirA和pirB基因的克隆，表達載體的構(gòu)建及鑒定

(a)根據(jù)副溶血性弧菌pirA和pirB基因的序列設(shè)計引物：

pirA基因序列的PCR擴增引物為：

上游引物：5’-CGCGGATCC ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’(SEQ ID NO.3)，其中下劃線部分為BamH I酶切位點；

下游引物：5’-CCCGCGGCCGC TTAGTGGTAATAGATTGTACAGAAA-3’(SEQ ID NO.4)，其中下劃線部分為Not I酶切位點。

pirB基因序列的PCR擴增引物為：

上游引物：5’-CGCGGATCC ATGACTAACGAATACGTTGTAACAA-3’(SEQ ID NO.5)，其中下劃線部分為BamH I酶切位點；

下游引物：5’-CCCGCGGCCGC CTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3’(SEQ ID NO.6)，其中下劃線部分為Not I酶切位點。

采用常規(guī)小量細菌DNA提取方法即堿裂解法提取副溶血性弧菌的質(zhì)粒。

PCR擴增：以提取的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：

設(shè)置一組以水為樣本的陰性對照。

反應(yīng)條件如下：

所獲得PCR產(chǎn)物進行1.2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction)純化。采用TAKARA pMD18-T kit參照說明書體系進行連接。

(b)驗證，將得到的pirA和pirB基因序列進行轉(zhuǎn)化并克隆驗證；具體地，所述轉(zhuǎn)化為取10ul連接產(chǎn)物加至100ul DH5α感受態(tài)細胞中，冰上放置30min，42℃熱激30s，立即冰上冷卻2min。加入890ul LB培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)1h。

采用藍白斑初步篩選克隆，取40ul X-Gal和8ul IPTG混合均勻后涂布于氨芐抗性培養(yǎng)基上，室溫靜置干燥，于其上涂布100ul轉(zhuǎn)化培養(yǎng)菌夜，37℃過夜培養(yǎng)。

具體地，所述PCR驗證M13引物，對經(jīng)過夜培養(yǎng)后的透明無色單菌落進行PCR，具體如下：

標(biāo)記平板上的預(yù)選的單菌落，用槍頭依次挑取單菌落重懸于10ul滅菌去離子水中，沸水10min處理。12000g離心1min，取上清為模板，PCR體系如下：

設(shè)置一組以水為樣本的陰性對照。

反應(yīng)條件如下：

所述酶切采用將過夜培養(yǎng)的菌夜采用試劑盒的提取的方法純化質(zhì)粒，電泳檢測無誤后進行雙酶切，酶切體系如下：

同時酶切Pet28a質(zhì)粒，作為陰性對照，酶切溫度為37℃，時間1h。所獲得酶切產(chǎn)物進行1.2％的瓊脂糖凝膠回收目的條帶。

(b)通過同源重組法，將連接產(chǎn)物重組到表達載體體pET-28a(+)(購自TAKARA公司)中，構(gòu)建重組載體；將所述重組載體轉(zhuǎn)化到克隆菌DH5α大腸桿菌中，篩選含有所述pirA和pirB基因序列的陽性轉(zhuǎn)化菌；具篩選可以通過X-Gal等方法篩選含有所述pirA和pirB基因序列的陽性轉(zhuǎn)化菌；

具體地，將上述中回收到的目的片段和載體進行連接。采用TAKARAT4連接酶體系如下：

按上述方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)，并在LB(Kan+)平板進行培養(yǎng)，37℃過夜，挑取單菌落進行PCR鑒定。

(c)從所述陽性轉(zhuǎn)化菌中提取所述重組載體，PCR驗證并酶切驗證，驗證基因片段的大小，證明PCR得到的序列正確。將所述測序證明正確的重組載體轉(zhuǎn)化到表達菌BL21大腸桿菌中，得到含有所述pirA和pirB基因序列的陽性表達菌；

具體地，挑取6個單菌落37℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌液以1:100的比例加入5ml Amp+LB培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)2h。取出1ml菌液作為未誘導(dǎo)對照，其余按照體積加入IPTG至終濃度為0.4mM，37℃180rp培養(yǎng)4h。取1ml菌液12000g離心10min，棄上清，用100ul去離子水重懸沉淀，加入等體積的2×SDS loadingbuffer，沸水浴10min，取上清用12％SDS-PAGE電泳檢測。

將經(jīng)檢測誘導(dǎo)成功的菌株擴大培養(yǎng)和誘導(dǎo)，將過夜培養(yǎng)的菌液1:100稀釋至200ml新鮮LB培養(yǎng)基中，按照上述誘導(dǎo)條件對其進行誘導(dǎo)。

經(jīng)誘導(dǎo)后的菌液12000g離心10min，收集菌體。以1/10體積的裂解緩沖液重懸菌體，超聲破碎，控制功率200W，工作條件為超聲4s暫停10s 90次，以冰浴降溫，重復(fù)3次以徹底破碎細菌。將經(jīng)超聲破碎處理的菌液12000g離心10min后，分別取上清和沉淀經(jīng)12％SDS-PAGE驗證蛋白表達方式。

(d)分離純化所述pirA和pirB蛋白，具體地，可以通過Ni-NTA柱親和層析純化等方式分離純化所述pirA和pirB蛋白。

具體地，可以采用GE公司的Ni-NTA親和層析預(yù)裝柱(NiSepharose High Performance)按照產(chǎn)品說明書純化目的蛋白pirA和pirB。實驗中，以50-100cm/h的線性流速用蒸餾水洗5個柱體積，以150cm/h的線性流速用6個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，然后加入預(yù)處理過的樣品，用緩沖液洗滌，直到吸收達到基線。采用逐步洗脫法用洗脫緩沖液洗脫，收集各階段樣品，SDS-PAGE檢測蛋白純化效果。

實施例2：免疫蛋雞

免疫，將pirA和pirB蛋白作為抗原與等體積的費氏佐劑混合，采用皮下多點注射免疫蛋雞；

具體地，測定純化后毒素蛋白的濃度，用PBS將純化后的重組蛋白的濃度調(diào)整至0.01～0.1mg/ml，將調(diào)整后的重組蛋白與佐劑按照1:1比例相混合后按照公司特有的五次兩途徑免疫的方式免疫蛋雞。第一次免疫為1ml重組蛋白與1ml弗氏完全佐劑充分混合后進行胸肌四點注射，兩周后用0.5ml重組蛋白與0.5ml弗氏不完全佐劑充分混合后進行胸肌四點注射免疫。兩周后再次重復(fù)以上操作，但免疫總劑量改為1.5ml。第四次免疫為一個月以后，采用0.75ml重組蛋白與0.5ml弗氏不完全佐劑充分混合后進行翅靜脈注射免疫。40天后重復(fù)以上操作。至此一共五次免疫完成。；第三次免疫結(jié)束7天后開始收集雞蛋提取純化IgY。

實施例3：提取抗急性肝胰腺壞死綜合癥毒素蛋白卵黃抗體

(1)卵黃抗體的初步分離：將卵黃液與醋酸-醋酸鈉的酸化水緩沖液按1：10混合，4度靜置過夜，10000g離心20min，留上清。緩慢加入飽和硫酸銨至終濃度為35％，4度靜置至明顯分層。將混合液10000g離心20min，去上清，沉淀用30ml PBS溶解。緩慢加入飽和硫酸銨至終濃度為35％，4度靜置至明顯分層。10000g離心20min，去上清，沉淀用PBS溶解；

(2)抗PEDV特異性卵黃抗體的免疫親和層析：將重組得到的Pri毒素蛋白與HiTrap進行偶聯(lián)，制備得到親和層析柱。將步驟(1)得到的粗提卵黃抗體經(jīng)Pri毒素蛋白親和層析柱以1ml/min的速度過柱，最后用洗脫液洗下掛在柱上的抗Pri毒素蛋白的特異性卵黃抗體，經(jīng)離心后用PBS重懸抗體沉淀得到抗Pri毒素蛋白特異性卵黃抗體液。

實施例4：蛋白卵黃抗體的純度和效價測定

(1)以1:100的比例用0.01M PBS稀釋后測定溶液蛋白液濃度；

具體地，以PBS調(diào)零，以紫外分光光度計測蛋白含量，按如下公式：蛋白含量(mg/ml)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×樣品稀釋度，計算蛋白含量。用SDS-PAGE電泳檢測純化抗體IgY，圖譜呈現(xiàn)單一條帶。

(2)用間接競爭ELISA檢測IgY的效價；

具體地，IgY的效價為1:12500-1:48300

實施例5：蛋白卵黃抗體對急性肝胰腺壞死綜合癥的體外抑制

取6支裝有10mL液體培養(yǎng)基的試管，個加入1mL指示菌懸液，使細菌濃度為10^6-7cfu/mL，向其中的5支試管分別加入1mL不同濃度的IgY，使抗體的終濃度分別為1mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL，剩下的一支作為對照，加入1mg/mL無菌的PBS。將6支試管置于37℃恒溫箱總培養(yǎng)，分別在第1h、3h和5h取培養(yǎng)液，用稀釋平板法計算活菌數(shù)。

結(jié)果表明，制備的蛋白卵黃抗體IgY在濃度達到6mg/mL的時候，對副溶血弧菌具有明顯的生長抑制作用。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市寶舜泰科技產(chǎn)業(yè)股份有限公司

<120> 免疫診斷急性肝胰腺壞死綜合癥的蛋白卵黃抗體及其制備工藝和應(yīng)用

<130> 2015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asn Asn Ile Lys His Glu Thr Asp Tyr Ser His Asp Trp Thr

1 5 10 15

Val Glu Pro Asn Gly Gly Val Thr Glu Val Asp Ser Lys His Thr Pro

20 25 30

Ile Ile Pro Glu Val Gly Arg Ser Val Asp Ile Glu Asn Thr Gly Arg

35 40 45

Gly Glu Leu Thr Ile Gln Tyr Gln Trp Gly Ala Pro Phe Met Ala Gly

50 55 60

Gly Trp Lys Val Ala Lys Ser His Val Val Gln Arg Asp Glu Thr Tyr

65 70 75 80

His Leu Gln Arg Pro Asp Asn Ala Phe Tyr His Gln Arg Ile Val Val

85 90 95

Ile Asn Asn Gly Ala Ser Arg Gly Phe Cys Thr Ile Tyr Tyr His

100 105 110

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Asn Glu Tyr Val Val Thr Met Ser Ser Leu Thr Glu Phe Asn

1 5 10 15

Pro Asn Asn Ala Arg Lys Ser Tyr Leu Phe Asp Asn Tyr Glu Val Asp

20 25 30

Pro Asn Tyr Ala Phe Lys Ala Met Val Ser Phe Gly Leu Ser Asn Ile

35 40 45

Pro Tyr Ala Gly Gly Phe Leu Ser Thr Leu Trp Asn Ile Phe Trp Pro

50 55 60

Asn Thr Pro Asn Glu Pro Asp Ile Glu Asn Ile Trp Glu Gln Leu Arg

65 70 75 80

Asp Arg Ile Gln Asp Leu Val Asp Glu Ser Ile Ile Asp Ala Ile Asn

85 90 95

Gly Ile Leu Asp Ser Lys Ile Lys Glu Thr Arg Asp Lys Ile Gln Asp

100 105 110

Ile Asn Glu Thr Ile Glu Asn Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Lys Asp Asp

115 120 125

Tyr Ile Gly Leu Val Thr His Tyr Leu Ile Gly Leu Glu Glu Asn Phe

130 135 140

Lys Arg Glu Leu Asp Gly Asp Glu Trp Leu Gly Tyr Ala Ile Leu Pro

145 150 155 160

Leu Leu Ala Thr Thr Val Ser Leu Gln Ile Thr Tyr Met Ala Cys Gly

165 170 175

Leu Asp Tyr Lys Asp Glu Phe Gly Phe Thr Asp Ser Asp Val His Lys

180 185 190

Leu Thr Arg Asn Ile Asp Lys Leu Tyr Asp Asp Val Ser Ser Tyr Ile

195 200 205

Thr Glu Leu Ala Ala Trp Ala Asp Asn Asp Ser Tyr Asn Asn Ala Asn

210 215 220

Gln Asp Asn Val Tyr Asp Glu Val Met Gly Ala Arg Ser Trp Cys Thr

225 230 235 240

Val His Gly Phe Glu His Met Leu Ile Trp Gln Lys Ile Lys Glu Leu

245 250 255

Lys Lys Val Asp Val Phe Val His Ser Asn Leu Ile Ser Tyr Ser Pro

260 265 270

Ala Val Gly Phe Pro Ser Gly Asn Phe Asn Tyr Ile Ala Thr Gly Thr

275 280 285

Glu Asp Glu Ile Pro Gln Pro Leu Lys Pro Asn Met Phe Gly Glu Arg

290 295 300

Arg Asn Arg Ile Val Lys Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Glu Ile His

305 310 315 320

Tyr Tyr Asn Arg Val Gly Arg Leu Lys Leu Thr Tyr Glu Asn Gly Glu

325 330 335

Val Val Glu Leu Gly Lys Ala His Lys Tyr Asp Glu His Tyr Gln Ser

340 345 350

Ile Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Ile Lys Tyr Val Asp Val Ile Ala Asn

355 360 365

Gly Pro Glu Ala Ile Asp Arg Ile Val Phe His Phe Ser Asp Asp Arg

370 375 380

Thr Phe Val Val Gly Glu Asn Ser Gly Lys Pro Ser Val Arg Leu Gln

385 390 395 400

Leu Glu Gly His Phe Ile Cys Gly Met Leu Ala Asp Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Asp Lys Val Ala Ala Phe Ser Val Ala Tyr Glu Leu Phe His Pro Asp

420 425 430

Glu Phe Gly Thr Glu Lys

435

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgagtaacaa tataaaacat gaaac 35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccgcggccg cttagtggta atagattgta cagaaa 36

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatcca tgactaacga atacgttgta acaa 34

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccgcggccg cctacttttc tgtaccaaat tcatcg 36