本發(fā)明涉及一種自體脂肪干細胞生物活性肽凍干粉的制備方法，屬于生物
技術(shù)領域：
，特別是涉及一種自體來源的生物活性肽的制備方法，本方法可以有效制備高質(zhì)量自體干細胞來源的生物活性肽。
背景技術(shù)：
：近年來隨著科技的發(fā)展和生活水平的提高，人們對美容和抗衰老的需求爆發(fā)式增長。隨之而誕生的美容抗衰老手段和方式也應運而生。包括曾經(jīng)名噪一時的羊胎素、人胎盤素和干細胞抗衰老等。羊胎素和胎盤素雖然有不錯的用戶體驗，但來源為異種和異體，涉及倫理問題和風險控制問題，使用需要謹慎價格也十分昂貴。目前市場上干細胞美容的傳統(tǒng)方式為注射干細胞，這些干細胞往往來自于流產(chǎn)胎兒、還有異體的圍產(chǎn)組織，除了尖銳的倫理問題還有來源把控問題，感染病毒的陽性細胞注射到人體可以直接導致用戶感染，因此異體干細胞的使用也一度收到質(zhì)疑。干細胞在穩(wěn)定生長過程中，會分泌許多種細胞因子，以蛋白質(zhì)多肽形式分泌到培養(yǎng)基上清中，通過收集處理培養(yǎng)干細胞之后的上清液，通過一系列處理，可以獲得大量細胞因子，這些人源性因子包括egf(表皮生長因子)、vegf(血管內(nèi)皮生長因子)、hgf(肝臟生長因子)、pdgf(血小板衍生因子)、bfgf(成纖維細胞生長因子)等，還能直接分泌膠原蛋白。這些因子大都具有與皮膚生長、血管生長、皮下組織再生有關(guān)的生物活性，能夠有效調(diào)控機體細胞信號傳導，活化人體細胞進而生理性修復或替代機體損傷、衰老細胞，促進改善皮膚再生修復。含干細胞生物活性肽的干細胞化妝品已經(jīng)在多個國家上市，特別是在政策寬松、整形美容行業(yè)發(fā)達的韓國。但目前推出的干細胞生物活性肽類產(chǎn)品往往是在上清液中直接摻入化妝品基質(zhì)制成，濃度低，市場普遍反映使用效果欠佳，甚至有過敏和干燥紅腫。液體狀態(tài)下的干細胞生物活性肽溶液在室溫保存時間短，不利于運輸，濃度也低。并且異體來源的干細胞生物活性肽，干細胞種子雖然經(jīng)過篩選，但仍然存在感染風險。還有一些產(chǎn)品是通過直接裂解干細胞或其它活性細胞直接獲得，蛋白成分復雜，雖然濃度高，但無效蛋白多，對人體也將是代謝壓力。比如公告號為cn106381284a的專利，采用了異體臍帶來源的干細胞超聲破碎收集蛋白和多肽，此類方法獲得的大量蛋白質(zhì)都為胞內(nèi)蛋白，雖然濃度高，但絕大部分不具有對皮膚細胞調(diào)節(jié)或修復的因子功能，況且大規(guī)模異體獲得的臍帶干細胞仍然有感染風險。此外除了使用異體干細胞有感染風險外，大量使用異種血清也是重要的風險因素，適用人群對胎牛蛋白等的過敏會直接導致使用感受下降，例如公布號為cn102465148a的專利，使用了胎牛血清作為培養(yǎng)基主要成分，胎牛血清成分復雜，而且會直接進入產(chǎn)品，引起過敏風險。培養(yǎng)基除了需要不含有動物血清以外，一些有可能造成皮膚損傷的內(nèi)含物也必須去除，比如常用的干細胞培養(yǎng)基指示劑酚紅和避免培養(yǎng)過程污染的抗生素。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種制備自體脂肪干細胞生物活性肽凍干粉的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種制備自體脂肪干細胞生物活性肽凍干粉的方法，其包括如下步驟：s1：提取自體脂肪組織；s2：利用所述自體脂肪組織制備原代脂肪干細胞；s3：利用所述原代脂肪干細胞制備第五代脂肪干細胞，并獲得細胞培養(yǎng)上清液；選擇第五代脂肪干細胞，是一種質(zhì)量控制的方式，更穩(wěn)定也使干細胞狀態(tài)最佳的代數(shù)。代數(shù)往后的細胞干細胞特性會不佳。s4：將所述細胞培養(yǎng)上清液進行離心，棄上清并收集上清溶液，并對所述上清溶液進行過濾；s5：進行超濾濃縮后，加入凍干保護劑，進行冷凍干燥，得到所述自體脂肪干細胞生物活性肽凍干粉。作為優(yōu)選方案，所述自體脂肪組織的提取方法為：在局部麻醉的狀態(tài)下，在腰腹部皮下注射膨脹液后，利用66.5～93.1kpa的負壓進行脂肪抽取。作為優(yōu)選方案，所述膨脹液包含如下重量或體積的各組分：作為優(yōu)選方案，所述原代脂肪干細胞的制備方法為：去除自體脂肪組織中的膨脹液后，用生理鹽水對自體脂肪組織進行洗滌；加入ii型膠原酶溶液，進行消化后，離心消化產(chǎn)物，去除上層脂肪組織，保留沉淀和部分中間層溶液，得到原代脂肪干細胞。作為優(yōu)選方案，所述第五代脂肪干細胞的制備方法為：配制干細胞培養(yǎng)基；將所述原代脂肪干細胞接種于干細胞培養(yǎng)基中，在37℃、5v/v％co2的條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)7天左右觀察到細胞集落，并繼續(xù)培養(yǎng)；當細胞融合度達80～85％時，用生理鹽水溫和沖洗培養(yǎng)瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室溫放置30秒，并在顯微鏡下觀察細胞背景變透亮，細胞間隙變大，輕輕拍打瓶壁，加入5毫升完全培養(yǎng)基終止消化，并反復沖洗培養(yǎng)瓶底部，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中，混勻計數(shù)，按照1*105密度繼續(xù)接種傳代，2～4天細胞密度達到80～85％時重復以上操作，獲得大量第五代脂肪間充質(zhì)干細胞。作為優(yōu)選方案，所述凍干保護劑包括右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸。作為優(yōu)選方案，步驟s5中所述的冷凍干燥的具體操作為：在-30℃下預冷4h；在-25℃的溫度、5pa的負壓下，冷凍過夜后，在30℃的溫度、5pa的負壓下干燥1h。本發(fā)明使用自體脂肪干細胞作為生物活性肽的來源，避免異體的感染和過敏風險；無動物源性無酚紅指示劑和抗生素的培養(yǎng)方法；通過超濾和真空冷凍抽干，使得生物活性肽以凍干粉形式保存，方便稀釋、運輸和配置。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：合理方式收集干細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)過一系列處理，在保證回收率的情況下，獲得的未變性的生物因子活性肽凍干粉。這種凍干粉在低溫下可以長期保存，便于運輸，成分穩(wěn)定的批量凍干粉。在簡單的溶解、稀釋步驟下，能夠獲得目的濃度的生物活性肽溶液，用于皮膚修復、皮膚護理、保養(yǎng)的產(chǎn)品生產(chǎn)；現(xiàn)有技術(shù)中的臍帶間充質(zhì)干細胞來源于異體臍帶組織，非自體，屬于同種異體來源。本專利所申請自體脂肪干細胞生物活性肽通過采集自身脂肪獲得干細胞來源。臍帶組織來源豐富，采集簡單，但是異體干細胞來源的產(chǎn)物需要嚴格篩選異體干細胞種子，不合格的干細胞種子會帶來感染風險。有研究表明，脂肪干細胞相較于其它來源干細胞，例如臍帶干細胞、骨髓干細胞、牙髓干細胞等，分泌的生物活性肽更為豐富，含量更高。相比于現(xiàn)有技術(shù)中的臍帶干細胞生物活性肽使用的是細胞裂解物，裂解物中蛋白成分復雜，雖然濃度高，但大多為無活性的細胞結(jié)構(gòu)蛋白，本發(fā)明技術(shù)使用收集干細胞上清，上清中含大量分泌因子，多為對皮膚修復生長至關(guān)重要的營養(yǎng)、修復、再生因子。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1為使用貼壁試劑培養(yǎng)10天(圖1a)和不使用貼壁試劑培養(yǎng)10天(圖1b)的效果對比圖；圖2為自體脂肪干細胞p0(圖2a)和自體脂肪干細胞p5(圖2b)的對比圖；圖3為p5代自體脂肪干細胞流式細胞圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。本實施例涉及一種制備自體脂肪干細胞生物活性肽凍干粉的方法，包括如下步驟：1、吸脂術(shù)采集自體脂肪組織。局部麻醉狀態(tài)下吸脂術(shù)采集自體腰腹部脂肪25-50ml凈脂肪，配置1000毫升膨脹液包含：1％利多卡因40毫升、1毫克腎上腺素、8.4％碳酸氫鈉20毫升，并用乳酸林格液配齊1000毫升。在腰腹部皮下注射50毫升膨脹液后負壓66.5～93.1kpa(500～700mmhg)抽取100毫升脂肪。2、制備原代脂肪干細胞。將脂肪組織在4℃和1000g條件下離心，去除膨脹液，并用生理鹽水洗滌后，獲得純凈脂肪組織。加入等體積6％質(zhì)量體積比(即100ml溶液中6毫克)的ⅱ型膠原酶溶液，在37℃水浴環(huán)境下消化30分鐘，加入終止液后充分混勻并1000g(重力加速度)離心消化產(chǎn)物，去除上層脂肪組織，保留沉淀和部分中間層溶液，獲得原代脂肪干細胞。其中的消化液的配方為：6％質(zhì)量體積比的ⅱ型膠原酶、2％人血清白蛋白(即以生理鹽水為溶劑，100ml溶劑中含有6mgii型膠原酶，2ml人血清白蛋白)。終止液為20毫升clinicmacs溶液。3、培養(yǎng)穩(wěn)定第五代脂肪干細胞。①在培養(yǎng)原代脂肪干細胞前一天預處理75cm2培養(yǎng)瓶。稀釋商品化貼壁試劑至1％，吸取5毫升包被培養(yǎng)瓶，在4℃環(huán)境下過夜，備用。使用貼壁試劑可以提高原代脂肪干細胞的接種成功數(shù)量，提高產(chǎn)量縮短生產(chǎn)時間(圖1a)，不使用貼壁試劑會減少細胞貼壁，減少產(chǎn)量(圖1b)。②配制干細胞培養(yǎng)基。采用無酚紅無血清培養(yǎng)法，將基礎培養(yǎng)基和血清替代物按照10v/v％的比例混合，配制成無血清完全培養(yǎng)基。此步驟不添加動物血清和抗生素，部分人對動物血清可能會過敏，造成副作用，本步驟避免此類反應。部分人對細胞培養(yǎng)過程中添加的抗生素過敏，本步驟不使用抗生素，避免此類反應。③原代脂肪干細胞接種。將獲得的原代脂肪干細胞按照1*106/cm2密度接種在步驟①獲得的培養(yǎng)瓶中，放置在設定為37℃，5％(壓力比)co2的細胞孵箱中。在72小時后更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)7天左右觀察到細胞集落(見圖2a)，并繼續(xù)培養(yǎng)。④脂肪干細胞傳代。當細胞融合度達80～85％時，用生理鹽水溫和沖洗培養(yǎng)瓶底部2次，加入4～5毫升消化液，室溫放置30秒，并在顯微鏡下觀察細胞背景變透亮，細胞間隙變大，輕輕拍打瓶壁，加入5毫升完全培養(yǎng)基終止消化，并反復沖洗培養(yǎng)瓶底部，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中，混勻計數(shù)，按照1*105密度繼續(xù)接種傳代，2～4天細胞密度達到80～85％時重復以上操作，已獲得大量p5代脂肪間充質(zhì)干細胞(見圖2b)。其中的傳代消化液為0.25wt％胰酶。⑤脂肪干細胞檢測。臺盼藍染色法檢測活率大于95％；流式細胞術(shù)檢測細胞陽性標志物(cd73、cd90、cd105)大于90％；陰性標志物(cd31、cd34、cd45、hla-dr)小于5％；快速內(nèi)毒素檢測小于0.5eu；衣原體和支原體檢測陰性。見圖3。4、收集預處理脂肪干細胞培養(yǎng)上清液。根據(jù)細胞狀態(tài)和個體差異，最后獲得p5代脂肪間充質(zhì)干細胞數(shù)目將在2*109，同時獲得脂肪干細胞培養(yǎng)上清液10～15升。收集干細胞培養(yǎng)上清，通過高速離心去除不溶物質(zhì)和懸浮細胞，離心條件為4℃和16000g(重力加速度)，時間25分鐘，棄上清并收集上清溶液。此步驟去除游離染色質(zhì)、懸浮細胞和不溶大分子。將獲得的溶液通過0.22μm過濾器去除細菌和殘余不溶物質(zhì)。5、在4℃冷房環(huán)境內(nèi)對獲得溶液進行超濾濃縮，選用孔徑在0.2nm的超濾膜，操作壓力為0.35mpa，進行超濾，濃縮上清液體體積，將10l液體超濾至500-800ml,混勻后轉(zhuǎn)入一個新容器，本步驟可以去除上清液中多余的水，和絕大多數(shù)無機鹽，這些無機鹽對蛋白質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)品使用都會有明顯的副作用；6、將步驟5獲得的上清液加入凍干保護劑并轉(zhuǎn)移到真空冷凍干燥機器中。①預冷冷凍干燥機。設定-30℃預冷4小時；②設定穩(wěn)定在-25℃，在5帕負壓下，操作過夜，將中溶液成分凍干成粉末狀。③設定30℃，保持5帕負壓，繼續(xù)干燥1小時。其中的凍干保護劑為1wt％右旋糖苷、0.5wt％海藻糖、1.5wt％甘露醇和0.5wt％精氨酸的混合物，其中，右旋糖苷、海藻糖、甘露醇和精氨酸質(zhì)量比為0.01：0.5：1.5：0.5。7、將步驟6獲得的凍干粉末壓塞裝入西林瓶，貼以標簽。凍干操作對樣品回收比例的影響如表1所示，其中，非凍干樣本7天樣本回收比例(e組)；凍干樣本7天樣本回收比例(f組)；表1、液體4℃保存7天和凍干7天后溶解濃度對比(pg/ml)：因子處理前濃度e組濃度e組回收率f組濃度f組回收率pdgf42.4115.7337.1％33.7079.5％bfgf154.2963.8641.4％148.6596.3％kgf76.5523.0430.1％45.7559.8％tgf-β1122.3145.6037.3％97.9980.1％hgf880.64401.4945.6％684.3277.7％fibronectin2570.671290.6550.2％2319.9390.2％vegf790.50586.7674.2％620.6478.5％typeicollagen856.21268.3331.3％823.9696.2％以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。當前第1頁12