一種提高人睪丸精子檢出的溶液的制作方法

文檔序號(hào)：11570282閱讀：640來(lái)源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及一種精子檢出液，具體涉及一種提高人睪丸精子檢出的溶液。

背景技術(shù)：

在治療男性不育的過(guò)程中，由于精液中無(wú)精子或排出體外的精子質(zhì)量不佳，通常會(huì)采用穿刺或切開(kāi)睪丸獲取精子，通過(guò)單精子卵胞漿內(nèi)注射技術(shù)達(dá)到體外受精輔助生育的目的。正常生理狀態(tài)下睪丸精子不具有自然運(yùn)動(dòng)能力，自睪丸中取出的不運(yùn)動(dòng)精子混雜于大量各種生精上皮細(xì)胞中,對(duì)于操作而言辨認(rèn)難度較大，且不動(dòng)精子無(wú)法直觀地通過(guò)顯微鏡下觀察來(lái)辨認(rèn)其是否具有生命力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種提高人睪丸精子檢出的溶液，該溶液能有效解決睪丸精子不運(yùn)動(dòng)而難以辨別其是否具有生命力的問(wèn)題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種提高人睪丸精子檢出的溶液，該溶液包括以下組分且其最終濃度為：氯化鈉90～110mmol/l、氯化鉀3.0～3.5mmol/l、硫酸鎂0.3～0.8mmol/l、氯化鈣1～5mmol/l、磷酸二氫鈉0.01～0.1mmol/l、乳酸鈉5～10mmol/l、碳酸氫鈉30～35mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸5～10mmol/l、丙酮酸鈉0.1～0.5mmol/l、己酮可可堿5～10mmol/l、咖啡因1～5mmol/l，其余為超純水。

進(jìn)一步，該提高人睪丸精子檢出的溶液包括以下組分且其最終濃度為：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀3.2mmol/l、硫酸鎂0.5mmol/l、氯化鈣2.0mmol/l、磷酸二氫鈉0.053mmol/l、乳酸鈉10mmol/l、碳酸氫鈉30.9mmol/l、4-羥乙基哌嗪乙磺酸10mmol/l、丙酮酸鈉0.25mmol/l、己酮可可堿7.5mmol/l、咖啡因2.5mmol/l，其余為超純水。

本發(fā)明的有益效果是：該溶液中的無(wú)機(jī)鹽組分全面模擬了細(xì)胞外液的生理環(huán)境，為精子提供了良好的生存環(huán)境；溶液中添加丙酮酸鈉，能夠有效抑制caspase-3而改善細(xì)胞凋亡，并增加谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比率，提升細(xì)胞的抗氧化能力；溶液中的咖啡因不僅可以影響細(xì)胞中線粒體的能量代謝，而且還能夠刺激精子獲能及自發(fā)的頂體反應(yīng)，從而提升精子的運(yùn)動(dòng)能力；溶液中添加的己酮可可堿能夠有效激活并增加睪丸精子的活動(dòng)能力，同時(shí)己酮可可堿還可以抑制環(huán)腺苷酸的分解，而細(xì)胞內(nèi)camp在激活精子運(yùn)動(dòng)中扮演著中心角色。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，溶液還包括1％wt的酚紅。

采用上述進(jìn)一步技術(shù)方案的有益效果是：酚紅是一種很好的ph指示劑，ph不同時(shí)，酚紅顏色變化明顯。本發(fā)明溶液正常ph在7.4左右，此時(shí)酚紅呈粉紅色到橙紅色，當(dāng)溶液顏色與此不符時(shí)，證明溶液已經(jīng)變質(zhì)酸化，不能繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)，避免了溶液變質(zhì)而帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步，溶液的ph值為7.2～7.4。

采用上述進(jìn)一步技術(shù)方案的有益效果是：配置溶液的ph值與人體細(xì)胞液的ph值處于同一范圍，為離體的精子提供類似與人體的生存環(huán)境，更加有利于精子的運(yùn)動(dòng)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說(shuō)明。

本發(fā)明的實(shí)施例中，提供了一種提高人睪丸精子檢出的溶液。本發(fā)明的目的是在體外培養(yǎng)采用穿刺或切開(kāi)睪丸獲取的精子，因此所配置的溶液應(yīng)當(dāng)與人體細(xì)胞液的成分基本類似。為達(dá)到上述目的，先進(jìn)行基礎(chǔ)溶液的配制，所述基礎(chǔ)溶液包括以下組分，而且每種組分在使用時(shí)的最終濃度如下：

氯化鈉90～110mmol/l、氯化鉀3.0～3.5mmol/l、硫酸鎂0.3～0.8mmol/l、氯化鈣1～5mmol/l、磷酸二氫鈉0.01～0.1mmol/l、乳酸鈉5～10mmol/l、碳酸氫鈉30～35mmol/l。

基礎(chǔ)溶液的配制是將稱取好的組分依次溶于超純水中，在溶解過(guò)程中不斷攪拌，使各個(gè)組分充分混合，需要特別注意的是，碳酸氫鈉最后溶解，以免在溶解攪拌過(guò)程中發(fā)生分解；上述組分溶解完成后，檢測(cè)溶液的ph值，如果溶液的ph不在7.2～7.4范圍內(nèi)，則用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph，直至ph滿足要求為止，此時(shí)溶液的生理環(huán)境與細(xì)胞液的生理環(huán)境基本類似；要長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的ph范圍，還需要向基礎(chǔ)溶液中添加緩沖劑，在本發(fā)明中，緩沖劑包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，它是一種氫離子緩沖劑，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，與磷酸二氫鈉和乳酸鈉一同調(diào)節(jié)溶液ph值，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持基礎(chǔ)溶液的ph值穩(wěn)定，本緩沖劑的終濃度在5～10mmol/l的范圍內(nèi)。

配置好的基礎(chǔ)溶液能夠?yàn)閺牟G丸中取出的精子提供良好的生存環(huán)境，但還不能解決精子不運(yùn)動(dòng)的問(wèn)題，為了提高精子的活動(dòng)能力，還需要在溶液中添加其他的組分。丙酮酸鈉能夠通過(guò)抑制caspase-3而改善細(xì)胞的凋亡，除此之外，丙酮酸鈉還可以增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比率，具有改善細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的作用，使細(xì)胞的抗氧化能力大大提高；添加的丙酮酸鈉的最終摩爾濃度為0.1～0.5mmol/l。除了添加丙酮酸鈉外，還向基礎(chǔ)溶液中添加了咖啡因，咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，它可以作用于線粒體能量代謝導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力的增加，同時(shí)還能刺激精子獲能及自發(fā)的頂體反應(yīng)；添加的咖啡因的最終摩爾濃度為1～5mmol/l。細(xì)胞中的環(huán)磷酸腺苷(camp)在精子運(yùn)動(dòng)中扮演中心角色，細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷的濃度直接決定了精子運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱；向溶液中添加己酮可可堿，己酮可可堿是一種非特異性磷酸二酯酶(pde)的抑制劑，它擁有抑制磷酸二酯酶活性的功效，能有效降低第二信使(camp或cgmp)的水解，提升細(xì)胞內(nèi)camp或cgmp的濃度，從而改善精子的運(yùn)動(dòng)能力；添加的己酮可可堿的最終摩爾濃度為5～10mmol/l。

最終成品溶液是采用以下方法制得的：

a.向基礎(chǔ)溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可堿，在添加過(guò)程中緩慢攪拌，使上述幾種組分充分溶解到基礎(chǔ)溶液中。

b.溶解完成后，在超凈工作臺(tái)下采用孔徑為2.2μm的除菌過(guò)濾器對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后分裝4℃儲(chǔ)存。

為了隨時(shí)監(jiān)控溶液的質(zhì)量，避免溶液變質(zhì)而帶來(lái)危險(xiǎn)，向成品溶液中添加指示劑。由于成品溶液的ph偏堿性，因此可以用ph指示劑。在現(xiàn)有的ph指示劑中，酚紅由于其性質(zhì)穩(wěn)定、變色靈敏而受到廣泛應(yīng)用。當(dāng)ph在7.2～7.4的范圍時(shí)，酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，ph小于6.8時(shí)為黃色，ph大于8.4時(shí)為紅色，顏色變化比較明顯；本發(fā)明溶液的ph在7.2～7.4的范圍內(nèi)，溶液應(yīng)當(dāng)呈粉紅色到橙紅色，如果溶液的顏色明顯發(fā)生變化，則證明溶液的ph發(fā)生變化，溶液已經(jīng)變質(zhì)，不再適合繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)，需要另行配置溶液。

下面的實(shí)施例只是用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，并不以任何方式限制發(fā)明的范圍。

臨床上罹患無(wú)精子癥而需進(jìn)行睪丸活檢的睪丸組織，即采用外科手段如穿刺或切開(kāi)睪丸獲取睪丸組織，完成相關(guān)鏡檢觀察后分離細(xì)胞懸液用于以下實(shí)施例之測(cè)試。

(1)實(shí)施例一

首先配制基礎(chǔ)溶液，基礎(chǔ)溶液的組分及它們的最終濃度如下：氯化鈉90mmol/l、氯化鉀3mmol/l、硫酸鎂0.3mmol/l、氯化鈣1mmol/l、磷酸二氫鈉0.01mmol/l、乳酸鈉5mmol/l、碳酸氫鈉30mmol/l。上述組分溶解完成后，用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液ph至7.2，再向溶液中添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖劑，緩沖劑的最終濃度為5mmol/l。然后向溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可堿，它們的最終濃度分別為丙酮酸鈉0.1mmol/l、咖啡因1mmol/l、己酮可可堿5mmol/l。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚紅，在超凈工作臺(tái)下采用孔徑為2.2μm的除菌過(guò)濾器對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后分裝4℃儲(chǔ)存。

將取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育5分鐘，顯微鏡下觀察辨識(shí)并挑選活動(dòng)的精子。

本實(shí)施方式精子的檢出結(jié)果如下：

(2)實(shí)施例二

首先配制基礎(chǔ)溶液，基礎(chǔ)溶液的組分及它們的最終濃度如下：氯化鈉110mmol/l、氯化鉀3.5mmol/l、硫酸鎂0.8mmol/l、氯化鈣5mmol/l、磷酸二氫鈉0.1mmol/l、乳酸鈉10mmol/l、碳酸氫鈉35mmol/l。上述組分溶解完成后，用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液ph至7.2，再向溶液中添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖劑，緩沖劑的最終濃度為10mmol/l。然后向溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可堿，它們的最終濃度分別為丙酮酸鈉0.5mmol/l、咖啡因5mmol/l、己酮可可堿10mmol/l。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚紅，在超凈工作臺(tái)下采用孔徑為2.2μm的除菌過(guò)濾器對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后分裝4℃儲(chǔ)存。

將取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育5分鐘，顯微鏡下觀察辨識(shí)并挑選活動(dòng)的精子。

本實(shí)施方式精子的檢出結(jié)果如下：

(3)實(shí)施例三

首先配制基礎(chǔ)溶液，基礎(chǔ)溶液的組分及它們的最終濃度如下：氯化鈉100mmol/l、氯化鉀3.2mmol/l、硫酸鎂0.5mmol/l、氯化鈣2.0mmol/l、磷酸二氫鈉0.053mmol/l、乳酸鈉10mmol/l、碳酸氫鈉30.9mmol/l。上述組分溶解完成后，用提前配置好的氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液ph至7.2，再向溶液中添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖劑，緩沖劑的最終濃度為8mmol/l。然后向溶液中依次添加稱好的丙酮酸鈉、咖啡因和己酮可可堿，它們的最終濃度分別為丙酮酸鈉0.25mmol/l、咖啡因2.5mmol/l、己酮可可堿7.5mmol/l。溶解完成后，向溶液中添加1％wt的酚紅，在超凈工作臺(tái)下采用孔徑為2.2μm的除菌過(guò)濾器對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后分裝4℃儲(chǔ)存。

將取得的精子置于配制好的溶液中，在37℃下孵育5分鐘，顯微鏡下觀察辨識(shí)并挑選活動(dòng)的精子。

本實(shí)施方式精子的檢出結(jié)果如下：

(4)實(shí)施例四