本發(fā)明涉及植物病理學(xué)、遺傳育種及分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由豌豆白粉菌(erysiphepisid.c.)引起的豌豆白粉病是世界性豌豆病害(nisaretal.,2011；fondevillaetal.,2012)。防治豌豆白粉病最為經(jīng)濟(jì)、有效且環(huán)境安全的方法是種植抗病品種。目前，國外已經(jīng)鑒定了大量的抗白粉病豌豆資源，并在抗性資源中鑒定了3個(gè)獨(dú)立遺傳的抗白粉病基因(er1，er2，er3)(harlandetal.,1948；heringaetal.,1969)，而大量抗性資源篩選和遺傳分析結(jié)果表明，許多不同地理起源的抗白粉病豌豆資源的抗性均由er1基因控制(tiwarietal.,1997；ghafooretal.,2012；liuetal.,2003；vaidetal.,1997)。er1基因具有廣譜、持久抗性，已在歐洲、北美洲及澳大利亞的豌豆育種中廣泛應(yīng)用(fondevillaetal.,2007)?？共』騟r1和er2分別被定位在豌豆遺傳圖譜的第6連鎖群(lgvi)(timmermanetal.,1994)和第3連鎖群(lgⅲ)(katochetal.,2010)。

最近研究發(fā)現(xiàn)，豌豆抗白粉病基因er1是由感病基因psmlo1功能喪失而產(chǎn)生的(humphryetal.，2011；pavanetal.,2011)。在自然和誘變條件下，豌豆感白粉病基因psmlo1的序列發(fā)生堿基缺失、插入、替換等導(dǎo)致不同的er1等位基因產(chǎn)生，目前已經(jīng)鑒定了7個(gè)er1等位基因即er1-1、er1-2、er1-3、er1-4、er1-5、er1-6和er1-7(humphryetal.,2011；pavanetal.,2011；sunetal.,2016a；sunetal.,2016b)。除了er1-2是由大片段的插入和缺失產(chǎn)生的，其他6個(gè)等位基因都是由單堿基或小片段的插入、缺失或替換產(chǎn)生的。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在分子輔助育種中的廣泛應(yīng)用，基于不同的分子標(biāo)記技術(shù)，開發(fā)了已鑒定的er1的7個(gè)等位基因的功能標(biāo)記(pavanetal.,2013；sunetal.,2016a；sunetal.,2016b)，其中功能標(biāo)記er1-6和er1-7的有效性已被驗(yàn)證。近年來，kasp(kompetitiveallelespecificpcr)即競爭性等位基因特異性pcr技術(shù)，是近幾年興起的一種新的snp分型方法，具有準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)和成本低等特點(diǎn)，已經(jīng)在多種植物上被廣泛應(yīng)用于高通量的snp分型以及indels檢測(semagnetal.,2014)。

最近研究人員在豌豆資源中篩選出了一些白粉病免疫資源(王仲怡等，2012)。通過psmlo1同源序列分析在豌豆資源g0004400中鑒定了一個(gè)新等位基因er1-9，該基因在psmlo1cdna序列開放閱讀框第928堿基處發(fā)生突變，t堿基缺失，這一堿基缺失突變導(dǎo)致第310個(gè)氨基酸由絲氨酸(s)變?yōu)榱涟彼?l)，從而引起psmlo1蛋白功能的變化。為了通過分子輔助選擇快速、高效的將er1-9應(yīng)用于育種中，，開發(fā)與er1-9共分離的功能性分子標(biāo)記成為亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記位于豌豆遺傳圖譜第vi連鎖群上，與er1-9的遺傳距離為0cm，用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的3條特異性引物具有如下核苷酸序列：

正向引物序列1：tgttatatgggcagggtggtatc

正向引物序列2：ttttgttatatgggcagggtggtatt

通用反向引物序列：caaaatgtagattatgcttacaattagtgga。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病的分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記的引物組合，其含有：

正向引物序列1：tgttatatgggcagggtggtatc

正向引物序列2：ttttgttatatgggcagggtggtatt

通用反向引物序列：caaaatgtagattatgcttacaattagtgga。

本發(fā)明提供了上述引物組合在豌豆抗白粉病的分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記或引物組合在鑒定豌豆抗白粉病種質(zhì)資源中的應(yīng)用。

具體為，采用pcr擴(kuò)增待測豌豆的基因組dna，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為75bp時(shí)，待測豌豆為含有er1-9的抗白粉病豌豆；當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為79bp時(shí)，待測豌豆為不含有er1-9的抗白粉病或感白粉病豌豆。

本發(fā)明提供的上述分子標(biāo)記或引物組合在鑒定豌豆抗白粉病種質(zhì)資源中的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

1)提取待測豌豆的基因組dna；

2)以待測豌豆的基因組dna為模板，利用特異性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；所述特異性引物為：

fam正向引物序列1：tgttatatgggcagggtggtatc

hex正向引物序列2：ttttgttatatgggcagggtggtatt

com通用反向引物序列：caaaatgtagattatgcttacaattagtgga；

3)利用kasp分析技術(shù)檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

其中，步驟2)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以5μl計(jì)為：豌豆基因組dna2.0μl(10ng/μl)，kaspmastermix2.5μl，混合引物0.07μl，ddh2o0.43μl。

步驟2)中進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃熱激活15分鐘；95℃變性20秒，65-55℃退火和延伸25秒，10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低1.0℃；95℃變性10秒，56℃退火和延伸60秒，30個(gè)循環(huán)。

步驟3)中利用kasp分析技術(shù)檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，利用lgc系統(tǒng)的snpline平臺(tái)進(jìn)行snp分型檢測。所有含有等位基因er1-9的豌豆資源均出現(xiàn)在紅色散點(diǎn)區(qū)域，該基因具有fam標(biāo)簽序列，其基因型為--，而不含有等位基因er1-9的抗病資源和感白粉病豌豆資源均出現(xiàn)在藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)域，該基因具有hex標(biāo)簽序列，其基因型為tt，雜合材料均出現(xiàn)在綠色散點(diǎn)區(qū)域，該基因具有fam和hex兩種標(biāo)簽序列，同時(shí)具有兩種標(biāo)簽的基因型為t-。

本發(fā)明還提供了用于檢測抗白粉病豌豆資源的試劑盒，所述試劑盒中含有本發(fā)明所述述的特異性引物組合。

進(jìn)一步地，步驟3)的pcr擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以5μl計(jì)為：豌豆基因組dna2.0μl(10ng/μl)，kaspmastermix2.5μl，混合引物0.07μl，ddh2o0.43μl。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃15分鐘；95℃20秒，65-55℃25秒，10個(gè)循環(huán)(每循環(huán)降低1.0℃)，95℃10秒，56℃60秒，30個(gè)循環(huán)。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用kasp分析技術(shù)檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，所有含有等位基因er1-9的豌豆資源均擴(kuò)增出75bp的片段，經(jīng)kasp分析檢測其結(jié)果均出現(xiàn)在紅色散點(diǎn)區(qū)域，而其他不含有等位基因er1-9的抗白粉病和感白粉病豌豆資源均擴(kuò)增出79bp的片段，經(jīng)kasp分析檢測其結(jié)果均出現(xiàn)在藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)域。

本發(fā)明還提供用于pcr檢測抗白粉病豌豆資源的試劑盒，所述試劑盒中含有所述的用于pcr擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的特異性引物對(duì)。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括kaspmastermix和ddh2o、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述的試劑盒在植物分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

具體地，本發(fā)明的與豌豆抗白粉病er1等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的：

利用抗病資源g0004400與感病品種壩豌6號(hào)同源的psmlo1cdna序列的snp差異(t堿基缺失)，基于kasp技術(shù)在同源的psmlo1cdna序列snp突變位點(diǎn)兩側(cè)分別設(shè)計(jì)kasp特異性引物，開發(fā)與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記，隨后，將該標(biāo)記用于鑒定抗病親本g0004400與感病親本壩豌6號(hào)雜交衍生的f2群體的各個(gè)單株的基因型，通過kasp技術(shù)分析，該標(biāo)記在f2群體中出現(xiàn)三組明顯不同的散點(diǎn)區(qū)域，分別對(duì)應(yīng)于純合抗病基因型、純合感病基因型和雜合基因型三種類型。這三種基因型與該f2群體衍生的f3群體的各個(gè)家系表現(xiàn)型一一對(duì)應(yīng)，證明該標(biāo)記為與抗病基因er1-9共分離的分子標(biāo)記。隨后，將所述分子標(biāo)記用于鑒定豌豆抗白粉病資源。結(jié)果表明，所述分子標(biāo)記能夠有效區(qū)分出含有抗白粉病等位基因er1-9的豌豆資源。本發(fā)明為豌豆抗白粉病分子輔助選擇育種提供分子標(biāo)記，從而加速豌豆抗白粉病育種工作進(jìn)程。

具體實(shí)施方案：

(1)er1-9的功能分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)含有er1-9的抗病資源g0004400和感病品種壩豌6號(hào)的同源psmlo1序列比對(duì)結(jié)果，g0004400的cdna與壩豌6號(hào)的cdna序列之間存在單堿基差異(928處，t堿基缺失)，利用kasp技術(shù)在序列snp突變位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)kasp的三個(gè)特異引物，包括兩個(gè)正向引物，一個(gè)共用反向引物，開發(fā)功能性標(biāo)記。引物設(shè)計(jì)及合成由中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司完成。

首先，用g0004400和壩豌6號(hào)及20個(gè)f2單株的基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，根據(jù)基因分型檢測引物的有效性，如果能明顯區(qū)分出3組不同的散點(diǎn)區(qū)域，證明是有效的。隨后將開發(fā)的的分子標(biāo)記用于鑒定抗病親本g0004400和感病親本壩豌6號(hào)雜交衍生的f2群體的119個(gè)單株的基因型。發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記在f2群體中形成明顯不同的三組散點(diǎn)區(qū)域，分別對(duì)應(yīng)于純合抗病、純合感病和雜合三種基因型，這三種不同的散點(diǎn)區(qū)域與f3群體的性狀表現(xiàn)型一一對(duì)應(yīng)(圖1)，這表明所述分子標(biāo)記是與er1-9共分離的共顯性功能標(biāo)記。

(2)功能分子標(biāo)記的應(yīng)用

將開發(fā)的分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病資源鑒定中進(jìn)行應(yīng)用和功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，在所有檢測的豌豆資源中，pcr產(chǎn)物經(jīng)kasp技術(shù)分析，只有含有抗白粉病等位基因er1-9的豌豆資源g0004400出現(xiàn)在紅色散點(diǎn)區(qū)域(圖2)。而含有其它er1等位基因er1-1(tara、cooper、云豌8號(hào))、er1-2(x9002、須菜1號(hào)、云豌21、云豌23)、er1-4(yi)、er1-6(g0001778、g0001752、g0001763)、er1-7(ddr11)的豌豆資源以及80份感病資源(壩豌6號(hào)、隴豌1號(hào)、奇珍76等)均出現(xiàn)在藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)域。分析結(jié)果證明所述分子標(biāo)記能夠準(zhǔn)確區(qū)分含抗病等位基因er1-9的豌豆資源。此結(jié)果驗(yàn)證了所述分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病資源鑒定中的有效性。

本發(fā)明開發(fā)了與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記，該抗病基因er1-9是在引進(jìn)豌豆資源中鑒定的，對(duì)我國豌豆白粉病具有廣譜抗性，可有效控制我國豌豆白粉病的發(fā)生，減輕該病害造成的產(chǎn)量損失。基于pcr擴(kuò)增和kasp分析技術(shù)，將與該基因共分離的分子標(biāo)記有效的應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種中；kasp具有高通量、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明利用kasp技術(shù)開發(fā)的分子標(biāo)記在豌豆生產(chǎn)、育種工作和抗病機(jī)理的研究中具有重要價(jià)值。其優(yōu)點(diǎn)在于：

(一)本發(fā)明的與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記，是在g0004400及其抗性穩(wěn)定的雜交后代家系中獲得并驗(yàn)證的功能標(biāo)記。可有效應(yīng)用于豌豆抗白粉病資源鑒定和豌豆抗白粉病后代群體的分子標(biāo)記輔助育種。

(二)利用本發(fā)明的與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記，能夠成功鑒定含抗白粉病基因er1-9的豌豆資源，從而證明該分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病資源鑒定中具有有效性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用kasp技術(shù)分析與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記在抗病資源g0004400和感病品種壩豌6號(hào)雜交衍生的f2群體所有單株的基因型散點(diǎn)圖；其中，1為紅色散點(diǎn)區(qū)，紅色點(diǎn)為純合抗病基因型--，2為綠色散點(diǎn)區(qū)，綠色點(diǎn)為雜合基因型t-，3為藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)，藍(lán)色點(diǎn)為純合感病基因型tt。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中利用kasp技術(shù)分析與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記在12份已明確豌豆抗白粉病基因的豌豆抗病資源及80份豌豆感病資源中形成的基因型散點(diǎn)圖；其中，1為紅色散點(diǎn)區(qū)，紅色點(diǎn)為er1-9的基因型--，3為藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)，藍(lán)色點(diǎn)為非er1-9的基因型tt。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。本實(shí)施例所采用的豌豆種質(zhì)資源均來自國家種質(zhì)資源庫。

實(shí)施例1與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)豌豆抗白粉病資源g0004400和感病品種壩豌6號(hào)的基因psmlo1的cdna序列及野生型psmlo1序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)g0004400含有一個(gè)新的等位基因er1-9，該等位基因在的psmlo1序列開放閱讀框第928處發(fā)生單堿基(t)缺失，利用kasp技術(shù)開發(fā)用于pcr擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的特異性引物，包括3種特異性引物(正向引物1、正向引物2和共用反向引物)，如下，在抗感親本上擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為75bp和79bp；

fam正向引物序列1：tgttatatgggcagggtggtatc

hex正向引物序列2：ttttgttatatgggcagggtggtatt

com通用反向引物序列：caaaatgtagattatgcttacaattagtgga

引物設(shè)計(jì)及合成由中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司完成。

首先用g0004400和壩豌6號(hào)和20個(gè)f2群體單株的基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測引物的有效性。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以5μl計(jì)為：豌豆基因組dna2.0μl(10ng/μl)，kaspmastermix2.5μl，混合引物0.07μl，ddh2o0.43μl。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃15分鐘；95℃20秒，65-55℃25秒，10個(gè)循環(huán)(每循環(huán)降低1.0℃)，95℃10秒，56℃60秒，30個(gè)循環(huán)。

利用kasp技術(shù)檢測pcr產(chǎn)物在抗、感親本及衍生f2群體的基因型。kasp分析結(jié)果顯示分子標(biāo)記在抗、感親本及20個(gè)f2單株間形成三組明顯不同的散點(diǎn)區(qū)域，分別代表三種基因型。表明分子標(biāo)記在抗、感品種間具有多態(tài)性。隨后將該分子標(biāo)記進(jìn)行f2整個(gè)群體(119個(gè)單株)驗(yàn)證，通過kasp技術(shù)分析，群體中出現(xiàn)三組明顯不同的散點(diǎn)區(qū)域，這三組顏色不同的散點(diǎn)區(qū)域分別對(duì)應(yīng)于純合抗病、純合感病和雜合三種基因型(圖1)。并且標(biāo)記在f2群體中的分離模式通過x²檢驗(yàn)，符合1:2:1比例，表明所述分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記。三組散點(diǎn)區(qū)域分別與f3群體的純合抗病、純合感病和抗感分離的株系的表現(xiàn)型一一對(duì)應(yīng)，這表明該分子標(biāo)記是與抗病基因er1-9共分離的功能標(biāo)記。通過mapmaker3.0軟件計(jì)算遺傳連鎖距離，使用mapdraw構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。該標(biāo)記與抗病基因er1-9的遺傳距離為0cm，所述分子標(biāo)記是與er1-9共分離的功能標(biāo)記。

實(shí)施例2與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記的應(yīng)用

將開發(fā)的er1-9的功能性分子標(biāo)記在97份已明確抗白粉基因的豌豆資源上進(jìn)行應(yīng)用和功能驗(yàn)證。結(jié)果表明，所述分子標(biāo)記在所有檢測的抗病和感病豌豆資源中呈現(xiàn)出兩組明顯不同的散點(diǎn)區(qū)域。通過kasp分析技術(shù)，含有抗病等位基因er1-9的豌豆資源g0004400出現(xiàn)在紅色散點(diǎn)區(qū)域(圖2)。含有其它er1等位基因er1-1(tara、cooper、云豌8號(hào))、er1-2(x9002、須菜1號(hào)、云豌21、云豌23)、er1-4(yi)、er1-6(g0001778、g0001752、g0001763)、er1-7(ddr11)以及80份感病資源(壩豌6號(hào)、隴豌1號(hào)、奇珍76等)均出現(xiàn)在藍(lán)色散點(diǎn)區(qū)域(圖2)。結(jié)果表明該標(biāo)記利用kasp分析技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定出含抗病基因er1-9的豌豆資源。此結(jié)果驗(yàn)證了所述分子標(biāo)記在豌豆抗白粉病資源鑒定中的有效性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>與豌豆抗白粉病等位基因er1-9共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>khp171111433.2tq

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgttatatgggcagggtggtatc23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ttttgttatatgggcagggtggtatt26

<210>3

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

caaaatgtagattatgcttacaattagtgga31

<210>4

<211>75

<212>dna

<213>豌豆

<400>4

tgttatatgggcagggtggtatcttattattggcttccatttcttccactaattgtaagc60

ataatctacattttg75

<210>5

<211>79

<212>dna

<213>豌豆

<400>5

ttttgttatatgggcagggtggtattcttattattggcttccatttcttccactaattgt60

aagcataatctacattttg79