本發(fā)明涉及一種從罌粟科紫堇屬植物中提取、分離白毛茛堿的方法，具體是一種從賽北紫堇中大量制取高純度白毛茛堿的方法。

背景技術：

賽北紫堇(corydalisimpatiens)為罌粟科紫堇屬植物，收載于《中華本草》藏藥卷，其根、莖、葉、花均可入藥，具有除熱消腫、活血散瘀、收斂止癢、祛風利氣等功效。賽北紫堇廣泛分布在青海、西藏、甘肅、四川及內(nèi)蒙古等地，為藏藥常用藥材。本屬植物主要含芐基異喹啉類、苯酚異喹啉類、苯并菲啶類、小檗堿類、阿樸菲類、普羅托品類及螺芐異喹啉類等結構類型的生物堿。

白毛茛堿(hydrastine)又稱北美黃連堿，是一種苯酚異喹啉類生物堿，由阿爾弗雷德·杜蘭德發(fā)現(xiàn)于1851年。有研究表明，白毛茛堿可以顯著抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)，有預防感染的功效；對具有多藥耐藥性的惡性瘧原蟲菌株有明顯的抑制效果，且對正常細胞沒有毒性；白毛茛堿可以抑制cyp2e1的活性，對對乙酰氨基酚引起的肝臟損傷起到防護作用；抑制pak4激酶活性從而抑制下游與腫瘤增長有關的信號分子，引起肺癌細胞凋亡，起到抗腫瘤的作用。此外，白毛茛堿還有降血壓、調(diào)節(jié)平滑肌和止血等功能。

目前只有從賽北紫堇中提取總生物堿的文獻，而分離白毛茛堿的文獻較少，且所得白毛茛堿的產(chǎn)率低于萬分之一。如專利cn103610762(一種塞北紫堇總生物堿提取物及提取方法，申請?zhí)?01310680353.6)采用堿性乙醇回流提取總生物堿，其中白毛茛堿的含量較低。由于生物堿在天然植物中的含量較低，用水提或有機溶劑提取的方法會引入其他成分，為了得到高純度的白毛茛堿單體必須對其進行精制純化。

技術實現(xiàn)要素：

技術問題：本發(fā)明的目的在于提供一種從賽北紫堇中提取分離白毛茛堿的方法，該方法成本低、操作簡單，得到的白毛茛堿產(chǎn)量大且純度高達99％。

技術方案：本發(fā)明提供的一種從賽北紫堇中提取分離白毛茛堿的方法，包括以下步驟：

步驟1.粉碎、堿化：將賽北紫堇全草陰干，粉碎至40-60目，得到賽北紫堇粉末，加入na2co3溶液浸泡3-4小時，晾干后過40-60目篩；

步驟2.超臨界提取：將處理好的賽北紫堇粉末裝入超臨界萃取釜中，超臨界co2萃取，用乙醇溶液為夾帶劑動態(tài)提取，解析萃取液并回收乙醇，得到粗生物堿；

步驟3.微濾：將粗生物堿浸膏溶解在酸水中并調(diào)節(jié)溶液ph值至2-3，將此溶液用孔徑在0.5-1.0微米的陶瓷膜進行微濾處理，控制微濾溫度在25-35℃，微濾壓力在0.5-0.7mpa，除去顆粒物和高分子物質(zhì)；

步驟4.超濾：將微濾后的溶液用聚砜中空纖維超濾膜進行超濾處理，分子截留量在4000-8000d，控制超濾壓力在0.1-0.3mpa，操作溫度為25-35℃，溶液ph值維持在2-3，除去大分子物質(zhì)如多糖、膠質(zhì)、蛋白質(zhì)及色素；

步驟5.離子交換樹脂分離：將所得濾液過處理好的酸性陽離子交換樹脂柱，調(diào)節(jié)上樣流速，先用去離子水沖洗至中性，除去水溶性小分子雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)洗脫流速用1％na2co3溶液堿化50-80％乙醇洗脫，收集洗脫液用碘化鉍鉀顯色劑檢測，直至無生物堿流出為止，合并檢測呈陽性的洗脫液；

步驟6.重結晶：將所得的上述洗脫液減壓濃縮、干燥，加入二氯甲烷溶解過濾，然后用常規(guī)方法重結晶，過濾，得到結晶物即為白毛茛堿。

其中，

所述的步驟1中，加入的na2co3溶液ph值為10-11，賽北紫堇粉末與na2co3溶液的質(zhì)量比為1:1.5-1:2。

所述的步驟2中，調(diào)節(jié)萃取溫度為30～45℃，萃取壓力為20～30mpa，夾帶劑為90％的乙醇溶液，萃取時間為2-4小時狀態(tài)為動態(tài)提取，流速為1.0-1.5ml/min。

所述的步驟3中，粗生物堿與酸水的質(zhì)量比為1:20-1:40；酸水溶液為鹽酸或硫酸溶液。

所述的步驟5中，所述的酸性陽離子交換樹脂采用001×7聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂；上樣流速為1-2bv/h，洗脫流速為2-3bv/h。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)超臨界流體萃取溫度較低，生物堿不易分解，且超臨界流體在高壓低溫時對生物堿的溶解性比傳統(tǒng)的有機溶劑法要強，提高了提取率。

(2)膜分離技術，設備簡單常溫下操作，藥材中的生物堿不易分解變質(zhì)，采用不同孔徑的膜依次過濾，大分子物質(zhì)有效分離，操作過程能耗低，不消耗試劑且經(jīng)過處理后的膜可重復使用。

(3)整個操作過程均在常溫下進行，具有制取過程簡單，收率高，所制得的白毛茛堿純度高等特點。

附圖說明

圖1是利用本發(fā)明制備的高純度白毛茛堿的色譜出峰圖譜。

圖2是利用本發(fā)明制備的白毛茛堿的¹h-nmr圖譜。

圖3是利用本發(fā)明制備的白毛茛堿的¹³c-nmr圖譜。

具體實施方式

下面對本發(fā)明技術方案進行詳細說明，但是本發(fā)明的保護范圍不局限于所述實施案例。

實施案例1：

首先將干燥賽北紫堇全草重約5.0kg，全草粉碎至40目，加入ph為11的na2co3溶液10l，浸泡4h，晾干后過40目篩。將堿化后的賽北紫堇粉末加入到萃取釜中，調(diào)節(jié)萃取溫度為35℃，萃取壓力為20mpa，用90％乙醇為夾帶劑，調(diào)節(jié)夾帶劑的流速為1.0ml/min，動態(tài)萃取2小時。萃取完成后減壓回收溶劑。上述生物堿浸膏50g用1l鹽酸水溶液溶解，調(diào)節(jié)ph值為2.0，控制壓力為0.5mpa，溫度為25℃用陶瓷微濾。收集濾液保持溫度不變，用截留分子量為6000d的中空纖維超濾膜超濾，控制壓力為0.3mpa。所得濾液過001×7聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂，控制上樣流速為1bv/h，用去離子水洗脫除去中性及酸性雜志，控制洗脫流速為2bv/h。再用1％na2co3溶液堿化，50％乙醇洗脫，每100ml接收一次洗脫液，薄層色譜檢測，收集碘化鉍鉀呈陽性的洗脫液。將洗脫液濃縮，用二氯甲烷溶解，過濾，重結晶即得到白毛茛堿。

實施案例2：

首先將干燥賽北紫堇全草重約5.0kg，全草粉碎至60目，加入ph為10的na2co3溶液12l，浸泡4h，晾干后過60目篩。將堿化后的賽北紫堇粉末加入到萃取釜中，調(diào)節(jié)萃取溫度為45℃，萃取壓力為25mpa，用90％乙醇為夾帶劑，調(diào)節(jié)夾帶劑的流速為1.5ml/min，動態(tài)萃取4小時。萃取完成后減壓回收溶劑。上述生物堿浸膏45g用1.8l硫酸水溶液溶解，調(diào)節(jié)ph值為3.0，控制壓力為0.6mpa，溫度為30℃用陶瓷微濾。收集濾液保持溫度不變，用截留分子量為8000d的中空纖維超濾膜超濾，控制壓力為0.2mpa。所得濾液過001×7聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂，控制上樣流速為2bv/h，用去離子水洗脫除去中性及酸性雜志，控制洗脫流速為3bv/h。再用1％na2co3堿化，70％乙醇洗脫，每100ml接收一次洗脫液，薄層色譜檢測，收集碘化鉍鉀呈陽性的洗脫液。將洗脫液濃縮，用二氯甲烷溶解，過濾，重結晶即得到白毛茛堿。

上述所得固體經(jīng)過hplc，波長254nm下測定其純度為99.0％，液相圖參照附圖1。

將得到的化合物通過¹h-nmr、¹³c-nmr進行結構鑒定，結合相關文獻報道確定該化合物為白毛茛堿。blaskog,guladj,shammam.thephthalideisoquinolinealkaloids.journalofnaturalproducts,1982,45(2):105-122.

核磁譜圖參照附圖2-3，所得白毛茛堿數(shù)據(jù)如下：無色塊狀晶體，溶于氯仿，分子式為c21h21no6，分子量為383.3。

¹h-nmr(400mhz，cdcl3)，δh6.51(1h,d,j＝8.2hz,h-7’)，7.07(1h,d,j＝8.2hz,h-6’)，6.38(1h,s,h-8)，6.58(1h,s,h-5)，3.98(1h,d,j＝3.9hz,h-1)，5.49(1h,d,j＝3.9hz,h-1’)，5.90(2h,d,j＝1.7hz,-och2o-)，3.88(3h,s,-och3),4.06(3h,s,-och3)，2.55(3h,s,-nch3)，2.26-2.89(4h,m)。

¹³c-nmr(100mhz，cdcl3)，66.1(c-1)，49.1(c-3)，26.7(c-4)，124.6(c-4α)，108.5(c-5)，146.7(c-6)，145.8(c-7)，107.8(c-8)，130.3(c-8α),82.9(c-1’α)，167.7(-co)，118.6(c-3’α)，148.0(c-4’)，152.5(c-5’)，119.7(c-6’)，117.6(c-7’)，140.8(c-7’α)，100.8(-och2o-)，61.6(-och3)，56.6(-och3)，44.9(n-ch3)。