本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物有機肥料領(lǐng)域，特別涉及一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微生物發(fā)酵有機肥料中有60％～80％的微生物目前無法用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)進行研究，從而阻礙了人們對其微生物結(jié)構(gòu)及其多樣性的客觀認識。迄今為止，發(fā)酵有機肥料中只有極少部分微生物可以被培養(yǎng)，絕大多數(shù)還不為人所知。隨著分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵有機肥料微生物的研究也深入到了基因和作用機制水平，人們能避開了傳統(tǒng)菌的群分離培養(yǎng)過程，直接從DNA水平上對這些菌群進行相關(guān)研究，從樣品中提取高質(zhì)量的、具有代表性的菌群總DNA是生物發(fā)酵肥料微生物生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)。

但是，由于以動物糞便為主的生物肥料不但組成成分復(fù)雜(含有多聚糖、膽酸、膽鹽、膽色素、腐殖質(zhì)、動物腸道脫落細胞及碎片、各種無機物和有機物等PCR的強抑制物)，而且糞便中細菌類型數(shù)目繁多，而不同細菌因其各自獨特的細胞壁成分和結(jié)構(gòu)，又對不同的提取方法的敏感程度有所差異，從而導(dǎo)致了不同方法的提取效率不盡相同，進而使得其菌群多樣性分析結(jié)果不盡如人意，甚至造成偏差。

目前微生物發(fā)酵有機肥樣品中總DNA的提取并沒有標(biāo)準、統(tǒng)一的方法，因而，選擇較好的DNA提取方法對肥料微生態(tài)研究非常關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外常用的DNA提取方法主要包括機械法，如硅珠法、凍融法等；化學(xué)法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商業(yè)試劑盒法。這幾種類型的DNA提取方法中，機械法、化學(xué)法及酶或其組合方法是實驗室常規(guī)提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超聲波或反復(fù)凍融來裂解細胞釋放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化硅等進行DNA的抽提，最后無水乙醇沉淀。這幾種常規(guī)的提取方法的優(yōu)點是：原理清楚，便于分析及查找實驗中出現(xiàn)的問題，而不足之處在于所提取的DNA純度不高或者得率較低，常含有大量的PCR抑制物，除微生物基因組外，還摻雜動物細胞、食物殘渣的基因組DNA及雜質(zhì)，純度不夠理想，需要進一步純化處理才能用于后續(xù)的實驗操作，如用蛋白酶裂解生物發(fā)酵有機肥的同時還另外用十六烷基三甲基溴化銨來除去PCR反應(yīng)抑制物，并且還用酚-氯仿進行了多次的抽提才得到較高純度的總DNA；在用蛋白酶K提取生物發(fā)酵有機肥樣品總DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子來純化得到總DNA。

目前雖然有商業(yè)的試劑盒，但采用該試劑盒進行提取，所得總DNA濃度、得率低，并且試劑盒價格較昂貴、處理大批樣品的科研成本太高，缺乏實驗室通用性，不適于用于大規(guī)模生物發(fā)酵有機肥樣品總DNA提取。另外由于專利等其它原因，試劑盒中具體成分及其含量不是很清楚，如果發(fā)生操作失敗，很難分析找出實驗失敗原因。因此，需要找到一種新的能快速、高質(zhì)、高效、廉價及無害提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的首先在于提供一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，該方法操作簡單、快速、高效、高質(zhì)，且價格經(jīng)濟，能適用于實驗室大規(guī)模提取。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，包括如下進行的步驟：

(1)預(yù)處理

取微生物發(fā)酵有機肥樣品，加入PBS緩沖液、浸泡、離心、收集沉淀，重復(fù)上述的操作步驟，至離心后上清液無色，棄上清液，收集沉淀物，記為沉淀物Ⅰ；

(2)提取

在沉淀物Ⅰ中加入蒸餾水，重懸并離心，取上清液，然后向上清液中加入枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振蕩混勻，于45-60℃水浴9-60分鐘，離心，棄上清液，記為上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在溫度低于25℃下使DNA復(fù)性，再次離心，取上清液，記為上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有總DNA。

本發(fā)明的方法主要包括生物發(fā)酵有機肥樣品的預(yù)處理、樣品DNA提取。以采集新鮮發(fā)酵有機肥樣品或凍存的樣品為材料，先用PBS緩沖液等對樣品進行預(yù)處理，以獲得樣品菌懸液，再分別以枯草桿菌蛋白酶與SDS溶液組成的混合液、裂解液與SDS溶液組成的混合液進行提取，共同裂解細胞釋放DNA。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(1)中，第一次加入PBS緩沖液的量相當(dāng)于所述微生物發(fā)酵有機肥樣品體積的3-15倍，浸泡不少于5分鐘；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1-3mL PBS溶液。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中，第一次加入PBS緩沖液的量相當(dāng)于所述微生物發(fā)酵有機肥樣品體積的10倍，浸泡15分鐘；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1mL PBS溶液。

本發(fā)明所述的方法，所述步驟(1)中，也可采用其它可實現(xiàn)除雜質(zhì)及離心分離功能的緩沖液替代PBS緩沖液。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中，離心處理的條件為：4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心至少3分鐘。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，在沉淀物Ⅰ中加入蒸餾水，重懸并離心，蒸餾水的加入量按照每200-300mg沉淀物Ⅰ添加1-3mL蒸餾水。

優(yōu)選的，蒸餾水的加入量按照每200-300mg沉淀物Ⅰ添加1mL蒸餾水。

優(yōu)選的，所述離心條件為10000轉(zhuǎn)/分鐘離心不少于3分鐘。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，所述枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的體積比2-5：1-3，所述枯草桿菌蛋白酶的初始濃度為20±2mg/ml，所述SDS溶液的初始濃度為0.1-0.2mol/L。

優(yōu)選的，所述枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的體積比3：2，所述枯草桿菌蛋白酶的初始濃度為20mg/ml，所述SDS溶液的初始濃度為0.15mol/L。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，所述上清液Ⅰ與加入的枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液體積比為1：10-20。。

優(yōu)選的，所述上清液Ⅰ與加入的枯草桿菌蛋白酶和SDS溶液的混合液體積比為1：15。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，所述裂解液與SDS溶液的體積比為20-50：30，所述SDS溶液的初始濃度為0.1-0.2mol/L。

優(yōu)選的，所述裂解液與SDS溶液的體積比為40：30，所述SDS溶液的初始濃度為0.15mol/L。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，所述沉淀物Ⅱ與所述裂解液的體積比為1：10-20。

優(yōu)選的，所述沉淀物Ⅱ與所述裂解液的體積比為1：15。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，所述初次離心的條件是：4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。

進一步，所述的一種簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，所述步驟(2)中，所述裂解液為Clelex-100。

本發(fā)明的目的還在于提供簡單快速提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法的應(yīng)用，體現(xiàn)在檢測微生物發(fā)酵有機肥中的應(yīng)用、制備檢測微生物發(fā)酵有機肥的試劑盒中的應(yīng)用等。

一種檢測微生物發(fā)酵有機肥的方法，以本發(fā)明提取總DNA的方法所得的上清液Ⅱ中總DNA為模板，采用特異性引物進行PCR擴增，所述特異性引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選的，PCR擴增的反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃，5min；變性，94℃45s；退火，56℃45s；延伸，72℃45s，循壞33次；最后72℃延伸10min。

一種檢測微生物發(fā)酵有機肥的試劑盒，至少包括PCR擴增引物，所述PCR擴增引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。

進一步，所述的一種檢測微生物發(fā)酵有機肥的試劑盒，還包括枯草桿菌蛋白酶、細胞裂解液和SDS溶液。用于提取微生物發(fā)酵有機肥中的總DNA。

進一步，所述的一種檢測微生物發(fā)酵有機肥的試劑盒，還包括PBS緩沖液。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明的提取微生物發(fā)酵有機肥中總DNA的方法，該方法操作簡單方便、快速、高效、高質(zhì)，且價格經(jīng)濟，能適用于實驗室大規(guī)模提取。

(2)本發(fā)明的方法所得的DNA片段較完整、大小約為1500bp，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴增的模板，以及發(fā)酵肥料微生態(tài)學(xué)等方面的研究。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：

圖1為DNA電泳檢測圖：圖中編號1為空白對照組，編號2-4為試劑盒法提取的生物發(fā)酵有機肥總DNA；編號5-7為常規(guī)酚氯仿法提取的生物發(fā)酵有機肥總DNA；編號8-10為本發(fā)明的方法重復(fù)3次平行提取的生物發(fā)酵有機肥總DNA；上樣量均為5μL。本發(fā)明的方法提取的DNA亮度明顯高于其余2組。其中M為Marker DL-2000，分子量標(biāo)準從下至上依次為100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1

(1)預(yù)處理

稱取備用的生物發(fā)酵有機肥樣于一無菌的離心管A中，用10倍體積的PBS浸泡15分鐘(在實踐操作中，浸泡時間不少于5分鐘，或用其它可實現(xiàn)除雜質(zhì)及離心分離功能的緩沖液替代PBS緩沖液)。浸泡完成后，于漩渦振蕩器上振蕩混勻，充分懸浮清洗菌體；混勻的懸液于4℃，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘后，去除粗顆粒(低速離心的目的在于去除生物發(fā)酵有機肥中的粗顆粒，除了離心之外，也可以采用如過濾等其它方式去除粗顆粒雜質(zhì))，將去除粗顆粒后的液體于另一只50mL滅菌離心管內(nèi)B中，4℃，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心6分鐘，收集沉淀物Ⅰ于Eppendorf管中。通過重復(fù)離心，將離心后得到的沉淀轉(zhuǎn)移200-300mg入2mL滅菌的離心管中。

然后在離心管中加入1mL PBS緩沖液(或用其它可實現(xiàn)除雜質(zhì)及離心分離功能的緩沖液替代PBS緩沖液)，振蕩15秒混勻，10000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘，傾去上清，得沉淀，重復(fù)此步驟至上清液無異色，傾去上清，得沉淀物Ⅰ。

(2)提取

在沉淀物Ⅰ中加入1mL雙蒸水，振蕩混勻，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，傾去上清，重復(fù)此步驟1次；取出離心管，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后，吸取上清液Ⅰ450μL至另一2mL離心管中，加入30μL初始濃度為0.15mol/L的SDS溶液，20μL枯草桿菌蛋白酶(初始濃度為20mg/mL)，振蕩混勻，55℃水浴消化，經(jīng)實驗證實，0.15-1小時均可實現(xiàn)水浴消化的效果。然后4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，得沉淀物Ⅱ，沉淀物Ⅱ可用于總DNA的提??；在沉淀物Ⅱ中加裂解液Clelex-100(20-50μL均可)，和30μL初始濃度為0.15mol/L的SDS溶液，浸沒沉淀物Ⅱ，置于冰上3分鐘，使DNA復(fù)性，然后離心2分鐘，取上清得上清液Ⅱ，上清液Ⅱ于-20℃保存，測DNA含量備用。

申請人用本發(fā)明的方法對同一生物發(fā)酵有機肥樣品進行了3次的重復(fù)提取實驗，如圖1所示，結(jié)果表明本發(fā)明方法的多次重復(fù)提取的實驗效果基本一致，這說明該發(fā)明方法非常地穩(wěn)定，適用于生物發(fā)酵有機肥總DNA的大規(guī)模提取。

實施例2

對實施例1提取的DNA進行16SrDNA的PCR擴增檢測。應(yīng)用實施例1提取的DNA作為模板，以設(shè)計的特異性引物：上游引物為：16sF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)，其下游引物為：16sR：ACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.2)，擴增生物發(fā)酵有機肥微生物16SrDNAV3區(qū)。PCR擴增體系如表1所示。

表1 50μL PCR反應(yīng)體系組成

PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性，94℃，5min；變性，94℃45s；退火，56℃45s；延伸，72℃45s，循壞33次；最后72℃延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)有溴化乙錠的1.0％瓊脂糖凝膠80V30min電泳檢測。

通過分析所得生物發(fā)酵有機肥總DNA的濃度、純度、得率及16SrDNA全長擴增結(jié)果表明，本發(fā)明所得的DNA片段較完整、大小約為1500bp，濃度、純度、得率高，所得DNA可直接作為PCR擴增的模板，以及發(fā)酵肥料微生態(tài)學(xué)等方面的研究。

實施例3與現(xiàn)有技術(shù)的對比試驗

本實施例將本發(fā)明的方法與常規(guī)方法、試劑盒法提取生物發(fā)酵有機肥總DNA進行了比較。為了比較本發(fā)明與現(xiàn)有的常規(guī)方法和商業(yè)試劑盒提取法的平行效果，申請人同時進行了利用本發(fā)明方法、常規(guī)方法和試劑盒法提取的比較實驗。利用常規(guī)法從生物發(fā)酵有機肥中提取總DNA：按照盧圣棟等編著(參見：現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)(第二版)61-62頁)記載的方法進行。利用試劑盒法從生物發(fā)酵有機肥中提取總DNA：所用試劑盒購自美國omega，試劑盒的商品名稱為Stool DNA Kit。上述兩種方法使用的生物發(fā)酵有機肥樣品同本發(fā)明相同，所提取的DNA溶于100ml的緩沖液中。本發(fā)明的方法按照實施例1進行提取。分別以利用常規(guī)方法、試劑盒法和本發(fā)明的方法制備的生物發(fā)酵有機肥總DNA 1μL作PCR反應(yīng)的模板，以設(shè)計的特異性引物：上游引物為：16sF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，其下游引物為：16sR：ACGGCTACCTTGTTACGACTT，分別擴增生物發(fā)酵有機肥微生物16SrDNA V3區(qū)。PCR擴增體系如表1所示，PCR的反應(yīng)條件參照實施例2。

結(jié)果如圖1所示。1為空白對照組；2-4為試劑盒法、5-7為常規(guī)方法、8-10為本發(fā)明方法，擴增結(jié)果表明，本發(fā)明方法PCR擴增的特異性條帶完整，明亮，且較常規(guī)方法、試劑盒法更為清晰。

表2.各種方法提取DNA產(chǎn)量

采用本發(fā)明方法，常規(guī)法和試劑盒法分別從生物發(fā)酵有機肥中提取的總DNA結(jié)果有較大差別，本發(fā)明方法所提得的總DNA產(chǎn)量高(表2)，是常規(guī)方法的2.3倍、是試劑盒方法的6.6倍。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

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<213> 人工序列

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