本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種逆轉錄方法、逆轉錄試劑盒及其應用。

背景技術：

逆轉錄又稱為反轉錄，是以RNA為模板，通過逆轉錄酶，合成cDNA的過程，是DNA生物合成的一種特殊方式，由逆轉錄酶進行催化。美國科學家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶，并因此獲得了1975年的諾貝爾生理學醫(yī)學獎。逆轉錄的發(fā)現(xiàn)對分子生物學、基因工程技術的發(fā)展起到了巨大的推動作用，是構建、表達真核或者原核生物目的基因，構建cDNA文庫，檢測基因序列等分子細胞生物學實驗中不可或缺的工具，與Taq酶等共同構成了現(xiàn)代生物技術的的基礎工具。

基于逆轉錄的基礎性作用，在逆轉錄的實驗操作中，國內外已經有許多公司和個人嘗試對其中的材料和步驟進行改良，并且申請專利。例如美國專利US6,436,677公開了一種改良的逆轉錄酶，這個酶參與的逆轉錄需要錳參與，反應溫度大于50℃，該溫度利于打開RNA的二級結構，從而利于逆轉錄的順利進行。美國專利US8,993,240采用的是另外一個思路，它采用特殊設計的引物來增加逆轉錄的特異性和針對性。又如株式會社百奧尼專利CN103348004B，它采用基因突變的方法改變逆轉錄酶M-MLV的熱穩(wěn)定性，從而也能提高cDNA的轉換效率。目前，雖然在逆轉錄酶和材料上已經進行了諸多改良，然而具體的操作方法改進很少，仍有很大的改進空間。

經典的方法進行逆轉錄，先通過Trizol試劑對細胞進行裂解，接著通過氯仿將DNA、RNA和蛋白質進行分層，進一步通過異丙醇、乙醇等對RNA進行分離和純化，檢測鑒定之后進行逆轉錄操作，整個操作過程流程較長，用時很多，而且由于RNA容易降解，長流程的操作極大的增加了RNA的降解風險。為了獲得較好的RNA，操作時需謹慎小心，并且需要較為專業(yè)的人員進行。綜合以上因素，經典的方法總體成本較高，具有一定的技術門檻，不便于在基層醫(yī)院和小公司中普及。

由此可見，有必要探索和發(fā)明一種方法，嘗試從樣本(如組織、細胞或血液等)獲得cDNA，在保證較好的效果的基礎上簡化操作步驟。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種全新的逆轉錄試劑盒、逆轉錄方法及應用。

本發(fā)明提供了一種逆轉錄方法，包括以下步驟：

(1)通過裂解試劑對樣本進行裂解，

(2)通過逆轉錄試劑對裂解后的樣本直接進行逆轉錄。

作為本發(fā)明的一個優(yōu)選例，所述的裂解試劑為NP-40(乙基苯基聚乙二醇)裂解液，所述的NP-40裂解液配方為：RNase-Free H₂O，NP-40，RNasin，其中NP-40的質量濃度為0.2％-5％，RNasin的濃度為1-10U。

在該優(yōu)選例中，RNasin為一種特異的RNA酶抑制劑，是一種酸性糖蛋白，可以從人的胎盤中提取獲得，也可以商業(yè)購買。

在該優(yōu)選例中，優(yōu)選的步驟1)的裂解操作具體為：裂解操作在冰上進行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解10-30min，最優(yōu)為20min。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述的裂解試劑為堿裂解試劑，所述的堿裂解試劑配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.00001-0.01M。

在該優(yōu)選例中，優(yōu)選的步驟1)的裂解操作具體為：裂解操作在冰上進行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解5-20min，優(yōu)選10min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U的RNasin，最優(yōu)濃度為2U/μl。

作為一種具體實施方式，所述的樣本可以為細胞、組織或血液等。

所述的樣本可來自微生物(如病毒、細菌、衣原體和真菌等)、人或動植物。

本發(fā)明還提供了一種逆轉錄試劑盒，其包含裂解試劑，所述的裂解試劑為NP-40裂解液或堿裂解試劑；所述的NP-40裂解液配方為：RNase-Free H₂O，NP-40，RNasin，其中NP-40的質量濃度為0.2％-5％，最優(yōu)濃度為2％，RNasin的濃度為1-10U，最優(yōu)濃度為2U/μl；所述的堿裂解試劑配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.00001-0.01M，最優(yōu)濃度為0.001M。

優(yōu)選地，所述的逆轉錄試劑盒還包含逆轉錄試劑。

更優(yōu)選地，所述的逆轉錄試劑包含逆轉錄酶，所述的逆轉錄酶是MMLV逆轉錄酶或AMV逆轉錄酶。

優(yōu)選地，當采用所述的兩種裂解液裂解細胞時，每1ml的裂解液可以裂解1×10⁴到1×10⁶個細胞。當細胞增多時，可以適當增加裂解液的含量。逆轉錄的試劑可以采用常規(guī)的逆轉錄方法和試劑，如商業(yè)在售的逆轉錄試劑。逆轉錄的試劑包含：逆轉錄緩沖液，逆轉錄酶，RNasin，逆轉錄引物以及dNTPs等。

優(yōu)選地，逆轉錄體系包括：

5×逆轉錄緩沖液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl₂；50mM DTT；

10mM dNTPs；

逆轉錄酶5U/μl；

20μM逆轉錄引物(如oligodT primer或者Random primer)；

RNasin；

總量20μl時，加入樣本裂解液0.5μl-4μl，最佳為2μl。

本發(fā)明還提供了所述的逆轉錄試劑盒在從樣本中獲得cDNA的過程中的應用。

本發(fā)明提供了一種全新的從樣本獲得cDNA的方法，并提供了相應的試劑盒，其具備以下優(yōu)點：

1、僅包括裂解和逆轉錄兩個步驟，裂解之后可以直接進行逆轉錄操作，省去了繁瑣的RNA抽提和分離的環(huán)節(jié)，因此大大降低了操作難度，普通的技術人員和醫(yī)生也能操作，有利于基因檢測等技術在基層的研究單位和醫(yī)院推廣；

2、大大縮短了實驗時間，之前抽提RNA、逆轉錄以及定量PCR等過程需要一天時間才能完成，本發(fā)明的方法可以在半天之內完成；

3、由于省去了繁瑣的RNA抽提過程，因此實驗的成功率和可重復性也大大提高，實驗證實其效果良好；

4、僅需要裂解試劑和逆轉錄試劑，大大節(jié)省了成本；

5、本發(fā)明方法中各參數(shù)設置合理恰當，取得了良好的實驗效果。

由此可見，本發(fā)明的方法在基礎研究與臨床檢測等領域中具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1：定量PCR溶解峰顯示兩種逆轉錄方法之間的比較。

圖2：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種逆轉錄方法之間的比較。

圖3：定量PCR溶解峰顯示兩種裂解試劑之間的比較。

圖4：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種裂解試劑之間的比較。

圖5：定量PCR溶解峰顯示兩種逆轉錄酶試劑之間的比較。

圖6：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種逆轉錄酶之間的比較。

圖7：定量PCR溶解峰顯示人和鼠基因之間的比較。

圖8：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示人和鼠基因之間的比較。

圖9：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示人血液細胞組織和口腔細胞之間的比較。

圖10：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種逆轉錄方法在擴增全長基因方面的比較。

圖11：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示腫瘤組織和正常組織之間的比較。

具體實施方式

下面對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

在以下各實施例中：

NP-40裂解液的具體配方為：RNase-Free H₂O，NP-40，RNasin，其中NP-40的質量濃度為為2％，RNasin的濃度為2U/μl。采用NP-40裂解液的具體裂解方法為：于1×10⁵個細胞中加入1ml的裂解液，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解20min，所有操作在冰上進行。

堿裂解試劑的具體配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.001M。采用堿裂解試劑的具體裂解方法為：于1×10⁵個細胞中加入1ml的裂解液，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解10min，之后加入等量的HCl中和，再加入2U/μl的RNasin，所有操作在冰上進行。

逆轉錄體系如下：

5×逆轉錄緩沖液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl₂；50mM DTT；

10mM dNTPs；

逆轉錄酶5U/μl；

20μM逆轉錄引物；

RNasin；

總量20μl時，樣本裂解液2μl。

逆轉錄操作步驟為：冰上操作，配制20μl總逆轉錄體系，RNase-free EP管中依次加入4μl 5×逆轉錄緩沖液，2μl樣本裂解液，1μl 10mM dNTPs，1μl20μM逆轉錄引物，1μl逆轉錄酶(5U/μl)，1μl 40U/μl RNasin。倘若逆轉錄酶為MMLV，則37℃恒溫15-60分鐘，85℃5秒，4℃保存。倘若逆轉錄酶為ALV，則42℃恒溫15-60分鐘，85℃5分鐘，4℃保存。

實施例1采用的是NP-40裂解液；實施例2采用的是NP-40裂解液和堿裂解試劑；實施例3采用的是堿裂解試劑；實施例4采用的是NP-40裂解液；實施例5采用的是堿裂解試劑；實施例6采用的是NP-40裂解液實施例7采用的是NP-40裂解液。

實施例1 傳統(tǒng)RNA抽提方法與本發(fā)明方法的比較

采用293T細胞，分別使用傳統(tǒng)的Trizol裂解抽提RNA的方法和本發(fā)明的方法提取RNA，再采用MMLV逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，之后通過定量PCR對內參基因Gapdh和Tp53基因定量檢測，且為了進一步驗證這一結果，采用普通PCR方法擴增上述兩個基因片段，然后進行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測是否成功擴增上述基因片段。引物序列見表1。

表1引物序列

定量PCR檢測結果見圖1，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2。結果表明，采用本發(fā)明的裂解細胞后直接逆轉錄的方法和傳統(tǒng)的抽提RNA之后再逆轉錄的方法其效果是相當?shù)摹?/p>

實施例2 兩種細胞裂解試劑之間的比較

為了檢測不同的裂解液是否能獲得相同的效果，普通的RNA抽提采用的Trizol裂解液雖然能最大限度地裂解細胞，然而也會破壞蛋白的結構，影響后續(xù)的實驗，因此我們不斷研究嘗試新的裂解方法和裂解試劑。經過摸索，找出了兩種細胞裂解試劑：NP-40裂解試劑和堿裂解試劑。采用293T細胞，將堿裂解液KOH，NP-40裂解液和Trizol抽提的RNA進行對比，用MMLV逆轉錄酶進行逆轉錄，采用定量PCR方法對Tp53的基因定量檢測，且為了進一步驗證這一結果，再采用普通PCR和DNA瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

定量PCR檢測結果見圖3，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖4。結果表明，采用本發(fā)明的NP-40裂解試劑和堿裂解試劑進行逆轉錄的方法其效果是相當?shù)?，且研究過程中表明其效果均顯著優(yōu)于其他裂解試劑。

實施例3 MMLV逆轉錄酶以及AMV逆轉錄酶的比較

采用293T細胞，使用MMLV逆轉錄酶以及AMV逆轉錄酶，檢測內參基因Gapdh，分別進行試驗，產物進行定量PCR檢測，同時經普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。

定量PCR檢測結果見圖5，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖6。結果表明，使用MMLV逆轉錄酶或AMV逆轉錄酶其效果相當。

實施例4 人和小鼠細胞的比較

采用人乳腺癌MDA-MB-231細胞和小鼠乳腺癌4T1細胞分別進行試驗，檢測內參基因Gapdh，產物進行定量PCR檢測，同時經普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。

定量PCR檢測結果見圖7，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖8。結果表明，樣本為人或小鼠細胞其效果是相當?shù)摹?/p>

實施例5 人血液組織和人口腔上皮細胞的比較

采用人血液組織和口腔上皮細胞分別進行試驗，產物經普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖9。結果表明，樣本為人血液組織和人口腔上皮細胞其效果是相當?shù)摹?/p>

實施例6 擴增全長基因比較

擴增Kras基因(擴增后595bp)以及Tp53基因(擴增后1410bp)。通過在293T細胞以及人口腔上皮細胞進行裂解之后采用Trizol方法和本發(fā)明方法進行檢測。引物序列見表2。

表2引物序列

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖10。結果表明，采用本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)的抽提RNA之后再逆轉錄的方法相比，在擴增全長基因方面其效果是相當?shù)摹?/p>

實施例7 腫瘤組織和正常組織(距離腫瘤組織6cm)的比較

取肝癌患者的腫瘤組織和癌旁組織分別進行試驗，產物進行Gapdh和Tp53基因的檢測，即經普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖11。結果表明，樣本為腫瘤組織和正常組織其效果是相當?shù)摹?/p>

實施例8 本發(fā)明的逆轉錄試劑盒(一)

所述的逆轉錄試劑盒包含裂解試劑，所述的裂解試劑為NP-40裂解試劑，配方為：RNase-Free H₂O，NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，RNasin，其中NP-40的質量濃度為0.2％-5％，最適濃度為2％；RNasin的濃度為1-10U/μl，最適濃度為2U/μl。

所述的逆轉錄試劑盒還包含說明書，且說明書記載以下內容：裂解操作在冰上進行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解10-30min，最優(yōu)20min，裂解后的樣本即可直接逆轉錄，逆轉錄的試劑可以采用常規(guī)的逆轉錄方法和試劑，如商業(yè)在售的逆轉錄試劑。

實施例9 本發(fā)明的逆轉錄試劑盒(二)

所述的逆轉錄試劑盒包含裂解試劑，所述的裂解試劑為堿裂解試劑，配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.00001-0.01M，最適濃度為0.001M。

所述的逆轉錄試劑盒還包含說明書，且說明書記載以下內容：裂解操作在冰上進行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解5-20min，最優(yōu)10min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U/μl的RNasin，最佳濃度為2U/μl，裂解后的樣本即可直接逆轉錄。

針對上述兩種試劑盒，當采用上述兩種裂解液裂解細胞時，每1ml的裂解液可以裂解1×10⁴到1×10⁶個細胞。當細胞增多時，可以適當增加裂解液的含量。逆轉錄的試劑可以采用常規(guī)的逆轉錄方法和試劑，如商業(yè)在售的逆轉錄試劑。

逆轉錄的試劑包含：逆轉錄緩沖液，逆轉錄酶，RNasin，逆轉錄引物以及dNTPs等。

逆轉錄體系包括：

5×逆轉錄緩沖液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl₂；50mM DTT；

10mM dNTPs；

逆轉錄酶(5U/μl)；

20μM逆轉錄引物(如oligodT primer或者Random primer)；

RNasin；

本發(fā)明方法中，20μl總逆轉錄體系中，樣本裂解液的適宜范圍是0.5μl-4μl，最佳的含量為2μl。

逆轉錄操作步驟示例如下：

冰上操作，配制20μl總逆轉錄體系，RNase-free EP管中依次加入4μl 5×逆轉錄緩沖液，2μl樣本裂解液，1μl 10mM dNTPs，1μl 20μM逆轉錄引物，1μl逆轉錄酶(5U/μl)，1μl 40U/μl RNasin，13μl RNase-fre H₂O。倘若逆轉錄酶為MMLV，則37℃恒溫15-60分鐘(具體時間由逆轉錄cDNA長度決定)，85℃5秒，4℃保存。倘若逆轉錄酶為ALV，則42℃恒溫15-60分鐘(具體時間由逆轉錄cDNA長度決定)，85℃5分鐘，4℃保存。獲得的cDNA可以用于PCR等下一步實驗或者檢測。

本技術技術人員應當認識到，以上實施例僅是用來說明本發(fā)明，而并非用作為對本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實質精神范圍內，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權利要求書的范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 唐旌生物科技（上海）有限公司

<120> 一種逆轉錄方法、逆轉錄試劑盒及其應用

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