本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及c6orf58基因在舌鱗癌的診斷、治療中的用途。

背景技術(shù)：

口腔鱗癌是頭頸部腫瘤最常見的惡性腫瘤，約占全身腫瘤的3％，占口腔腫瘤的90％，而舌癌占口腔鱗癌發(fā)病率的首位。雖然近幾年在發(fā)達(dá)國家口腔癌的發(fā)病率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，但總的發(fā)病率卻在增加。患者多數(shù)為40歲以上男性，好發(fā)部位多在舌、頰、牙齦等。舌鱗癌的發(fā)生是個多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程，病因?qū)W也復(fù)雜多樣，涉及理化因素、微生物感染、遺傳、種族等方面。雖然有關(guān)舌鱗癌病因?qū)W及相關(guān)機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，也取得一定成果，但舌鱗癌仍然具有較高的死亡率及預(yù)后差。而預(yù)后較差的原因往往是診斷和治療的不及時，由于舌鱗癌早期一般無任何癥狀，患者往往因疼痛、難以愈合潰瘍、不明原因的出血、口腔或者頸部腫塊等臨床癥狀就診，這時病情較晚，生存率較低。有報道認(rèn)為早期病例及時治療，5年生存率可達(dá)到85％，而一旦出現(xiàn)癥狀，五年生存率在50％左右。另外病灶面積大，手術(shù)切除范圍廣，也將嚴(yán)重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量。研究舌鱗癌生物學(xué)行為、發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，有助于疾病早診斷、預(yù)防和治療；尋找有效的分子靶基因，降低舌癌的死亡率，是迫切需要解決的問題；同時具有廣闊的臨床醫(yī)用前景及重大的科學(xué)價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于舌鱗癌早期診斷的分子標(biāo)志物。相比現(xiàn)有的舌鱗癌的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷舌鱗癌的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險，針對風(fēng)險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測c6orf58基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷舌鱗癌的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述檢測c6orf58基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測c6orf58基因mrna水平的產(chǎn)品、和/或檢測c6orf58蛋白水平的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述檢測c6orf58基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過rt-pcr、實(shí)時定量pcr、免疫檢測、原位雜交或芯片檢測c6orf58基因表達(dá)以診斷舌鱗癌的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用rt-pcr診斷舌鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增c6orf58基因的引物；所述用實(shí)時定量pcr診斷舌鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增c6orf58基因的引物；所述用免疫檢測診斷舌鱗癌的產(chǎn)品包括：與c6orf58蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷舌鱗癌的產(chǎn)品包括：與c6orf58基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷舌鱗癌的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與c6orf58蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與c6orf58基因的核酸序列雜交的探針。

所述用實(shí)時定量pcr診斷舌鱗癌的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴(kuò)增c6orf58基因的引物如seqidno.3和seqidno.4所示。

所述檢測c6orf58基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測c6orf58基因表達(dá)的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

所述診斷舌鱗癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷舌鱗癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知c6orf58基因的異常與舌鱗癌相關(guān)也屬于c6orf58基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種診斷舌鱗癌的工具，所述工具包括檢測c6orf58基因表達(dá)的試劑；所述試劑包括檢測c6orf58基因mrna的引物和/或探針、檢測c6orf58蛋白的抗體。

所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測c6orf58基因轉(zhuǎn)錄水平的針對c6orf58基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的c6orf58蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括c6orf58基因在內(nèi)的多個基因(例如，與舌鱗癌相關(guān)的多個基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括c6orf58蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與舌鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過將多個與舌鱗癌的標(biāo)志物同時檢測，可大大提高舌鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測c6orf58基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括c6orf58蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用rt-pcr、實(shí)時定量pcr、免疫檢測、原位雜交或芯片方法檢測c6orf58基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對c6orf58基因的引物和/或探針。根據(jù)c6orf58基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計出可以用于檢測c6orf58基因表達(dá)水平的引物和探針。

所述試紙包括檢測c6orf58基因表達(dá)的試劑。

所述高通量測序平臺包括檢測c6orf58基因表達(dá)的試劑。

與c6orf58基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。

進(jìn)一步，所述c6orf58蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述c6orf58蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與c6orf58蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測c6orf58基因mrna的引物包括seqidno.3和seqidno.4所示的引物對。

本發(fā)明還提供了c6orf58基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療舌鱗癌的藥物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制c6orf58基因表達(dá)的試劑、和/或抑制c6orf58基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。

進(jìn)一步，所述抑制c6orf58基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻譯的試劑；所述抑制c6orf58基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制c6orf58基因mrna的試劑、抑制c6orf58蛋白的試劑。所述抑制c6orf58基因mrna的試劑包括抑制mrna穩(wěn)定性的試劑、抑制mrna翻譯活性的試劑。所述抑制c6orf58蛋白的試劑包括抑制c6orf58蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制c6orf58蛋白活性的試劑、抑制c6orf58蛋白功能的試劑。

進(jìn)一步，抑制c6orf58基因mrna的試劑包括針對c6orf58基因mrna的雙鏈核糖核酸；抑制c6orf58蛋白功能的試劑包括c6orf58抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制c6orf58蛋白功能的抗體。所述抗體可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對c6orf58基因mrna的雙鏈核糖核酸是sirna。為了確保c6orf58基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)c6orf58基因的mrna序列設(shè)計了sirna特異性片段。sirna的設(shè)計根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計原則(elbashiret.al2001，schwarzet.al2003，khvorovaet.al2003，reynoldset.al2004，hsiehet.al2004，ui-teiet.al2004)，通過在線工具完成設(shè)計，該在線工具為：sirnaselectionprogramofwhiteheadinstitute(bingbingyuanet.al2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/sirnaext/)和block-ittmrnaidesignerofinvitrogen(winnerofthe2004frost&sullivanexcellenceinresearchaward，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。為了進(jìn)一步提高sirna片斷的有效性，綜合兩個在線設(shè)計工具的優(yōu)點(diǎn)來設(shè)計用于篩選的sirna片斷。最后，通過同源性比對(ncbiblast)來過濾sirna序列，以提高sirna片斷的特異性并減少rnai干擾的脫靶效應(yīng)。

優(yōu)選地，所述sirna的序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

本發(fā)明還提供了一種用于治療舌鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所述的c6orf58基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上的混合。

本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療舌鱗癌的藥劑。

本發(fā)明的藥物組合物首選應(yīng)用于哺乳動物，其中該哺乳動物優(yōu)選為人類病患。

本發(fā)明的藥物組合物可例如以口服、注射等方式給予至該人類病患體內(nèi)。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療舌鱗癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提到治療的成功率。

在本發(fā)明的上下文中，“c6orf58基因”包括c6orf58基因以及c6orf58基因的任何功能等同物的多核苷酸。c6orf58基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫genebank中c6orf58基因(nc_000006.12)dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；

優(yōu)選地，c6orf58基因的編碼序列包括以下任一一種dna分子：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；

(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有70％、優(yōu)選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述c6orf58基因的編碼序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本發(fā)明的上下文中，c6orf58基因表達(dá)產(chǎn)物包括c6orf58蛋白以及c6orf58蛋白的部分肽。所述c6orf58蛋白的部分肽含有與舌鱗癌相關(guān)的功能域。

“c6orf58蛋白”包括c6orf58蛋白以及c6orf58蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括c6orf58蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與c6orf58的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，c6orf58蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。

(3)與seqidno.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又稱為序列同一性)，更優(yōu)選地，與seqidno.2所示的氨基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述c6orf58蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是c6orf58蛋白的融合蛋白。對于與c6orf58蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留c6orf58蛋白的生物學(xué)活性即可。

本發(fā)明的c6orf58蛋白也包括對seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留c6orf58蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷舌鱗癌”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有舌鱗癌、也包括判斷受試者是否存在患有舌鱗癌的風(fēng)險。

在本發(fā)明的上下文中，“治療舌鱗癌”從疾病的狀態(tài)變化來分，可以包括疾病的緩解、疾病的完全治愈，還包括用于評價疾病的治療效果。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了c6orf58基因表達(dá)與舌鱗癌相關(guān)，通過檢測受試者組織中c6orf58的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有舌鱗癌、或者判斷受試者是否存在患有舌鱗癌的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。

在基因水平上進(jìn)行口腔癌的早期診斷已經(jīng)成為了口腔癌領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，申請?zhí)枮椋?01611136247.1、201511009921.5、201511009794.9、201610245087.8、201610277716.5、201511009921.5、201610798012.2專利文獻(xiàn)均披露了可以用于口腔癌或者舌鱗癌診斷的基因標(biāo)志物，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-c6orf58基因，能夠?qū)崿F(xiàn)舌鱗癌的早期診斷，從而降低舌鱗癌的死亡率。

附圖說明

圖1顯示利用基因芯片檢測c6orf58基因在舌鱗癌組織與正常粘膜組織中的表達(dá)情況；

圖2顯示利用westernblot檢測c6orf58蛋白在舌鱗癌組織與正常粘膜組織中的表達(dá)情況；

圖3顯示利用qpcr檢測sirna對c6orf58基因mrna表達(dá)的影響；

圖4顯示利用westernblot檢測sirna對c6orf58蛋白表達(dá)的影響；

圖5顯示抑制c6orf58蛋白功能對舌鱗癌細(xì)胞增殖的影響。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1c6orf58基因的差異表達(dá)

1、實(shí)驗(yàn)材料：

舌鱗癌組織標(biāo)本取自舌鱗癌根治術(shù)患者，共50例，正常粘膜組織取自于口腔外傷患者，共50例，所有組織取材經(jīng)過病理組織學(xué)確診，并簽署自愿捐獻(xiàn)供本次試驗(yàn)使用同意書。取材時癌組織為腫瘤的中心區(qū)正常粘膜為不含粘膜下的上皮組織。所有標(biāo)本分別置入1.5mlep管放入液氮罐保存。收集所有標(biāo)本患者術(shù)前未經(jīng)過任何形式的抗腫瘤治療及無其他部位腫瘤病史。

2、舌鱗癌組織和正常粘膜組織的rna的獲取

使用trizol一步法提取舌鱗癌組織和正常粘膜組織的總rna，通過nanodropnd-1000讀取260nm和280nm處的吸光度值(a)測定rna溶液的純度。經(jīng)1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢測rna的完整性。

3、基因芯片雜交及掃描

總rna經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-utp標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的crnas采用rneasyminikit純化，用amhion的rnafragmentationreagents對標(biāo)記好的crnas進(jìn)行片段化處理。采用美國agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x44k基因)，在芯片雜交爐中65℃雜交17h，然后洗脫、染色，最后用agilentdnamicroarrayscanner掃描儀掃描。

4、芯片數(shù)據(jù)處理與分析

雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對于兩組比值的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。

5、統(tǒng)計學(xué)處理

采用spss13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，p<0.05差異有顯著性意義。

6、結(jié)果

結(jié)果顯示(如圖1所示)，與正常粘膜組織相比，舌鱗癌組織中c6orf58基因的mrna水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例2c6orf58蛋白的差異表達(dá)

1、研究對象同實(shí)施例1。

2、提取組織總蛋白

按照epiquik組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。

3、westernblot檢測

將提取的蛋白定量進(jìn)行sds-page電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色。

4、統(tǒng)計學(xué)處理

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將c6orf58蛋白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常粘膜組織相比，舌鱗癌組織中c6orf58蛋白的表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例3抑制c6orf58基因表達(dá)

1、sirna設(shè)計合成

針對c6orf58的sirna序列：

sirna-c6orf58：

正義鏈為5’-aguacuucaacagaucaucaa-3’(seqidno.7)；

反義鏈為5’-gaugaucuguugaaguacuua-3’(seqidno.8)，

以上sirna序列與陰性對照sirna序列(sirna-nc)(陰性對照組sirna與c6orf58基因的序列無同源性)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供：

2、舌鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

舌鱗癌細(xì)胞系tca8113接種于含小牛血清10％，青霉素100μ/ml，鏈霉素100mg/ml的rpmi-1640培培養(yǎng)液中，將其放置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)85％融合時，用0.25％胰蛋白酶消化傳代。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將舌鱗癌細(xì)胞按1×10⁴/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000進(jìn)行sirna的轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組(20nm)，sirna濃度為20nm/孔。

2、利用qpcr實(shí)驗(yàn)檢測sirna的干擾效率。

2.1提取細(xì)胞總rna利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。

2.2逆轉(zhuǎn)錄

利用takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行rna的逆轉(zhuǎn)錄。

2.3qpcr

(1)引物設(shè)計

根據(jù)c6orf58基因和gapdh基因的編碼序列設(shè)計qpcr引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：

c6orf58基因：

正向引物為5’-ggttgattctggtgtaat-3’(seqidno.3)；

反向引物為5’-aacttcctctcattcttg-3’(seqidno.4)，

gapdh基因：

正向引物為5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.5)；

反向引物為5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.6)。

(2)配制pcr反應(yīng)體系：正向引物1μl；反向引物1μl；sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl；模板2μl；去離子水補(bǔ)足25μl；其中，sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購自invitrogen公司。

(3)pcr反應(yīng)：95℃10min，(95℃10s，60℃40s)*45個循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對定量。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，干擾c6orf58基因表達(dá)組與對照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，sirna-c6orf58能夠更有效的抑制c6orf58基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

3、westernblot實(shí)驗(yàn)檢測sirna-c6orf58的干擾效率

步驟同實(shí)施例2。

結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染sirna-nc組相比，轉(zhuǎn)染sirna-c6orf58的細(xì)胞中c6orf58蛋白的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例4c6orf58基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞增殖能力的測定

使用cellcountingkit-8(cck-8)試劑盒用于檢測舌鱗癌細(xì)胞增殖

1、步驟

按照前面實(shí)施例的方法進(jìn)行舌鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為二個實(shí)驗(yàn)組：

組1：轉(zhuǎn)染sirna-nc細(xì)胞組；

組2：轉(zhuǎn)染sirna-c6orf58細(xì)胞組。

待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化，離心(1000rpm,7分鐘)后調(diào)整細(xì)胞密度，以100μl/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)量為2*l0³個/孔，每組設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h；

(2)將上述細(xì)胞取出，向每孔加入10μl的cck-8溶液，以加入相應(yīng)不含細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液和cck-8溶液為空白組；

(3)繼續(xù)將96孔培養(yǎng)板放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，用酶標(biāo)儀檢測吸光度。

2、統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3、結(jié)果

轉(zhuǎn)染sirna-nc組測定的od值(光密度)值為1.857±0.112，轉(zhuǎn)染sirna-c6orf58組測定的od值(光密度)值為0.982±0.087。上述結(jié)果可知，與轉(zhuǎn)染sirna-nc組相比，轉(zhuǎn)染sirna-c6orf58細(xì)胞組細(xì)胞增殖緩慢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，c6orf58基因表達(dá)促進(jìn)了舌鱗癌細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例5舌鱗癌細(xì)胞抗體中和實(shí)驗(yàn)

1、步驟：

將舌鱗癌細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2*10³個細(xì)胞/孔/200μl，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行如下處理：

實(shí)驗(yàn)組1(對照組)：舌鱗癌細(xì)胞中加入無關(guān)單抗(1:50)；

實(shí)驗(yàn)組2：舌鱗癌細(xì)胞中加入抗人c6orf58單抗(1:50)。

將細(xì)胞在37℃、5％co2培養(yǎng)箱孵育24h后，加入³h-tdr(1μci/孔)，再培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，加液體閃爍液，β計數(shù)儀檢測cpm值。

2、統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，相比于對照組，加入抗人c6orf58單抗的細(xì)胞組細(xì)胞增殖減緩。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制c6orf58蛋白的功能可以抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)第二醫(yī)院；濟(jì)南市中心醫(yī)院；北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>c6orf58基因在制備舌鱗癌診治產(chǎn)品中的應(yīng)用

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