本發(fā)明涉及藥物化學技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種拉科酰胺的制備方法。

背景技術(shù)：

拉科酰胺的化學名為(R)-2-乙酰胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺，結(jié)構(gòu)式如下式Ⅰ所示，臨床上用于治療癲癇和神經(jīng)性疼痛。

目前拉科酰胺的制備方法一般以D-絲氨酸為起始原料。

例如，美國專利US5773475第一次描述了三種拉科酰胺的制備方法，制備路線如路線1所示，方法一：用D-絲氨酸先做成甲酯，再和芐胺反應生成(2R)-2-氨基-N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物2)，然后乙酰化得到(2R)-2-乙酰氨基-N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物3)，最后和碘甲烷，在氧化銀催化，乙腈做溶劑條件下甲基化得到拉科酰胺(化合物1)；方法二：D-絲氨酸用氯甲酸芐酯保護得到化合物4，然后和碘甲烷，在氧化銀催化，乙腈做溶劑條件下甲基化得到(2R)-2-芐氧羰基氨基-3-羥基丙酸甲酯(化合物5)，式V經(jīng)柱層析純化后水解得到化合物6，再在-78℃條件下，氯甲酸異丁酯反應做成混合酸酐，再與芐胺發(fā)生反應得到化合物7，化合物7氫化脫去保護得到化合物8，再乙?；?jīng)柱層析純化得到拉科酰胺；方法三：D-絲氨酸先乙?；玫絅-乙?；?D-絲氨酸，然后冷卻到-78℃，和氯甲酸異丁酯做成混合酸酐，再與芐胺發(fā)生反應得到(2R)-2-乙酰氨基--N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物3)，柱層析純化后，與碘甲烷，氧化銀在乙腈中反應得到拉科酰胺。

美國專利US2009143472報道了一種制備拉科酰胺的方法，其制備路線如路線2所示，D-絲氨酸用三甲基氯硅烷保護末端羥基，然后用三苯基氯甲烷保護氨基，再脫去三甲基硅保護基得到N-三苯甲基-D-絲氨酸(化合物9)，化合物9用氫化鈉做堿，和碘甲烷在-15℃到-5℃溫度范圍內(nèi)發(fā)生羥甲基化反應得到O-甲基-N-三苯甲基-D-絲氨酸(化合物10)，再與氯甲酸異丁酯和芐胺在-78℃條件下，反應得到(2R)-2-三苯甲氨基--N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物11)，化合物11脫保護，得到化合物8，最后和醋酐發(fā)生乙?；磻玫嚼契０?化合物1)。

美國專利US2008027137報道了一種制備拉科酰胺的方法，其制備路線如圖3所示，D-絲氨酸先用Boc保護，然后和硫酸二甲酯，在相轉(zhuǎn)移催化劑和NaOH溶液中，或者丁基鋰做堿反應得到N-Boc-O-甲基-D-絲氨酸(化合物12)，然后與氯甲酸異丁酯和芐胺在-78℃條件下，反應得到(2R)-2-叔丁氧羰基氨基--N-芐基-3-羥基丙酰胺(化合物13)，再在酸性條件下脫掉保護基，得到化合物8，最后乙?；玫嚼契０?化合物1)。

上述拉科酰胺制備方法具有很多局限性：

1、D-絲氨酸作為起始原料較貴；

2、甲基化用到碘甲烷和氧化銀，比較昂貴；

3、用到劇毒的硫酸二甲酯作為甲基化試劑，而且有少量消旋現(xiàn)象；

4、和芐胺反應做酰胺反應用到超低溫反應；

5、中間體用到柱層析手段，無法工業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例的目的在于提供一種拉科酰胺的制備方法，用于解決以D-絲氨酸作為起始原料較貴問題。具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種式Ⅰ所示的拉科酰胺的制備方法，包括以下步驟：

(a1)使式II所示的5-甲氧甲基海因與D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲?；饷附佑|，制得式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；

或

(a2)使式II所示的5-甲氧甲基海因與D-海因酶、海因消旋酶接觸，制得式Ⅲ所示的(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸，再將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸脫去氨甲酰基，得到式Ⅳ所示的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸；

(b)由步驟(a1)或(a2)制得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制備拉科酰胺。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，5-甲氧甲基海因的成本明顯低于D-絲氨酸，顯而易見，本發(fā)明的技術(shù)方案，以5-甲氧甲基海因代替D-絲氨酸作為起始原料，能夠降低拉科酰胺的制備成本。另外，以，5-甲氧甲基海因作為起始原料，無需進行甲基化，因此，本發(fā)明的技術(shù)方案可以避免使用昂貴或劇毒的甲基化試劑。進一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案，部分步驟采用酶促反應，更加綠色環(huán)保。

本文中，所說的術(shù)語“D-海因酶”(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)是一類催化海因、5'取代海因及其衍生物開環(huán)生成N-氨甲?；?D-氨基酸的酰胺水解酶。其可以選自來自放射形土壤桿菌的D-海因酶、來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的D-海因酶、來自根癌土壤桿菌的D-海因酶、來自糞腸球菌的D-海因酶、來自皮氏伯克霍爾德氏菌的D-海因酶、來自惡臭假單胞菌的D-海因酶，來自黃桿菌的D-海因酶等。其中優(yōu)選來自放射形土壤桿菌D-海因酶。

本文中，所說的術(shù)語“海因消旋酶”(hydantoin racemase,EC 5.1.99.5)是一類催化海因發(fā)生消旋，生產(chǎn)L-海因和D-海因的酶。其可以選自來自放射形土壤桿菌的海因消旋酶、來自根癌土壤桿菌的海因消旋酶和來自黃桿菌的海因消旋酶等。其中優(yōu)選放射形土壤桿菌的海因消旋酶。

本文中，所說的術(shù)語“D-氨甲?；饷浮?D-carbamoylase,EC 3.5.1.77)是能高度專一性的脫氨甲酰化，形成游離氨基酸的水解酶。其可以選自放射形土壤桿菌的D-氨甲?；饷浮碜愿┩寥罈U菌的D-氨甲?；饷?、來自糞腸球菌的D-氨甲?；饷?、來自皮氏伯克霍爾德氏菌的D-氨甲酰基水解酶、來自惡臭假單胞菌的D-氨甲?；饷福瑏碜渣S桿菌的D-氨甲?；饷傅取Ｆ渲袃?yōu)選來自放射形土壤桿菌的D-氨甲?；饷浮?/p>

需要說明的是，本發(fā)明的技術(shù)方案中所用到的5-甲氧甲基海因可以通過市售途徑獲得，也可以采用現(xiàn)有的合成方法自行合成。其來源本發(fā)明在此不進行限定。

另外，本發(fā)明中所涉及到的D-海因酶、海因消旋酶及D-氨甲酰基水解酶等，既可以通過市售途徑獲得相關(guān)產(chǎn)品，也可以采用基因工程技術(shù)來制備。

可選的，步驟(a1)包括：

獲得表達D-海因酶的濕菌體、表達海因消旋酶的濕菌體和表達D-氨甲?；饷傅臐窬w；

將各濕菌體進行細胞破碎后，制取粗酶液；

使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。

需要說明的是，獲得表達各酶的濕菌體，以及對濕菌體進行細胞破碎，從而制得粗酶液，均可以采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的技術(shù)手段來實現(xiàn)，本發(fā)明在此不進行限定。

在上述可選的技術(shù)方案中，粗酶液的使用量以制備粗酶液所用的各濕菌體計為：0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達D-海因酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達海因消旋酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因；0.02-2g，優(yōu)選為0.2-2g表達D-氨甲?；饷傅臐窬w/1g 5-甲氧甲基海因。硫酸錳的加入量與表達D-海因酶的濕菌體的質(zhì)量比可以為1：(1-100)，優(yōu)選為1：(20-60)。采用此限定組成的粗酶液，既可以實現(xiàn)低成本、高效率地制得(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。

在具體實施過程中，使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的步驟可以在pH值在7-10的緩沖溶液中進行，優(yōu)選在pH值在7-8的緩沖溶液中進行，更優(yōu)選在0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中進行。

更為具體地，可以將5-甲氧甲基海因加入到pH值在6-10的緩沖溶液，優(yōu)選pH值在7-9的緩沖溶液，更優(yōu)選0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中；再將所制備的粗酶液與之混合，在合適的溫度下，例如30-40℃下反應，在反應過程中，用無機酸，例如鹽酸調(diào)節(jié)反應的pH值，使其維持在6-10，優(yōu)選在7-9左右。利用薄層層析法檢測底物5-甲氧甲基海因完全消耗后，反應結(jié)束，一般地，反應20-40小時，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液。在后續(xù)的反應步驟(b)中，既可以直接利用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液進行反應，制備拉科酰胺，也可以將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液，濃縮結(jié)晶，提純(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，再利用高純度的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制備拉科酰胺。顯然，考慮到成本，優(yōu)選采用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液進行后續(xù)反應。對所得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸進行旋光度測試，出人意料的發(fā)現(xiàn)，(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的ee(Enantiomeric excess，對映體過量)值不小于99％，優(yōu)選地，不小于99.7％，更優(yōu)選地，不小于99.9％。手性純度極高。使得采用本發(fā)明的技術(shù)方案，中間體(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸不需要采用柱層析等手段進行異構(gòu)體的拆分，更有利于拉科酰按制備的工業(yè)化。

可選地，在步驟(a2)中：制取(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸的步驟包括：

獲得表達D-海因酶的濕菌體及表達海因消旋酶的濕菌體；

將各濕菌體進行細胞破碎后，制取粗酶液；

使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸。

如前所述，獲得表達各酶的濕菌體，以及對濕菌體進行細胞破碎，從而制得粗酶液，均可以采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的技術(shù)手段來實現(xiàn)，本發(fā)明在此不進行限定。

在該可選的方案中，粗酶液的使用量以制備粗酶液所用的各濕菌體計為：0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達D-海因酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因；0.01-1g，優(yōu)選為0.1-1g表達海因消旋酶的濕菌體/1g 5-甲氧甲基海因。硫酸錳的加入量與表達D-海因酶的濕菌體的質(zhì)量比可以為1：(1-100)，優(yōu)選為1：(20-60)。采用此限定組成的粗酶液，既可以實現(xiàn)低成本、高效率地制得(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸。

在具體實施過程中，使用粗酶液，優(yōu)選在硫酸錳的存在下，將5-甲氧甲基海因轉(zhuǎn)化為(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸的步驟可以在pH值在7-10的緩沖溶液中進行，優(yōu)選在pH值在7-8的緩沖溶液中進行，更優(yōu)選在0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中進行。

更為具體地，可以將5-甲氧甲基海因加入到pH值在6-10的緩沖溶液，優(yōu)選pH值在7-9的緩沖溶液，更優(yōu)選0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中；再將所制備的粗酶液與之混合，在合適的溫度下，例如30-45℃下反應，在反應過程中，用堿，例如氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應的pH值，使其維持在7-10，優(yōu)選在7-8左右。利用薄層層析法檢測底物5-甲氧甲基海因完全消耗后，反應結(jié)束，一般地反應20-40小時，得到(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液。在后續(xù)的生成(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的步驟中，既可以直接利用(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液進行反應制備(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，也可以將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液，濃縮結(jié)晶，提純(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸，利用高純度的(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸制備(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。

在通過上述的酶促反應制得(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸后，可以繼續(xù)采用D-氨甲?；饷高M行酶促反應，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。也可以在步驟(a2)中：將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸與亞硝酸鹽，優(yōu)選為亞硝酸鈉反應，脫去氨甲?；玫?R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。對所得的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸進行旋光度測試，(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸的ee值不小于99％，優(yōu)選地，不小于99.7％，更優(yōu)選地，不小于99.9％。使得采用本發(fā)明的技術(shù)方案，中間體(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸不需要采用柱層析等手段進行異構(gòu)體的拆分，更有利于拉科酰按制備的工業(yè)化。

在具體實施過程中，可以將(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸分散于水中，加入濃鹽酸后，再加入亞硝酸鹽水溶液，優(yōu)選加入亞硝酸鈉水溶液，更優(yōu)選滴加亞硝酸鈉水溶液進行反應，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸。在后續(xù)的反應步驟(b)中，既可以直接利用上述用亞硝酸鹽制得的含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應液進行反應，制備拉科酰胺，也可以將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應液濃縮結(jié)晶，提純(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，再利用高純度的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸制備拉科酰胺。顯然，考慮到成本，優(yōu)選采用(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應液進行后續(xù)反應。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，可選地，步驟(a1)和/或(a2)所用到的D-海因酶、海因消旋酶和/或D-氨甲?；饷笧榻?jīng)過純化處理的酶。也就是說，再得到表達本發(fā)明的技術(shù)方案所用的酶的菌體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)對其進行破碎及提純處理，從而獲得高純度，例如純度為95％以上的D-海因酶、海因消旋酶和D-氨甲酰基水解酶；進而再與5-甲氧甲基海因進行酶促反應。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，可選地，步驟(b)包括：

(b1)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸與乙酰化試劑反應，生成式Ⅴ所示的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸；優(yōu)選地，所述乙?；噭┻x自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴；

具體實施過程中，可以將含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的溶液，例如(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液或提純后的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸重新配制成的溶液，用堿調(diào)節(jié)pH值到8～9，加入乙酰化試劑，室溫反應8-24小時，反應結(jié)束后，將反應體系調(diào)至酸性，并用有機溶劑萃取，將有機萃取相濃縮后，用石油醚打漿，過濾得到(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸。

(b2)使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸與芐胺反應生成拉科酰胺。

優(yōu)選地，步驟(b2)包括：

使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在堿和芐胺存在條件下與鹵甲酸烷基酯反應生成拉科酰胺；

具體地，可以將(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸溶于有機溶劑中，在低溫的條件下，例如0到-20℃，加入鹵甲酸烷基酯、氮甲基嗎啡啉及芐胺溶液，自然升溫到室溫反應2-8小時，反應結(jié)束，采用常規(guī)的后處理方法，對制備的拉科酰胺進行提純處理。

或

可替代地，使(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸在縮合劑的存在下，和芐胺反應生成拉科酰胺；優(yōu)選地，所述縮合劑選自碳二亞胺類縮合劑，更優(yōu)選地，選自N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)?？梢岳斫獾氖?，使用縮合劑進行縮合反應，其反應條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來是容易實現(xiàn)的，本發(fā)明在此不進行贅述。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，可選地，步驟(b)包括：

(b3)使(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸與氨基保護試劑反應生成式Ⅵ所示的化合物，其中，PG代表氨基保護基團，優(yōu)選地，PG代表叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基、芐氧羰基或三苯甲基；

具體實施過程中，可以將含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的溶液，例如(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液或提純后的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸重新配制成的溶液，用堿調(diào)節(jié)pH值到8～9，加入氨基保護試劑，室溫反應8-24小時，反應結(jié)束后，采用常規(guī)手段進行提純處理，得到式Ⅵ所示的化合物。

(b4)使式Ⅵ所示的化合物與芐胺反應，得到式Ⅶ所示的化合物；

優(yōu)選地，步驟(b4)包括：

使式Ⅵ所示的化合物在堿和芐胺存在條件下與鹵甲酸烷基酯反應生成式Ⅶ所示的化合物；

具體地，可以將Ⅵ所示的化合物溶于有機溶劑中，在低溫的條件下，例如0到-20℃，加入鹵甲酸烷基酯、氮甲基嗎啡啉及芐胺溶液，自然升溫到室溫反應2-8小時，反應結(jié)束，采用常規(guī)的后處理方法，對制備的式Ⅶ所示的化合物進行提純處理。

或

使式Ⅵ所示的化合物在縮合劑的存在下，和芐胺反應生成式Ⅶ所示的化合物。優(yōu)選地，所述縮合劑選自碳二亞胺類縮合劑，更優(yōu)選地，選自N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)。

(b5)使式Ⅶ所示的化合物脫保護基生成式Ⅷ所示的化合物，(R)-2-胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺；

具體實施過程中，可以將Ⅶ所示的化合物溶于有機溶劑中，并向其中加入濃鹽酸，室溫反應1-5小時，反應完畢，采用常規(guī)的后處理方法，對式Ⅷ所示的化合物進行提純處理。

(b6)式Ⅷ所示的化合物與乙?；噭┓磻衫契０罚瑑?yōu)選地，所述乙?；噭┻x自乙酸酐、乙酰氯或乙酰溴。

具體實施過程中，將式Ⅷ所示的化合物溶于有機溶劑中，加入堿，例如三乙胺，在低溫條件下，例如0～5℃下加乙?；噭?，室溫，例如25度反應1-5個小時，反應完畢，采用常規(guī)的后處理方法，對合成出的拉科酰胺進行提純處理。

綜上可知，本發(fā)明的技術(shù)方案，以5-甲氧甲基海因代替D-絲氨酸作為起始原料，能夠降低拉科酰胺的制備成本。

不僅如此，以5-甲氧甲基海因作為起始原料，無需進行甲基化，可以避免使用昂貴或劇毒的甲基化試劑。進一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案，部分步驟采用酶促反應，更加綠色環(huán)保。而且，與芐胺的反應溫度相對現(xiàn)有技術(shù)也更加溫和。

更為重要的是，本發(fā)明的技術(shù)方案所制備的中間體(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的ee值不小于99％，優(yōu)選地，不小于99.9％，手性純度極高。因此，其不需要采用柱層析等手段進行異構(gòu)體的拆分，進而使整個拉科酰按的制備過程無需進行異構(gòu)體的拆分，工業(yè)化前景好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為2-氨基-3-甲氧基丙酸消旋體的高效液相譜圖；

圖2為實施例2制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的高效液相譜圖；

圖3為實施例5制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的高效液相譜圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行描述，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

首先對表達D-海因酶的濕菌體、表達海因消旋酶的濕菌體和表達D-氨甲?；饷傅臐窬w的制備過程進行說明。

(1)D-海因酶原始基因的合成：根據(jù)放射形土壤桿菌的D-海因酶的原始基因序列進行目的基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達載體pET26b-AA-hyd。放射形土壤桿菌D-海因酶氨基酸序列參見GenBank Accession:Q44184。

(2)海因消旋酶原始基因的合成：根據(jù)放射形土壤桿菌的海因消旋酶的原始基因序列進行目的基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達載體pET26b-AA-RA。放射形土壤桿菌的海因消旋酶的氨基酸序列參見GenBank Accession:WP_012650408。

(3)D-氨甲酰基水解酶原始基因的合成：根據(jù)放射形土壤桿菌D-氨甲?；饷傅脑蓟蛐蛄羞M行目的基因的全合成，合成后的全基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達載體pET26b-AA-Car。放射形土壤桿菌D-氨甲?；饷赴被嵝蛄袇⒁奊enBank Accession:Q44185。

(4)濕菌體的制備：將上述重組表達載體分別通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到表達菌株BL21(DE3)中。分別挑取單菌落，將單菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，振蕩培養(yǎng)過夜，次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mL TB培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀至3.0，然后添加IPTG至終濃度為0.1mM，25℃下誘導培養(yǎng)過夜。5000g離心10min后收集菌體，即得到表達D-海因酶的濕菌體、表達海因消旋酶的濕菌體和表達D-氨甲?；饷傅臐窬w。

拉科酰胺的制備路線一

實施例1

5-甲氧甲基海因(式II化合物)的制備

溴乙醛縮二乙醇(39.4g，0.2mol)溶于甲醇鈉(10.8g，0.2mol溶于100mL甲醇)溶液中，置于高壓釜內(nèi)，加熱到105～110℃，反應1小時，然后冷卻，倒入500mL冰水中，乙醚萃取(200mL×3)，無水硫酸鈉干燥，蒸去乙醚，殘余物減壓蒸餾，收集48～50℃/19mmHg產(chǎn)品，得到甲氧基乙醛縮二乙醇23g，收率78％。¹H NMR(CHCl₃):δ1.182(t,J＝6.8Hz,6H,(CH₂CH₃)₂),δ3.350(s,3H,OCH₃),δ3.402(d,J＝5.2Hz,2H,OCH₂),δ3.533(dd,J＝7.2,9.2Hz,2H,CH₂CH₃),δ3.661(dd,J＝7.2,9.6Hz,2H,CH₂CH₃),δ4.587(t,J＝5.2Hz,1H,CH)。

甲氧基乙醛縮二乙醇(14.8g，0.1mol)加入20mL 5N的鹽酸，室溫攪拌24小時，然后冷卻，加入Na₂SO₃(12.6g，0.1mol)，加入KCN(6.5g，0.1mol溶于50mL水)水溶液，室溫攪拌2小時，加入50mL乙醇和碳酸銨(19.2g，0.2mol)，混合物55℃加熱2小時，活性炭脫色，濃縮掉大部分溶劑，加入3倍體積乙醇，降溫緩慢析晶，固體過濾得5-甲氧甲基海因7.5g，收率52.1％，熔點167～170℃(升華)。¹H NMR(DMSO):δ3.262(s,3H,OCH₃),δ3.496(dd,J＝2.1,10.4Hz,1H,CHH’O),δ3.571(dd,J＝4,10.4Hz,1H,CHH’O),δ4.147(t,J＝3.2Hz,1H,CH),δ7.926(br,1H,NH),δ10.585(br,1H,NH)。

實施例2

(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸(化合物Ⅳ)的制備

將按前述方法獲得的表達D-海因酶的濕菌體2g、表達海因消旋酶的濕菌體2g和表達D-氨甲酰基水解酶的濕菌體4g重懸于20mL 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后得到粗酶液。

將按照實施例1的方法制備的5g底物5-甲氧甲基海因加入到80mL0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，隨后，將所制的粗酶液溶解0.05g硫酸錳后，加入底物的緩沖液中。在40℃下磁力攪拌反應25小時，并用4M鹽酸調(diào)節(jié)反應的pH值，使其維持在7.5左右。利用薄層層析法(TLC)檢測底物完全消耗，得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液。

將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液濃縮結(jié)晶得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，收率77％，¹H NMR(D₂O):δ3.182(s,3H,OCH₃),δ3.427(m,1H,CH),δ3.493(m,2H,CH₂O)。手性ee值100％。

其中，薄層層析法：薄層板：硅膠G；展開劑：正丁醇/醋酸/水＝4:1:1，Rf＝0.5，茚三酮顯色。

手性ee值采用高效液相色譜法測定：色譜條件：儀器：Aglient(安捷倫)1260高效液相色譜儀，紫外檢測器；色譜柱:CROWNPAK CR+,4.0*150mm,5um；流速:0.2mL/min；柱溫:5℃；檢測波長:200nm；流動相：稱取16.3g 70％高氯酸溶液至1L水中；進樣量:10μL；該高效液相色譜譜圖如圖2所示(圖1為2-氨基-3-甲氧基丙酸消旋體的測定譜圖，用于確定兩個異構(gòu)體的出峰位置)，根據(jù)圖2中(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和其異構(gòu)體的峰面積之比可以確定手性ee值100％。

實施例3

(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(化合物V)的制備

將按照實施例2的方法制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液(約含20g化合物Ⅳ，0.12mol)用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8～9，20℃滴加乙酸酐(19g，0.18mol)，室溫反應16小時，反應結(jié)束后，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH4左右，乙酸乙酯萃取(60mL×3)三次，有機相合并，濃縮得到淺黃色油狀物，石油醚打漿得黃色固體粉末，收率74％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.142(s,3H,C(O)CH₃),δ3.462(s,3H,OCH₃),δ3.477(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.889(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.543(m,1H,CH),δ6.217(d,1H,J＝5.7Hz,NH).

實施例4

(R)-2-乙酰胺基--N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(拉科酰胺)的制備將按照實施例3的方法制備的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(48.3g，0.3mol)溶于二氯甲烷溶液中，降溫至-10℃，加入氯甲酸異丁酯(37g，0.3mol)，-5℃以下滴加氮甲基嗎啡啉(30g，0.3mol)，放熱，滴畢，-5℃下攪拌反應半個小時，然后在-5℃以下滴加芐胺(25g，0.3mol溶于25g二氯甲烷)溶液，滴畢，自然升溫到室溫反應5小時，反應結(jié)束，依次用120mL水，120mL 4％鹽酸，120mL 8％NaHCO₃溶液和120ml水洗，有機相濃縮，用375mL乙酸乙酯/正己烷(1:3)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品61g，收率81％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.042(s,3H,C(O)CH₃),δ3.372(s,3H,OCH₃),δ3.441(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.816(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.478(d,2H,J＝5.7Hz,PhCH₂),δ4.517(m,1H,CH),δ6.462(d,1H,J＝5.7Hz,NH),δ6.776(br,1H,NH),δ7.264(m,5H,PhH).

拉科酰胺的制備路線二

實施例5

(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸(化合物Ⅳ)的制備

將按前述方法獲得的表達D-海因酶的濕菌體2g和表達海因消旋酶的濕菌體2g重懸于20mL 0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后得到粗酶液。

將按照實施例1的方法制備的5g底物5-甲氧甲基海因加入到80mL0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，隨后將所制的粗酶液溶解0.05g硫酸錳后，加入底物的緩沖液中。在40℃下磁力攪拌反應25小時，并用4M氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應的pH值，使其維持在7.5左右。利用薄層層析法檢測底物完全消耗(薄層層析法參照實施例2)，用4M鹽酸調(diào)ph至2.5析出固體，得到(R)-2-氨甲?；被?3-甲氧基丙酸。

將(R)-2-氨甲酰基氨基-3-甲氧基丙酸(14g，0.086mol)懸浮于250mL水中，加熱到10℃，加入34.7g濃鹽酸，滴加亞硝酸鈉水溶液(31.3g，含有6.26g亞硝酸鈉)，滴畢，10℃攪拌8小時，反應完畢，得到含有(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應液。

將(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶反應液濃縮結(jié)晶得到(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸，收率77％，¹H NMR(D₂O):δ3.182(s,3H,OCH₃),δ3.427(m,1H,CH),δ3.493(m,2H,CH₂O)。手性ee值99.72％。

檢測手性ee值的高效液相色譜譜圖如圖3所示(手性ee值的檢測方法同實施例2)，根據(jù)圖3中(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸和其異構(gòu)體的峰面積之比可以確定手性ee值99.72％。

實施例6

(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸(化合物V)的制備

將按照實施例5的方法制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸的反應液用30％NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH10.5，滴加醋酐(17.6g，0.172mol)，加熱到40度反應5小時，TLC(正丁醇/醋酸/水＝4:1:1，茚三酮顯色)顯示原料消耗完畢，弄4M的鹽酸調(diào)pH1～2，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次60mL，合并有機相，濃縮至干，石油醚打漿得到10.5g白色固體，收率76％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.142(s,3H,C(O)CH₃),δ3.462(s,3H,OCH₃),δ3.477(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.889(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.543(m,1H,CH),δ6.217(d,1H,J＝5.7Hz,NH)。

實施例7

拉科酰胺的制備

將按照實施例6的方法制備的(R)-2-乙酰氨基-3-甲氧基丙酸按照實施例4的方法制得拉科酰胺。

拉科酰胺的制備路線三

實施例8

N-Boc-O-甲基-D-絲氨酸(化合物Ⅵ)的制備

將按照實施例2的方法制備的(R)-2-氨基-3-甲氧基丙酸酶轉(zhuǎn)化液(約含35.7g化合物Ⅳ，0.3mol)用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH10～11，20℃滴加Boc酸酐(二碳酸二叔丁酯)(78.5g，0.36mol)，室溫反應16小時，反應結(jié)束后，用100mL甲基叔丁基醚萃取過量的Boc酸酐，水相用2N鹽酸調(diào)節(jié)pH5左右，二氯甲烷萃取(100mL×3)三次，有機相合并，無水硫酸鈉干燥，濃縮至干，石油醚打漿，過濾得白色固體粉末56.5g，收率86％。¹H NMR(CDCl₃):δ1.472(s,9H,(CH₃)₃O),δ3.393(s,3H,OCH₃),δ3.653(m,1H,NH),δ3.885(m,1H,CHH’O),δ4.294,4.461(t,J＝1.5Hz,1H,CH),δ452,5.927(m,1H,CHH’O),δ9.282(br,1H,COOH)。

實施例9

(R)-2-Boc胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(化合物Ⅶ)的制備

將按照實施例8的方法制備的N-Boc-O-甲基-D-絲氨酸(50g，0.23mol)溶于二氯甲烷溶液中，降溫至-10℃，加入氯甲酸異丁酯(28.4g，0.23mol)，-5℃以下滴加氮甲基嗎啡啉(23g，0.23mol)，放熱，滴畢，-5℃下攪拌反應半個小時，然后在-5℃以下滴加芐胺(19.2g，0.23mol溶于20g二氯甲烷)溶液，滴畢，自然升溫到室溫反應5小時，反應結(jié)束，依次用90mL水，90mL 4％鹽酸，90mL8％NaHCO₃溶液和90ml水洗，有機相濃縮的黃色油狀物，用350mL乙酸乙酯/正己烷(1:5)重結(jié)晶，得到產(chǎn)品45.5g，收率64％。¹H NMR(CDCl₃):δ1.424(s,9H,(CH₃)₃O),δ3.344(s,3H,OCH₃),δ3.505(dd,J＝6,9.2Hz,1H,CHH’O),δ3.806(dd,J＝4,9.2Hz,1H,CHH’O),δ4.290(m,1H,CH),δ4.464(m,2H,CH₂Ph),δ5.504(br,1H,BocNH),δ6.892(br,1H,BnNH),δ7.289(m,5H,PhH)。

實施例10

(R)-2-胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(化合物Ⅷ)的制備

將按照實施例9的方法制備的(R)-2-Boc胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(40g，0.13mol)溶于125mL二氯甲烷，反應液中加入75mL濃鹽酸，室溫攪拌反應2.5小時，反應完畢，有機相用35ml×2水洗，水相合并，用甲叔醚50mL提取雜質(zhì)，水層用30％NaOH調(diào)pH到10～12，二氯甲烷(50mL×2)提取，有機相合并，用30mL飽和食鹽水洗一次，有機相濃縮得淺黃色油狀物25g，收率92％，放置會固化。¹H NMR(CDCl₃):δ3.232(s,3H,OCH₃),δ3.431(m,1H,CH),δ3.498(m,2H,CH₂O),δ4.325(m,2H,CH₂Ph),δ7.199(m,5H,PhH),δ7.841(br,1H,NH)。

實施例11

拉科酰胺的制備

將按照實施例10的方法制備的(R)-2-胺基-N-芐基-3-甲氧基丙酰胺(21g，0.1mol)溶于100mL二氯甲烷溶液，加入三乙胺(14g，0.14mol)，在0～5℃滴加乙酸酐(12.2g，0.12mol)，滴畢，室溫25℃反應3個小時，反應完畢，用40mL水洗，二氯甲烷濃縮干，加200mL乙酸乙酯/正己烷1:1溶劑70℃溶解，然后緩慢降溫至室溫，大量固體析出，過濾，少量乙酸乙酯/正己烷1:1溶劑淋洗，干燥的拉科酰胺21.3g，收率85％。¹H NMR(CDCl₃):δ2.042(s,3H,C(O)CH₃),δ3.372(s,3H,OCH₃),δ3.441(dd,1H,J＝7.5,9.0Hz,CHH’O),δ3.816(dd,1H,J＝4.2,9.0Hz,CHH’O),δ4.478(d,2H,J＝5.7Hz,PhCH₂),δ4.517(m,1H,CH),δ6.462(d,1H,J＝5.7Hz,NH),δ6.776(br,1H,NH),δ7.264(m,5H,PhH).

以上對本發(fā)明所提供的拉科酰胺的制備方法進行了詳細介紹。本文中應用了具體實施例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護。