本實(shí)用新型涉及一種接種器具，確切講是一種將目標(biāo)真菌與寄主植物的接種部接觸，使真菌侵入寄主植物的接種器具，特別是適用于在硬質(zhì)的木本植物中接種的器具。

背景技術(shù)：

人工使病原真菌與寄主植物感病部位接觸，創(chuàng)造條件使病原物侵入并誘致寄主發(fā)病的過程叫接種。接種是證病過程的重要步驟，在研究寄生現(xiàn)象發(fā)病規(guī)律，測定品種抗病性，藥劑防病效果評(píng)價(jià)時(shí)都需要接種。因此，接種方法直接影響試驗(yàn)效果。

植物病害人工接種方法，是根據(jù)病害的傳染方式和侵染途徑設(shè)計(jì)的，植物病害的種類很多、其傳染方式和侵染途徑各異。真菌的接種方法有可采用無接種工具的方法和采用接種工具的方法兩類，其中采用接種工具的方法有：

1）噴霧法，這種方法是將配置好的孢子懸浮液，噴在寄主表面，病原菌可以從氣孔、傷口或表皮侵入。

2）涂抹法，即將病原菌用毛筆或刷涂抹在植物表面，使孢子萌發(fā)侵入。

3）注射法，將孢子懸浮液用注射器注射入記住生長點(diǎn)或幼嫩部分。

4）針刺法，人工制造機(jī)械損傷后，將菌餅貼在傷口處誘發(fā)病害。

現(xiàn)有的接種方法可參見《植病研究方法》方中達(dá)，1998。但傳統(tǒng)的接種方法往往具有接種效率低，癥狀發(fā)生慢，接種一致性差等缺點(diǎn)，而且前述的方法中1和2的方法在接種后還需要保濕48小時(shí)，而方法3和4的對(duì)于幼苗階段的較小個(gè)體，以及離體葉片等組織結(jié)構(gòu)，很難定量實(shí)施侵染。

中國發(fā)明專利201410604178.7公開了一種食用菌木簽菌種的制作方法，屬于食用菌生產(chǎn)種植領(lǐng)域。該方法包括如下步驟：將紗布或牛皮紙訂于木簽的一端放入石灰水中浸泡至木簽內(nèi)部無白心，撈出木簽晾干表水；將面粉、玉米粉、白砂糖、石膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、菇豐素、維生素B₁加到水中，加熱至漿糊狀得到粘合劑；將木簽與粘合劑混合攪拌至粘合劑均勻附著在木簽表面，加入麩皮或米糠攪拌至其均勻粘附木簽表面70-80%時(shí)，將木簽裝入聚丙烯袋或菌種瓶中，封口后滅菌；在無菌條件下接種菌種，置于20-26℃培養(yǎng)10-20天，即可長滿菌絲。但這種木簽菌種卻不適合用于真菌接種，特別是不適合于在樹木類的硬質(zhì)植物上接種。

中國發(fā)明專利申請201310720075.2公開一種木釘菌種方法，該專利所用的接種木釘是用枝丫、廢材、次品食簽棍、油條、杏條制作成粗度為0.5cm的帶有尖端的棒狀木釘，其使用時(shí)是用5%濃度的常溫白糖水浸泡24小時(shí)撈出再拌入菌釘體積的10%的營養(yǎng)料即可裝袋用于接種。但這種木釘浸入培養(yǎng)基會(huì)軟化，再用這種木釘在質(zhì)地較硬的寄主，例如樹木上，接種時(shí)將可能無法剌入寄主，實(shí)現(xiàn)接種作業(yè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型給出一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的真菌接種工具。

本實(shí)用新型的接種具由帶有尖端的棒狀金屬件和鑲嵌于棒狀金屬件上的的接種體構(gòu)成，其中的接種體由木質(zhì)或竹質(zhì)或其它可以使細(xì)菌、真菌在上附著的材料構(gòu)成，且接種體至少有一部分外露于棒狀金屬件的外表面。

本實(shí)用新型的接種方法使用的接種具還可以是由木制或竹制其一端帶圓錐體、圓錐體后設(shè)置為圓柱體的接種體和固定于圓錐體頭部的金屬尖端構(gòu)成。

優(yōu)選地，本實(shí)用新型的接種具的金屬尖端與木制或竹制圓錐體間嵌鑲固定，或者用螺紋固定。

本實(shí)用新型的接種工具所用的金屬為不銹鋼。

本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是：

1、由于本實(shí)用新型采用帶有尖端的金屬棒狀結(jié)構(gòu)，特別是不銹鋼針尖便于組織刺傷，尤其適合于樹干堅(jiān)硬的林木接種， 完全不存在現(xiàn)有技術(shù)中接種木釘軟化的不足。另一方面，本實(shí)用新型的接種具在使用后只要洗凈、滅菌后即可重復(fù)使用，也可在特殊情況下將更換接種體，因此使用本實(shí)用新型的接種具可節(jié)省成本。

2、本實(shí)用新型的接種具上設(shè)置的木質(zhì)或竹質(zhì)的接種體，即可以染菌以侵染寄主，同時(shí)更便于精確觀測病原菌侵入點(diǎn)，精準(zhǔn)定點(diǎn)觀測和統(tǒng)計(jì)。

3、誤差小。以往制備孢子懸浮液或者孢子涂抹，為了保證達(dá)到較高的病原菌濃度，需要用血球計(jì)數(shù)板配制孢子懸浮液。但血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)僅僅是一個(gè)倍數(shù)換算的統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)值，往往和實(shí)際情況誤差較大（如：用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子濃度達(dá)到1×10⁶個(gè)/ml，而實(shí)際可能只有1×10⁵個(gè)/ml，最多能差10倍）。采用本實(shí)用新型的工具將不用配制孢子懸浮液，在搖床上能保證每個(gè)接種體所帶菌量均勻一致，避免產(chǎn)生誤差。

4、均勻性好。傳統(tǒng)的孢子懸浮液接種、涂抹接種等方法，只是將一定濃度的孢子接種至植物，但均勻性很難保證，尤其是接種種子、幼苗等較小個(gè)體，可能發(fā)生漏接種的現(xiàn)象（如噴霧接種法：有些種子表面可能在噴霧中，接觸到10個(gè)孢子，而有些可能1個(gè)都沒有）。本實(shí)用新型的接種工具制備過程中，勻速搖床使接種具上木質(zhì)或竹質(zhì)接種體與病原菌充分混勻，從最大概率上保證了每個(gè)接種具帶菌量的一致，接種過程中刺入植物，保證了接種過程中病原物數(shù)量的均勻，與處理間的一致。

5、發(fā)病快。噴霧接種法、涂抹接種法等方法，需等待病原菌萌發(fā)，芽管生長，再形成附著孢，侵入植物，會(huì)受到植物表皮蠟質(zhì)層、角質(zhì)層等影響,出現(xiàn)癥狀往往需要10天左右時(shí)間。采用本實(shí)用新型的接種工具接種，可直接造成創(chuàng)傷，能迅速使病原物侵入植物,大約3-4天即可觀察到癥狀，考察病原菌對(duì)植物造成的危害，測量病原菌在植物中的生長、擴(kuò)展速度。

6、定點(diǎn)性強(qiáng)，便于觀察。采用現(xiàn)有的接種工具不容易從宏觀上確定究竟是哪些孢子萌發(fā)侵入植物，具體觀測時(shí)容易受到多處侵入點(diǎn)的互相影響。而使用本實(shí)用新型，其侵入點(diǎn)固定，即從針刺處開始侵染，容易觀測病原菌侵入植物的過程、程度，并定點(diǎn)測量病原菌在植物上的擴(kuò)展速度。

7、本實(shí)用新型的接種具更為實(shí)用并可使操作更加方便簡單。傳統(tǒng)針刺法后，也用孢子懸浮液或者菌餅接種。孢子懸浮液仍存在上述的缺點(diǎn)。而菌餅接種法存在以下問題：1菌落不同區(qū)域產(chǎn)生的菌餅帶菌量不同，病原菌活性不同，所以不同菌餅處理間一致性差；2菌餅接種過程需要其他工具輔助制造傷口，菌餅接種后還要封閉保濕，易污染；木質(zhì)的接種工具易發(fā)生軟化而難于剌入較硬的寄主。本實(shí)用新型的接種具前端為一金屬的尖端，本身就是制造創(chuàng)傷的工具；再加上是用金屬制備，由于材料質(zhì)地的原因，使其有相當(dāng)?shù)膭偠榷菀棕萑雸?jiān)硬的木質(zhì)寄主內(nèi)，同時(shí)當(dāng)接種體在與培養(yǎng)基作用時(shí)不影響其金屬尖端的剛度，更不會(huì)造成現(xiàn)有的木釘前端變軟的不足；接種具中的嵌入的木質(zhì)或竹質(zhì)部件本身形成一個(gè)接種體，它可以與病原菌共同培養(yǎng)，可攜帶大量病原菌，使接種作業(yè)簡捷方便。所以本實(shí)用新型的方法及接種具集合了多重作用，并可使操作更為簡單。

附圖說明

附圖1為本實(shí)用新型的接種具示意圖。圖中：1為接種具的棒狀金屬件，2為鑲嵌于棒狀金屬件上的木質(zhì)或竹質(zhì)的部件，3為棒狀金屬件的尖端部分。

附圖2為附圖1的A-A向剖面示意圖。

附圖3為本實(shí)用新型的另一實(shí)施例示意圖。

具體實(shí)施方式

以下是本實(shí)用新型的實(shí)施例。

本實(shí)用新型的接種工具的一個(gè)實(shí)施例如圖1所示，是由棒狀金屬件1和鑲嵌于棒狀金屬件上的木質(zhì)或竹質(zhì)的接種體2構(gòu)成，棒狀金屬件1的前端是一個(gè)尖端部分。在實(shí)際制備中可以如附圖1所示在棒狀金屬件1上開設(shè)一個(gè)通孔，再在通孔內(nèi)嵌鑲一塊由木質(zhì)或竹質(zhì)材料的接種體2，這樣接種體2的兩端將可以外露以與培養(yǎng)菌接觸。接種工具也可以制成在棒狀金屬件1上開設(shè)一個(gè)盲孔，在盲孔內(nèi)嵌鑲一塊由木質(zhì)或竹質(zhì)材料的接種體，這一結(jié)構(gòu)中接種體將只有一個(gè)露在外面，在盲孔的孔頂可以設(shè)置一個(gè)頂絲，旋轉(zhuǎn)頂絲可以將嵌鑲?cè)朊た椎慕臃N體頂出盲孔以便于更換。

本實(shí)用新型的接種工具的第三個(gè)實(shí)施例如圖3示，它是由木制或竹制其一端帶圓錐體、圓錐體后設(shè)置為圓柱體，及嵌鑲于圓錐體頭部的金屬尖端構(gòu)成。本實(shí)用新型的接種工具中，其金屬尖端與木制或竹制圓錐體間嵌鑲固定，或者用螺紋固定，即在金屬制的尖端和木制或竹制圓錐體與金屬制尖端相配合處各自設(shè)置相互配合的陽螺紋的陰螺紋。

本實(shí)用新型的接種工具所用的金屬最好采用不銹鋼。

本實(shí)用新型的接種工具的一個(gè)實(shí)際制品的尺寸如下：其圓柱體部分長10mm、直徑2mm，尖端部分長5mm。

使用本實(shí)用新型進(jìn)行接種的過程如下：

將純化后的目標(biāo)病原菌，打出5mm直徑菌餅，加入前述的三角瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中，放在恒溫?fù)u床（依據(jù)不同病原菌調(diào)整溫度）上，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)10-15天，病原菌持續(xù)生長。然后將接種具121℃高壓30min滅菌2次，第3次浸入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中滅菌后，再在無菌環(huán)境下將接種具轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)的病原菌三角瓶中，每250ml中加入數(shù)十枚接種具。然后繼續(xù)放在恒溫?fù)u床（依據(jù)不同病原菌調(diào)整溫度）上進(jìn)行病原菌培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時(shí)間約72h。再從培養(yǎng)基中取出染菌的接種具，在無菌環(huán)境下利用其前部的尖端刺入確定為寄主的幼苗根莖部，或葉片或樹木莖部等部位，造成人為創(chuàng)傷，使接種體部分與寄主接種部位相接觸，即可促進(jìn)病原菌從傷口侵入，用于離體葉片侵染、病害系統(tǒng)侵染等試驗(yàn)。

采用本實(shí)用新型的方法接種與未接種的進(jìn)行對(duì)比可見：寄主的接種部位已經(jīng)呈現(xiàn)感染現(xiàn)象，表明已經(jīng)被接種感染，而相對(duì)比的未染菌的接種具剌傷的植株雖然也被剌傷，但卻并不呈現(xiàn)感染現(xiàn)象。

為檢驗(yàn)接種體的可靠性，將10個(gè)接種具放在滅菌培養(yǎng)皿（90mm）中，加入5ml無菌水，充分?jǐn)噭?dòng)搖勻，洗下接種體表面的孢子形成懸浮液。在普通顯微鏡下（100×）統(tǒng)計(jì)20個(gè)視野中的孢子數(shù)量，根據(jù)顯微鏡的視野直徑和培養(yǎng)皿內(nèi)徑計(jì)算每個(gè)接種體上的孢子數(shù)量。共10個(gè)重復(fù)。用目鏡測微尺測得，顯微鏡100×下每個(gè)視野的直徑為2mm，90mm培養(yǎng)皿底蓋內(nèi)徑為85mm，培養(yǎng)皿底蓋共有1805.25個(gè)視野，每個(gè)接種體帶孢子數(shù)為：

。每個(gè)接種體所帶孢子數(shù)為48～62，平均為56個(gè)，經(jīng)SPSS方差分析，每個(gè)接種體所帶孢子數(shù)量無顯著差異。