本發(fā)明涉及多肽的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種縊蟶抗高血肽的制備方法。
背景技術(shù)：
海洋貝類資源豐富且富含許多生理活性物質(zhì)，因而逐漸被廣泛研究和應(yīng)用?？O蟶（Sinonovaculaconstricta）俗名蟶子，屬瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、燈塔蛤科、縊蟶屬，在我國沿海均有分布，產(chǎn)量較大，為我國四大養(yǎng)殖貝類之一，縊蟶肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，富含人體生命活動所需的各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)?？O蟶性寒、可補(bǔ)陰去邪熱，治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產(chǎn)后虛損、虛熱等癥，具有較高的藥用食用價值，對縊蟶肉的酶解條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)提取得到的糖胺聚糖對體外培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞均有一定抑制作用，且隨著用量增加抑制作用增強(qiáng)。張永娟等，提取縊蟶多肽能促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟發(fā)育及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD還能提高血清SOD、GSH-Px水平，降低血清MDA 含量。
活性多肽由于具有敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少等優(yōu)點，已被用作抗腫瘤藥物開發(fā)的一個重要來源。研究已經(jīng)證實，食物蛋白通過蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽。對于縊蟶，在抗高血壓方面的研究還很少，特別是利用酶解技術(shù)提取多肽在抗腫瘤方面的研究并未見報道。
現(xiàn)在已有很多研究采用酶解技術(shù)成功提取了動物多肽，說明從縊蟶中提取抗高血肽可行性很高?，F(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為CN104004808B的中國專利，公開了一種具有抗凝血與溶血栓全蝎多肽及其酶解制備方法與應(yīng)用，制備方法包括：全蝎干體清洗干燥，粉粹成粉末；加入水均勻攪拌，pH 調(diào)至7~10，以100~300r/min 的速度勻速攪拌1h~3h，離心，上清液pH 調(diào)至3~7，得蛋白沉淀；將蛋白加水溶解，比例為5~20g ：100mL，pH 調(diào)至7.5~10，再加入堿性蛋白酶，該酶體積與蛋白重量之比0.1~5mL ：100g，溫度40~80℃，攪拌速度100~300r/min，時間1~5h ；將酶解液通過陰離子交換柱分離純化，收集干燥，得抗凝血肽粉。該方法為抗凝血類活性物質(zhì)增加了新來源，實現(xiàn)原料的充分利用，具有產(chǎn)品活性高、制備過程方便可行、環(huán)保等優(yōu)點，所制得的抗凝血肽粉可作為預(yù)防血栓、溶血栓、降血稠類食品的原料。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，提取率高，提取的抗高血肽純度高，活性強(qiáng)的縊蟶抗高血肽的制備方法。
本發(fā)明針對背景技術(shù)提到的問題，采取的技術(shù)方案為：
1）酶解：將縊蟶用冰水沖洗2~4次，將泥沙和附著縊蟶表面的污漬和微生物清洗干凈，瀝干。在鼓風(fēng)機(jī)中干燥，溫度為50~70℃，干燥時間1~2h，用粉碎機(jī)粉碎，過100~400目篩，按料液體積比為1:20~1:30加入Tris—HCl緩沖液，濃度為1.2~1.8 mol/L，水浴加熱攪拌，用鹽酸調(diào)節(jié)pH。加入復(fù)合酶制劑木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亞硫酸鈉0.05~0.08份，氯化鈣0.2~0.5份，ε-多聚賴氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份和助溶劑水楊酸鈉4~12份，硫代甜菜堿0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。使用上述復(fù)合酶制劑酶解縊蟶不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應(yīng)時間。加入助溶劑能抗高血肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解溫度為50~60℃，pH為6.5~7.2，酶解時間為3~5h，離心取上清液，加入析出劑硫酸銨2~5份，氯化鈉1~4份和共軛亞油酸0.4~0.8份，靜置過濾得粗抗高血肽。上述析出劑能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質(zhì)蛋白質(zhì)和多肽的析出少；
2）超濾：在步驟1得到的抗高血肽中按體積比1:10~1:15加入Tris—HCl緩沖液，濃度為1.2~1.8 mol/L，選用2500~3500Da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為500~1000Pa；
3）制備縊蟶抗高血肽：將步驟2得到的超濾液過HPLC柱，固定相為ZrO2/SiO2，流動相為含0.0002~0.0004%雙乙酸鈉1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl緩沖液，收集含抗高血肽的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉流動相留下縊蟶抗高血肽固體，冷凍干燥，研磨，得到縊蟶抗高血肽粉末。上述方法制備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強(qiáng)，抗高血壓作用很好；使用酶解技術(shù)制備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用于抗高血壓藥物的生產(chǎn)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：采用復(fù)合酶制劑木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，半胱氨酸，亞硫酸鈉，氯化鈣，ε-多聚賴氨酸和硫胺酶解縊蟶，不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應(yīng)時間；加入助溶劑水楊酸鈉，硫代甜菜堿和二烯丙基二硫能抗高血肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率；析出劑硫酸銨，氯化鈉和共軛亞油酸能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質(zhì)蛋白質(zhì)和多肽的析出少；制備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強(qiáng)，抗高血壓作用很好；使用酶解技術(shù)制備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用于抗高血壓藥物的生產(chǎn)。
具體實施例
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
實施例1：
一種縊蟶抗高血肽的制備方法，具體操作步驟為：
1）酶解：將縊蟶用冰水沖洗2~4次，將泥沙和附著縊蟶表面的污漬和微生物清洗干凈，瀝干。在鼓風(fēng)機(jī)中干燥，溫度為50~70℃，干燥時間1~2h，用粉碎機(jī)粉碎，過100~400目篩，按料液體積比為1:20~1:30加入Tris—HCl緩沖液，濃度為1.2~1.8 mol/L，水浴加熱攪拌，用鹽酸調(diào)節(jié)pH。加入復(fù)合酶制劑木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亞硫酸鈉0.05~0.08份，氯化鈣0.2~0.5份，ε-多聚賴氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份和助溶劑水楊酸鈉4~12份，硫代甜菜堿0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。使用上述復(fù)合酶制劑酶解縊蟶不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應(yīng)時間。加入助溶劑能抗高血肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解溫度為50~60℃，pH為6.5~7.2，酶解時間為3~5h，離心取上清液，加入析出劑硫酸銨2~5份，氯化鈉1~4份和共軛亞油酸0.4~0.8份，靜置過濾得粗抗高血肽。上述析出劑能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質(zhì)蛋白質(zhì)和多肽的析出少；
2）超濾：在步驟1得到的抗高血肽中按體積比1:10~1:15加入Tris—HCl緩沖液，濃度為1.2~1.8 mol/L，選用2500~3500Da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為500~1000Pa；
3）制備縊蟶抗高血肽：將步驟2得到的超濾液過HPLC柱，固定相為ZrO2/SiO2，流動相為含0.0002~0.0004%雙乙酸鈉1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl緩沖液，收集含抗高血肽的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉流動相留下縊蟶抗高血肽固體，冷凍干燥，研磨，得到縊蟶抗高血肽粉末。上述方法制備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強(qiáng)，抗高血壓作用很好；使用酶解技術(shù)制備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用于抗高血壓藥物的生產(chǎn)。
實施例2：
一種縊蟶抗高血肽的制備方法，最優(yōu)選操作步驟為：
1）酶解：將縊蟶用冰水沖洗3次，將泥沙和附著縊蟶表面的污漬和微生物清洗干凈，瀝干。在鼓風(fēng)機(jī)中干燥，溫度為65℃，干燥時間1.5h，用粉碎機(jī)粉碎，過200目篩，按料液體積比為1:25加入Tris—HCl緩沖液，濃度為1.5 mol/L，水浴加熱攪拌，用鹽酸調(diào)節(jié)pH。加入復(fù)合酶制劑木瓜蛋白酶8份，中性蛋白酶6份，半胱氨酸0.6份，亞硫酸鈉0.07份，氯化鈣0.3份，ε-多聚賴氨酸0.02份和硫胺0.01份和助溶劑水楊酸鈉9份，硫代甜菜堿1.0份和二烯丙基二硫0.3份。使用上述復(fù)合酶制劑酶解縊蟶不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應(yīng)時間。加入助溶劑能抗高血肽在Tris—HCl緩沖液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解溫度為55℃，pH為7.0，酶解時間為4h，離心取上清液，加入析出劑硫酸銨3份，氯化鈉2份和共軛亞油酸0.6份，靜置過濾得粗抗高血肽。上述析出劑能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質(zhì)蛋白質(zhì)和多肽的析出少；
2）超濾：在步驟1得到的抗高血肽中按體積比1:12加入Tris—HCl緩沖液，濃度為1.5 mol/L，選用3000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，壓力為800Pa；
3）制備縊蟶抗高血肽：將步驟2得到的超濾液過HPLC柱，固定相為ZrO2/SiO2，流動相為含0.0003%雙乙酸鈉1.5mol/L 的Tris—HCl緩沖液，收集含抗高血肽的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉流動相留下縊蟶抗高血肽固體，冷凍干燥，研磨，得到縊蟶抗高血肽粉末。上述方法制備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強(qiáng)，抗高血壓作用很好；使用酶解技術(shù)制備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用于抗高血壓藥物的生產(chǎn)。
以上實施方式僅用于說明本發(fā)明，而并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型。因此，所有等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。