本發(fā)明涉及食品工業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及生產(chǎn)L-谷氨酰胺的菌株和生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法。
背景技術(shù)：
：谷氨酰胺不僅是合成蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，還是許多重要化合物如嘌呤、嘧啶，及其它氨基酸合成的氨基供體。谷氨酰胺能夠?qū)瓜罎?，維持正常的腸胃功能，保證氮代謝平衡，及調(diào)節(jié)人體正常的酸堿平衡，具有重要的免疫和營(yíng)養(yǎng)功能。目前，谷氨酰胺的主要生產(chǎn)方法為微生物發(fā)酵法，微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品原料豐富，逐步取代了傳統(tǒng)的酶法和化學(xué)合成法。在高NH4+、低pH的的情況下，谷氨酸經(jīng)谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺。人們?cè)趶墓劝彼嵘a(chǎn)菌中篩選谷氨酰胺生產(chǎn)菌方面做了許多研究。事實(shí)上，現(xiàn)在的谷氨酰胺生產(chǎn)菌有很多都是從谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌改造而來(lái)。近年來(lái)，隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032基因組測(cè)序的完成，以及棒桿菌基因操作技術(shù)的不斷完善，使得通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行相關(guān)改造成為現(xiàn)實(shí)。谷氨酰胺在生物體內(nèi)的合成途徑也已相繼報(bào)道。腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(ATase)是谷氨酰胺合成酶(GS)的腺苷?；揎椕浮Ｋ^腺苷酰化修飾就是AMP以共價(jià)鍵方式與肽鏈上的酪氨酸殘基結(jié)合產(chǎn)生GS(AMP)的過(guò)程，GS的腺苷酰化和去腺苷?；加上佘挣＾D(zhuǎn)移酶催化。腺苷酰化會(huì)使GS的活性降低或喪失。另外，GS的腺苷?；揎検Щ罴捌淠孢^(guò)程也受到銨離子濃度的調(diào)控。在限制銨鹽的培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的細(xì)胞內(nèi)的GS是未被腺苷?；揎椀?。而在過(guò)量銨鹽的培養(yǎng)條件下，腺苷?；潭仍鰪?qiáng)，GS酶活力下降甚至失活(黃星，過(guò)程工程學(xué)報(bào).2008,8(1):135-139)。因此，解除對(duì)GS的腺苷?；揎椬饔每梢院艽蟪潭忍岣週-谷氨酰胺的產(chǎn)量。谷氨酸棒桿菌中存在谷氨酰胺酶(GLS)，該酶可分解谷氨酰胺成為谷氨酸。高銨離子濃度和低pH可抑制該酶的活性。傳統(tǒng)谷氨酰胺發(fā)酵中，通過(guò)降低發(fā)酵中后期培養(yǎng)基的pH，可實(shí)現(xiàn)高谷氨酰胺積累。在谷氨酸棒桿菌中缺失該基因，可減少谷氨酰胺的分解代謝。雖然上述舉措都實(shí)現(xiàn)里利用谷氨酸棒桿菌來(lái)生產(chǎn)L-谷氨酰胺，但谷氨酰胺的產(chǎn)量仍有待進(jìn)一步的提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供生產(chǎn)L-谷氨酰胺的菌株和生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，本發(fā)明提供的生產(chǎn)L-谷氨酰胺的菌株能夠?qū)⒐劝滨０返漠a(chǎn)量提高至28.9g/L。本發(fā)明提供了弱化odhA表達(dá)的重組菌株；其起始菌株為谷氨酸棒桿菌；弱化為使odhA基因的起始密碼子由ATG突變?yōu)镚TG。α-酮戊二酸是谷氨酸的直接前體，而后者又是谷氨酰胺的直接前體。本發(fā)明將odhA的表達(dá)弱化，以期使更多代謝流從TCA循環(huán)的α-酮戊二酸節(jié)點(diǎn)通往谷氨酸合成方向，繼而在增強(qiáng)的谷氨酰胺合成酶的作用下，積累更高量的谷氨酰胺。本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步修飾該谷氨酰胺產(chǎn)生菌的odhA基因(編碼α-酮戊二酸脫氫酶E1o亞基)，降低該基因的表達(dá)水平，從而減弱了α-酮戊二酸的進(jìn)一步氧化脫羧，導(dǎo)致更多代謝流從TCA循環(huán)進(jìn)入谷氨酸及谷氨酰胺合成方向。修飾手段為將odhA編碼基因的起始密碼子由ATG改為GTG，降低該基因的起始翻譯效率。本發(fā)明中，重組菌株包括編碼突變pyc蛋白的DNA分子，所述突變pyc蛋白具有P458S突變。草酰乙酸與乙酰輔酶A的縮合是TCA循環(huán)的第一步反應(yīng)，由于odhA基因的弱化，TCA循環(huán)被減弱，造成草酰乙酸供應(yīng)不足，后者的缺乏限制了乙酰輔酶A繼續(xù)進(jìn)入TCA循環(huán)。丙酮酸羧化酶(由pyc編碼)催化丙酮酸一步羧化為草酰乙酸，是回補(bǔ)途徑的關(guān)鍵酶。本發(fā)明通過(guò)增強(qiáng)回補(bǔ)途徑，以期緩解odhA弱化后引起的草酰乙酸匱乏所帶來(lái)的負(fù)效應(yīng)，并且促進(jìn)代謝流從糖酵解途徑快速進(jìn)入TCA循環(huán)及谷氨酰胺合成支路。因此，本發(fā)明進(jìn)一步強(qiáng)化丙酮酸羧化酶基因(Pyc)的表達(dá)水平，以回補(bǔ)TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸。強(qiáng)化丙酮酸羧化酶基因表達(dá)水平是通過(guò)點(diǎn)突變改造來(lái)實(shí)現(xiàn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道(J.Ohnishietal,2002)，通過(guò)點(diǎn)突變改造將丙酮酸羧化酶第458位的氨基酸脯氨酸改變成絲氨酸，可以顯著提高該酶的活性水平。但該改造常用于增加以天冬氨酸為前體的代謝產(chǎn)物的合成，如賴氨酸或蘇氨酸的合成，但此前尚不明確，pycP458S突變表達(dá)是否會(huì)對(duì)谷氨酰胺的代謝途徑中的關(guān)鍵酶表達(dá)產(chǎn)生影響，也無(wú)法明確這一點(diǎn)突變的引入是否能夠提高谷氨酰胺的產(chǎn)量。而本發(fā)明對(duì)不同基因背景的菌株進(jìn)行pyc改造，其結(jié)果截然不同。在保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌的菌株上進(jìn)行pyc改造，并沒有造成谷氨酰胺產(chǎn)量的提升。但在經(jīng)odhA弱化后的谷氨酸棒桿菌菌株上進(jìn)行pyc改造，則能夠顯著增加的谷氨酰胺產(chǎn)量(p<0.05)。本發(fā)明中，谷氨酸棒桿菌為保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明中，重組菌株的保藏編號(hào)為CGMCCNo.13405。本發(fā)明提供的重組菌株在L-谷氨酰胺生產(chǎn)中的應(yīng)用。用于L-谷氨酰胺生產(chǎn)的重組菌株中odhA基因表達(dá)被弱化，基因型為MHZ-0512-3((G1A)odhA)。該重組菌株中還可以包括pyc突變，pyc突變?yōu)閜ycP458S。包括pyc突變且odhA基因被弱化的重組菌株的基因型為MHZ-0512-3((G1A)odhA，pyc(P458S))。MHZ-0512-3即為保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌，該菌株為谷氨酸棒桿菌ATCC14067經(jīng)腺苷酰轉(zhuǎn)移酶敲低和谷氨酰胺酶敲低后構(gòu)得。本發(fā)明研究表明，單獨(dú)pyc改造不能提高谷氨酸棒桿菌積累谷氨酰胺的能力，但pyc改造與odhA弱化改造相互配合，則可以大幅提高谷棒產(chǎn)谷氨酰胺的水平。說(shuō)明，pyc高表達(dá)與odhA弱化表達(dá)，對(duì)合成谷氨酰胺具有協(xié)同促進(jìn)作用。由于odhA基因的弱化，TCA循環(huán)被減弱，造成草酰乙酸供應(yīng)不足，后者的缺乏限制了乙酰輔酶A繼續(xù)進(jìn)入TCA循環(huán)。pyc基因的增強(qiáng)表達(dá)，可以及時(shí)回補(bǔ)生成草酰乙酸，加快乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)，并減少了TCA循環(huán)還原階段的碳流量，減少能量損失，進(jìn)而提高了底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明還提供了重組菌株的構(gòu)建方法，包括：以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始密碼子突變?yōu)镚TG的odhA基因片段，構(gòu)建入質(zhì)粒載體后，電穿孔法轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌株。起始密碼子突變?yōu)镚TG的odhA基因片段的獲得方法為：采用SEQIDNO:1～2所示引物對(duì)和SEQIDNO:3～4所示引物對(duì)分別對(duì)保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得上游片段(odhA-up)和下游片段(odhA-dn)；以odhA-up、odhA-dn兩片段混合物為模板，以SEQIDNO:1所示引物和SEQIDNO:4所示引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得突變的odhAA1G片段(SEQIDNO:9)。所述質(zhì)粒載體為pK18mobsacB。所述構(gòu)建入質(zhì)粒載體的酶切位點(diǎn)為BamHI、NheI。所述谷氨酸棒桿菌的保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404；其感受態(tài)細(xì)胞的獲得方式參照谷棒經(jīng)典方法。電轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)和普通液體腦心浸液培養(yǎng)，獲得重組菌株。所述選擇性培養(yǎng)基中，含有濃度為15mg/L的卡那霉素；培養(yǎng)的溫度為33℃，倒置培養(yǎng)。所述普通液體腦心浸液培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為33℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)的過(guò)程中，odhAA1G基因由于同源性被插入到染色體中。液體腦心浸液培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過(guò)基因交換將載體序列從基因組中除去。普通液體腦心浸液培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h，獲得目的重組菌株蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的序列，和核苷酸測(cè)序分析，鑒定重組菌株。獲得odhA表達(dá)弱化的重組菌株后，將該菌株以谷棒經(jīng)典方法制備感受態(tài)，導(dǎo)入編碼突變pycP458S蛋白的DNA分子。具體為：以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得編碼突變pycP458S蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體后，電穿孔法轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌株。編碼突變pycP458S蛋白的DNA分子獲得方法為：采用SEQIDNO:5～6所示引物對(duì)和SEQIDNO:7～8所示引物對(duì)分別對(duì)保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得上游片段(pyc458-up)和下游片段(pyc458-dn)；以pyc458-up、pyc458-dn兩片段混合物為模板，以SEQIDNO:5所示引物和SEQIDNO:8所示引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得突變的pycP458S片段(SEQIDNO:10)。所述質(zhì)粒載體為pK18mobsacB。所述構(gòu)建入質(zhì)粒載體的酶切位點(diǎn)為SphI、NheI。將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-pycP458S轉(zhuǎn)化入odhA表達(dá)弱化的重組菌株的感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)和普通液體腦心浸液培養(yǎng)，獲得重組菌株。所述選擇性培養(yǎng)基中，含有濃度為15mg/L的卡那霉素；培養(yǎng)的溫度為33℃，倒置培養(yǎng)。所述普通液體腦心浸液培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為33℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)的過(guò)程中，pycP458S基因由于同源性被插入到染色體中。液體腦心浸液培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過(guò)基因交換將載體序列從基因組中除去。普通液體腦心浸液培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h，獲得目的重組菌株本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，發(fā)酵本發(fā)明提供的重組菌株。本發(fā)明中，發(fā)酵前經(jīng)過(guò)種子活化的步驟；所述活化的培養(yǎng)基包括水和：所述發(fā)酵的培養(yǎng)基包括水和：本發(fā)明中，發(fā)酵的溫度為33℃，時(shí)間48小時(shí)。搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150rpm?；罨蠓N子液的接種量為10％。本發(fā)明研究表明，單獨(dú)pyc改造不能提高谷氨酸棒桿菌積累谷氨酰胺的能力，但pyc改造與odhA弱化改造配合，則可以大幅提高谷棒產(chǎn)谷氨酰胺的水平。說(shuō)明，pyc高表達(dá)與odhA弱化表達(dá)，對(duì)合成谷氨酰胺具有協(xié)同促進(jìn)作用。本發(fā)明以保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌為出發(fā)，通過(guò)弱化odhA及增強(qiáng)pyc的表達(dá)水平，構(gòu)建得到L-谷氨酰胺基因工程改造菌，對(duì)其中一株進(jìn)行保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13405。該菌株能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中L-谷氨酰胺的高效積累，L-谷氨酰胺可達(dá)28.9g/L。生物保藏說(shuō)明生物材料MHZ-0512-3，分類命名：谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404。生物材料MHZ-0513-3，分類命名：谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13405。附圖說(shuō)明圖1示重組質(zhì)粒pK18mobsacB-odhAA1G；圖2示重組質(zhì)粒pK18mobsacB-pycP458S；圖3示本發(fā)明所構(gòu)建基因工程菌的L-谷氨酰胺產(chǎn)量。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-谷氨酰胺的菌株和生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。本發(fā)明中涉及的基因名稱解釋如下：glnA：谷氨酰胺合成酶(GS)；glnE：腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(ATase)；glsA：谷氨酰胺酶(GLS)；odhA：α-酮戊二酸脫氫酶E1o亞基(ODHC)；pyc：丙酮酸羧化酶(Pyc)。以下實(shí)施例中使用的引物序列信息如表1所示：表1、引物序列信息引物名稱序列(5’-3’)odhA-1fgaGGATCCaagcacacttgtttagtggaSEQIDNO:1odhA-1rgccccagttgtagcactaatttgttgacagSEQIDNO:2odhA-2fctgtcaacaaattagtgctacaactggggcSEQIDNO:3odhA-2rctaGCTAGCcgaaccgaggttgcggttggSEQIDNO:4pyc-1fgaGCATGCgggcaaccacgtcttcatcgaaaSEQIDNO:5pyc-1rctgaaggaggtgcgagtgatcggcaatgaSEQIDNO:6pyc-2ftcattgccgatcactcgcacctccttcagSEQIDNO:7pyc-2rctaGCTAGCggggtgtatcccacggtgttgcgSEQIDNO:8下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1重組質(zhì)粒pK18mobsacB-odhAA1G的構(gòu)建及引入以保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404谷氨酸棒桿菌(記為MHZ-0512-3)基因組為模板，分別以odhA-1f/odhA-1r引物對(duì)和odhA-2f/odhA-2r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游片段odhA-up和下游片段odhA-dn；以odhA-up、odhA-dn兩片段混合物為模板，以odhA-1f/odhA-2r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到突變的odhAA1G片段。odhAA1G片段用BamHI、NheI進(jìn)行雙酶切，pK18mobsacB用同樣的酶雙切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-odhAA1G(圖1)。按照(C.glutamicumHandbook,Charpter23)制備保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒pK18mobsacB-odhAA1G以電穿孔方法轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細(xì)胞，并在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，其中感興趣的基因由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)于普通液體腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為33℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過(guò)基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的序列，和核苷酸測(cè)序分析，驗(yàn)證獲得的為目的突變菌株，并命名為MHZ-0513-1。實(shí)施例2重組質(zhì)粒pK18mobsacB-pycP458S的構(gòu)建及引入以保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404谷氨酸棒桿菌(記為MHZ-0512-3)基因組為模板，分別以pyc-1f/pyc-1r引物對(duì)和pyc-2f/pyc-2r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游片段pyc458-up和下游片段pyc458-dn。以pyc458-up、pyc458-dn兩片段混合物為模板，以pyc-1f/pyc-2r引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到突變的pycP458S片段。pycP458S片段用SphI、NheI進(jìn)行雙酶切，pK18mobsacB用同樣的酶雙切。兩酶切產(chǎn)物以T4DNALigase進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pK18mobsacB-pycP458S(圖2)。按照谷棒經(jīng)典方法制備保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404谷氨酸棒桿菌和MHZ-0513-1的感受態(tài)細(xì)胞。pK18mobsacB-pycP458S重組質(zhì)粒以電穿孔方法分別轉(zhuǎn)化兩種感受態(tài)細(xì)胞，并在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，其中目的基因由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)于普通液體腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為33℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。此培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過(guò)基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h。蔗糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的序列，和核苷酸測(cè)序分析，獲得目的突變菌株。分別將以保藏編號(hào)為CGMCCNo.13404谷氨酸棒桿菌(記為MHZ-0512-3)和MHZ-0513-1為出發(fā)菌株，所獲得的疊加改造菌株命名為MHZ-0513-2和MHZ-0513-3。其中，對(duì)MHZ-0513-3進(jìn)行保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.13405。實(shí)施例1-2所獲得的產(chǎn)谷氨酰胺基因改造菌株如下表2所示。表2：本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌菌株編號(hào)改造位點(diǎn)MHZ-0512-3---MHZ-0513-1MHZ-0512-3((G1A)odhA)MHZ-0513-2MHZ-0512-3(pyc(P458S))MHZ-0513-3MHZ-0512-3((G1A)odhA，pyc(P458S))實(shí)施例3L-谷氨酰胺基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酰胺將所構(gòu)建的基因工程菌株MHZ-0513-1、MHZ-0513-2、MHZ-0513-3進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測(cè)試。于200ml三角瓶進(jìn)行種子培養(yǎng)，裝液量50ml/瓶。于500ml三角搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量20ml/瓶。接種量10％，培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時(shí)間48小時(shí)。所述種子培養(yǎng)基成分如下：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米漿30g/L，NaOH調(diào)pH7.0。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米漿10g/L，CaCO350g/L，NaOH調(diào)pH7.0。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行，稀釋100倍后檢測(cè)OD562值。谷氨酰胺產(chǎn)量以液相色譜法進(jìn)行分析，最終結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)的平均值。各基因工程菌株發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酰胺結(jié)果見表3。產(chǎn)酸提高率的計(jì)算方法為，以對(duì)照菌株為參考，實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株產(chǎn)酸提高的程度，以百分比表示。負(fù)值表示實(shí)驗(yàn)菌株比對(duì)照菌株產(chǎn)酸降低。表3：基因工程菌株發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酰胺菌株OD562L-谷氨酰胺(g/L)產(chǎn)酸提高率(％)MHZ-0512-355.122.1--MHZ-0513-144.925.615.8％MHZ-0513-256.621.4-3.2％MHZ-0513-343.528.930.8％由表3可知，odhA的弱化改造菌MHZ-0513-1比之出發(fā)菌株MHZ-0512-3生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)略有下降，但谷氨酰胺的產(chǎn)量有較大提升，產(chǎn)酸提高15.8％，具有顯著性差異。說(shuō)明，odhA的弱化改造在以α-酮戊二酸為前體的氨基酸合成中具有關(guān)鍵作用。α-酮戊二酸是谷氨酸的直接前體，而后者又是谷氨酰胺的直接前體。odhA的弱化可以使更多代謝流從TCA循環(huán)的α-酮戊二酸節(jié)點(diǎn)通往谷氨酸合成方向，繼而在增強(qiáng)的谷氨酰胺合成酶的作用下，積累更高量的谷氨酰胺。MHZ-0513-2、MHZ-0513-3是關(guān)于提高pyc基因表達(dá)水平的改造菌。從表3中可以看出，對(duì)不同基因背景的菌株進(jìn)行pyc改造，其結(jié)果截然不同。在MHZ-0512-3菌株上進(jìn)行pyc改造，并沒有造成谷氨酰胺產(chǎn)量的提升。但在MHZ-0513-1菌株上進(jìn)行pyc改造，具有顯著增加的谷氨酰胺產(chǎn)量。與出發(fā)菌株MHZ-0513-1相比，MHZ-0513-3菌株的產(chǎn)酸水平提高了12.9％，具有顯著性差異(p<0.05)。本研究表明，單獨(dú)pyc改造不能提高谷氨酸棒桿菌積累谷氨酰胺的能力，但pyc改造與odhA弱化改造偶聯(lián)，則可以大幅提高谷棒產(chǎn)谷氨酰胺的水平。說(shuō)明，pyc高表達(dá)與odhA弱化表達(dá)，對(duì)合成谷氨酰胺具有協(xié)同促進(jìn)作用。由于odhA基因的弱化，TCA循環(huán)被減弱，造成草酰乙酸供應(yīng)不足，后者的缺乏限制了乙酰輔酶A繼續(xù)進(jìn)入TCA循環(huán)。pyc基因的增強(qiáng)表達(dá)，可以及時(shí)回補(bǔ)生成草酰乙酸，加快乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)，并減少了TCA循環(huán)還原階段的碳流量，減少能量損失，進(jìn)而提高了底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司<120>生產(chǎn)L-谷氨酰胺的菌株和生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法<130>MP1623783<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>1gaggatccaagcacacttgtttagtgga28<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>2gccccagttgtagcactaatttgttgacag30<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgtcaacaaattagtgctacaactggggc30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4ctagctagccgaaccgaggttgcggttgg29<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>5gagcatgcgggcaaccacgtcttcatcgaaa31<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>6ctgaaggaggtgcgagtgatcggcaatga29<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>7tcattgccgatcactcgcacctccttcag29<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>8ctagctagcggggtgtatcccacggtgttgcg32<210>9<211>3774<212>DNA<213>人工序列<400>9gtgctacaactggggcttaggcataatcagccaacgaccaacgttacagtggataaaata60aagctcaataaaccctcaagaagcaaggaaaagaggcgagtacctgccgtgagcagcgct120agtactttcggccagaatgcgtggctggtagacgagatgttccagcagttccagaaggac180cccaagtccgtggacaaggaatggagagaactctttgaggcgcaggggggaccaaatgct240acccccgctacaacagaagcacagccttcagcgcccaaggagtctgcgaaaccagcacca300aaggctgcccctgcagccaaggcagcaccgcgcgtagaaaccaagccggccgccaagacc360gcccctaaggccaaggagtcctcagtgccacagcaacctaagcttccggagccaggacaa420accccaatcaggggtattttcaagtccatcgcgaagaacatggatatctccctggaaatc480ccaaccgcaacctcggttcgcgatatgccagctcgcctcatgttcgaaaaccgcgcgatg540gtcaacgatcagctcaagcgcacccgcggtggcaagatctccttcacccacatcattggc600tacgccatggtgaaggcagtcatggctcacccggacatgaacaactcctacgacgtcatc660gacggcaagccaaccctgatcgtgcctgagcacatcaacctgggccttgccatcgacctt720cctcagaaggacggctcccgcgcacttgtcgtagcagccatcaaggaaaccgagaagatg780aacttctccgagttcctcgcagcatacgaagacatcgtgacacgctcccgcaagggcaag840ctcaccatggatgactaccagggcgttaccgtttccttgaccaacccaggtggcatcggt900acccgccactctgtcccacgtctgaccaagggccagggcaccatcatcggtgtcggttcc960atggattacccagcagagttccagggcgcttccgaagaccgccttgcagagctcggcgtt1020ggcaagcttgtcaccatcacctccacctacgatcaccgcgtgatccagggtgctgtgtcc1080ggtgaattcctgcgtaccatgtctcgcctgctcaccgatgattccttctgggatgagatc1140ttcgacgcaatgaacgttccttacaccccaatgcgttgggcacaggacgttccaaacacc1200ggtgttgataagaacacccgcgtcatgcagctcattgaggcataccgctcccgtggacac1260ctcatcgctgacaccaacccactttcatgggttcagcctggcatgccagttccagaccac1320cgcgacctcgacatcgagacccacagcctgaccatctgggatctggaccgtaccttcagc1380gtcggtggcttcggcggcaaggagaccatgaccctgcgcgaggtactgtcccgcctgcgc1440gctgcctacaccttgaaggtcggctccgaatacacccacatcctggaccgcgacgagcgc1500acctggctgcaggaccgcctcgaagccggaatgccaaagccaacccaggcagagcagaag1560tacatcctgcagaagctgaacgccgcagaggctttcgagaacttcctgcagaccaagtac1620gtcggccagaagcgcttctccctcgaaggtgcagaagctctcatcccactgatggactcc1680gccatcgacaccgccgcaggccagggcctcgacgaagttgtcatcggtatgccacaccgt1740ggtcgcctcaacgtgctgttcaacatcgtgggcaagccactggcatccatcttcaacgag1800tttgaaggccaaatggagcagggccagatcggtggctccggtgacgtgaagtaccacctc1860ggttccgaaggccagcacctgcagatgttcggcgacggcgagatcaaggtctccctgact1920gctaacccgtcccacctggaagctgttaacccagtgatggaaggtatcgtccgcgcaaag1980caggactacctggacaagggcgtagacggcaagactgttgtgccactgctgctccacggt2040gacgctgcattcgcaggcctgggcatcgtgccagaaaccatcaacctggctaagctgcgt2100ggctacgacgtcggaggcaccatccacatcgtggtgaacaaccagatcggcttcaccacc2160accccagactccagccgctccatgcactacgcaaccgactacgccaaggcattcggctgc2220ccagtcttccacgtcaatggtgatgacccagaggcagttgtctgggttggccagctggca2280accgagtaccgtcgtcgcttcggcaaggacgtcttcatcgacctcgtttgctaccgcctc2340cgcggccacaacgaagctgatgatccttccatgacccagccaaagatgtatgagctcatc2400accggccgcgagaccgttcgtgctcagtacaccgaagacctgctcggacgtggagacctc2460tccaacgaagatgcagaagcagtcgtccgcgacttccacgaccagatggaatctgtgttc2520aacgaagtcaaggaaggcggcaagaagcaggctgaggcacagaccggcatcaccggctcc2580cagaagcttccacacggccttgagaccaacatctcccgtgaagagctcctggaactggga2640caggctttcgccaacaccccagaaggcttcaactaccacccacgtgtggctccagttgct2700aagaagcgcgtctcctctgtcaccgaaggtggcatcgactgggcatggggcgagctcctc2760gccttcggttccctggctaactccggccgcttggttcgccttgcaggtgaagattcccgc2820cgcggtaccttcacccagcgccacgcagttgccatcgacccagcgaccgctgaagagttc2880aacccactccacgagcttgcacagtccaagggcaacaacggtaagttcctggtctacaac2940tccgcactgaccgagtacgcaggcatgggcttcgagtacggctactccgtaggaaacgaa3000gactccgtcgttgcatgggaagcacagttcggcgacttcgccaacggcgctcagaccatc3060atcgatgagtacgtctcctcaggcgaagctaagtggggccagacctccaagctgatcctt3120ctgctgcctcacggctacgaaggccagggcccagaccactcttccgcacgtatcgagcgc3180ttcctgcagctgtgcgctgagggttccatgactgttgctcagccatccaccccagcaaac3240cacttccacctgctgcgtcgtcacgctctgtccgacctgaagcgtccactggttatcttc3300accccgaagtccatgctgcgtaacaaggctgctgcctccgcaccagaagacttcactgag3360gtcaccaagttccaatccgtgatcgacgatccaaacgttgcagatgcagccaaggtgaag3420aaggtcatgctggtctccggcaagctgtactacgaattggcaaagcgcaaggagaaggac3480ggacgcgacgacatcgcgatcgttcgtatcgaaatgctccacccaattccgttcaaccgc3540atctccgaggctcttgccggctaccctaacgctgaggaagtcctcttcgttcaggatgag3600ccagcaaaccagggcccatggccgttctaccaggagcacctcccagagctgatcccgaac3660atgccaaagatgcgccgcgtttcccgccgcgctcagtcctccaccgcaactggtgttgct3720aaggtgcaccagctggaggagaagcagcttatcgacgaggctttcgaggcttaa3774<210>10<211>3423<212>DNA<213>人工序列<400>10gtgtcgactcacacatcttcaacgcttccagcattcaaaaagatcttggtagcaaaccgc60ggcgaaatcgcggtccgtgctttccgtgcagcactcgaaaccggtgcagccacggtagct120atttaccc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