本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗ros1單克隆抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

ros1是最先在ur2鳥肉瘤病毒中被發(fā)現(xiàn)的具有獨(dú)特致癌作用的病毒原癌基因，而人類ros1基因是胰島素受體家族的一種跨膜絡(luò)氨酸激酶，定位于第6號(hào)染色體q21區(qū)，分子量為259kda。ros1基因含有44個(gè)外顯子，編碼2347aa，由胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)(c末端464aa)、跨膜區(qū)(1862-1882aa)及胞外區(qū)(n端1-1861aa,含多個(gè)糖基化位點(diǎn))三部分組成。

ros1融合基因是新發(fā)現(xiàn)的nsclc一個(gè)分子亞型，癌癥患者常見于年齡偏小，不吸煙，病理類型為腺癌的肺癌，在nsclc突變基因中占2.4％，它的發(fā)現(xiàn)使其成為nsclc患者有效的治療靶點(diǎn)，其抑制劑克唑替尼(crizotinib)抗腫瘤臨床活性的證實(shí)，進(jìn)一步推動(dòng)了晚期nsclc個(gè)體化治療的發(fā)展。ros1基因重排位點(diǎn)主要在32-36外顯子，ros1基因發(fā)生重排時(shí)保留胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)和跨膜區(qū)，丟失n末端糖基化胞外區(qū)。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)9種不同的ros1融合基因型(圖2)[4]，不同的ros1融合基因變體具有不同的惡性轉(zhuǎn)化和致瘤能力。

目前在臨床病理學(xué)上通常用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,ihc)病理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中ros1的表達(dá)狀況。其實(shí)驗(yàn)方法的核心為特異性結(jié)合ros1的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個(gè)檢測(cè)的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性和靈敏度較高的針對(duì)ros1蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗ros1單克隆抗體和應(yīng)用，提高所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗與ros1蛋白的結(jié)合特異性并應(yīng)用到相關(guān)產(chǎn)品的制備中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，保藏編號(hào)為cgmccno：12288。

本發(fā)明所述抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞由以下方法制備獲得：

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)ros1orf核苷酸序列(ros1orf核苷酸序列如seqidno.1所示，7041bp；ros1氨基酸序列如seqidno.2所示)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)sgfi和mlui，插入表達(dá)載體pcmv6-entry(貨號(hào)ps100001，origene公司)，構(gòu)建ros1重組表達(dá)質(zhì)粒rc220652；

(2)ros1重組蛋白的表達(dá)與純化：將ros1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化hek293t，裂解離心取上清，ddk親和層析柱純化，獲得純化的ros1重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的ros1重組蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗ros1特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株；通過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得ros1單克隆抗體。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

經(jīng)過上述方法制備后，篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗ros1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為oti1a1，亞型鑒定為igg2a，并于2016年4月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno：12288。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗ros1蛋白單克隆抗體，由保藏編號(hào)為cgmccno：12288的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生。制備抗ros1蛋白單克隆抗體可采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法，如通過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得ros1單克隆抗體。

本發(fā)明所述保藏編號(hào)為cgmccno：12288的雜交瘤細(xì)胞染色體穩(wěn)定，其分泌產(chǎn)生的抗ros1蛋白單克隆抗體為igg2a型，效價(jià)較高。所述單克隆抗體的免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，其能夠特異性識(shí)別非小細(xì)胞肺癌組織中的ros1蛋白，同時(shí)細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示，其能夠特異性識(shí)別非小細(xì)胞肺癌肺癌細(xì)胞系hcc78中的ros1蛋白。

因此，本發(fā)明還提供了保藏編號(hào)為cgmccno：12288的的雜交瘤細(xì)胞在制備抗ros1蛋白單克隆抗體中的應(yīng)用以及所分泌的抗ros1蛋白單克隆抗體在制備檢測(cè)ros1蛋白的免疫檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述免疫檢測(cè)產(chǎn)品為試劑盒、試紙或芯片。

本發(fā)明還提供一種免疫組化檢測(cè)的試劑盒，包括保藏編號(hào)為cgmccno：12288的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗ros1蛋白單克隆抗體。所述免疫檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)腫瘤組織中ros1的表達(dá)狀況。

此外，本發(fā)明還提供保藏編號(hào)為cgmccno：12288的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的抗ros1蛋白單克隆抗體在制備標(biāo)記腫瘤組織及其微環(huán)境中淋巴細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述腫瘤包括非小細(xì)胞肺癌。

本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞可穩(wěn)定分泌產(chǎn)生抗ros1蛋白單克隆抗體，而與ros1融合蛋白陽性細(xì)胞系hcc78中的ros1特異性結(jié)合，顯著提高了ros1蛋白免疫檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，適用于非小細(xì)胞肺癌中ros1的檢測(cè)。

生物保藏信息說明

oti1a1，分類命名為程序性死亡分子1(ros1)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，于2016年4月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno：12288。

附圖說明

圖1所示為實(shí)施例1中克隆位點(diǎn)圖；

圖2所示為實(shí)施例2中ros1蛋白westernblot檢測(cè)結(jié)果圖，以anti-ddk檢測(cè)ros1蛋白在hek293t細(xì)胞中的表達(dá)，其中泳道l為轉(zhuǎn)染空載體的hek293t細(xì)胞裂解液為抗原的檢測(cè)結(jié)果、泳道r為轉(zhuǎn)染pcmv6-ros1質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液抗原的檢測(cè)結(jié)果；

圖3所示為實(shí)施例2中ros1蛋白sds-page結(jié)果圖；

圖4所示實(shí)施例4非小細(xì)胞肺癌組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為oti1a1分泌產(chǎn)生的ros1單抗，1:5000)；

圖5所示實(shí)施例5非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系hcc78細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果圖(一抗為oti1a1分泌產(chǎn)生的ros1單抗，1:500)。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明公開了抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗ros1單克隆抗體和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

下面就本發(fā)明提供的抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗ros1單克隆抗體和應(yīng)用做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：ros1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以ros1的cdna序列合成全長基因，設(shè)計(jì)兩條引物并分別引入酶切位點(diǎn)sgfi和mlui，克隆入表達(dá)載體pcmv6-entry，建立ros1全長蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

實(shí)施例2：ros1重組蛋白的表達(dá)與純化

1、轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞：hek293t細(xì)胞以1:3傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；取7.5mldmem(無血清及抗生素)至50ml管中，加入300μlpeimegatran1.0混勻；加入75μgros1重組質(zhì)粒dna至混勻液中，混勻并靜置30分鐘；分別取515μl至各培養(yǎng)皿中于37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，每皿細(xì)胞添加25μl2m丁酸鈉至終濃度5mm。

2、裂解細(xì)胞：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞裂解。吸去培養(yǎng)基，加入1mlpbs進(jìn)行漂洗，吸去pbs。加入1ml裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑pi和pmsf。置于冰盒中在搖床上振蕩，收集所有培養(yǎng)皿中得裂解液，4度離心，收集上清。

3、ddk親和層析柱純化：以0.45μm，33mmpvdf膜濾器過濾離心后的裂解液上清并轉(zhuǎn)入15ml管，加入混合好的beads1ml，封口后放入360度混勻器中，于4℃結(jié)合2小時(shí)；取出15ml管，將裂解液倒入bio-rad層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣wb檢測(cè)，見圖2；以裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用tbst沖洗beads3次，滴盡后用0.1mglycineph3.5洗脫，第一次200μl，滴盡不收集，第二、三次各500μl，第三次250μl，收集至一個(gè)1.5mltube中，并迅速加入nah2po4(ph＝11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至終濃度為10％，tween-80至終濃度為0.1％。純化后的ros1蛋白用sds-page鑒定，見圖3。

由圖2結(jié)果可見，標(biāo)簽抗體anti-ddk能檢測(cè)到轉(zhuǎn)染pcmv6-ros1的重組質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液中ros1重組蛋白(r)，由于ros1是i型跨膜糖蛋白，因此其蛋大小為45～55kda之間多條帶，與預(yù)期相符，表明ros1重組蛋白正確表達(dá)。

由圖3結(jié)果可見，經(jīng)過ddk親和層析柱純化，glycine洗脫可得到高純度的ros1重組蛋白。

實(shí)施例3：抗ros1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其單克隆抗體的制備篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用重組產(chǎn)生的純化的全長ros1重組蛋白(以下簡(jiǎn)稱為ros1抗原)用于對(duì)b6/c57小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫。具體方法如下：

1、動(dòng)物免疫：經(jīng)過純化的ros1抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測(cè)定血清效價(jià)；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用balb/c來源的sp2/0，融合時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養(yǎng)基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、篩選和克?。喝诤?-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用純化的ros1重組蛋白進(jìn)行elisa測(cè)試。標(biāo)記細(xì)胞株號(hào)。對(duì)陽性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測(cè)定elisa值，挑取od280陽性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至elisa測(cè)定96孔板全板結(jié)果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對(duì)應(yīng)融合板細(xì)胞株為oti1a1。

4、細(xì)胞上清單抗的制備與純化：將細(xì)胞株oti1a1用含15％血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，擴(kuò)培至約4×10⁷個(gè)時(shí)，800rpm離心5min，棄上清并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2l轉(zhuǎn)瓶中，加入無血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度約為3×10⁵個(gè)/ml。繼續(xù)培養(yǎng)1～2周后，當(dāng)細(xì)胞死亡率達(dá)到60％-70％時(shí)(此時(shí)細(xì)胞密度大概為1-2×10⁶個(gè)/ml)，收取細(xì)胞懸液6000rpm高速離心20min，取上清，親和層析法進(jìn)行上清純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，細(xì)胞株oti1a1產(chǎn)生的單抗亞型為igg2a，采用proteing進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y(cè)定、分裝(100ul/管，濃度為1mg/ml)、保存在4-8℃。

實(shí)施例4：oti1a1分泌產(chǎn)生的單克隆抗體為一抗的免疫組化檢測(cè)

(1)、實(shí)驗(yàn)方法：

1、分別取2例非小細(xì)胞肺癌組織進(jìn)行石蠟包埋，使用sakura組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為4μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復(fù)液(1mmedta,ph8.5的10mmtris-hcl緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)2.5min，待高壓鍋溫度降至約90℃時(shí)，打開高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入ros1單抗(oti1a1分泌產(chǎn)生)，稀釋比：1:150，使用封閉液進(jìn)行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加聚合物hrp染色試劑盒中試劑pv6000(catlogno.pv-6000)，37℃孵育15分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖4。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖4結(jié)果可見，ros1蛋白在非小細(xì)胞肺癌ros1陽性病例1#的腫瘤細(xì)胞中呈特異性細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而在ros1陰性病例2#中無任何著色，如圖箭頭所示腫瘤細(xì)胞。表明本發(fā)明所述單抗可與腫瘤細(xì)胞中ros1蛋白特異性結(jié)合。

實(shí)施例5：oti1a1分泌產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系hcc78為文獻(xiàn)報(bào)道的能高表達(dá)ros1融合蛋白的細(xì)胞系,hela為ros1陰性細(xì)胞系。我們通過細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)抗體oti1a1在hcc78和hela細(xì)胞系上的染色，基本過程如下：

1、準(zhǔn)備細(xì)胞：準(zhǔn)備hcc78和hela細(xì)胞(293t，atcccatlogno.crl-3216)和穩(wěn)定表達(dá)lgr5的293t細(xì)胞系(lgr5/293t)，于含5％co2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、固定細(xì)胞：加入75％丙酮溶液于這2種細(xì)胞系中，4度孵育30min,固定細(xì)胞；

3、封閉細(xì)胞：pbst(0.05％tritonx-100)清洗上述細(xì)胞后，加入含4％bsa的pbs溶液封閉細(xì)胞，4度2h。

4、孵育抗體：將ros1鼠單抗oti1a1(工作濃度為1ug/ml)分別與以上2種細(xì)胞于4度共孵育1小時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照(不加一抗，僅加pbs)。

5、孵育二抗：將上述的細(xì)胞-抗體混合液用pbs洗滌3次，；然后加入驢抗鼠alexa488標(biāo)記二抗(jackson,catlogno.715-545-151)200ul/孔，4度共孵育1小時(shí)。

6、洗滌后顯微鏡觀察分析。

7、根據(jù)陰性，陽性，空白對(duì)照來進(jìn)行結(jié)果分析和判定。

結(jié)果見圖5。

圖5結(jié)果顯示，在hcc78上僅有ros1蛋白與oti1a1分泌產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合，呈現(xiàn)棕褐色染色信號(hào)；而hela上不見任何信號(hào)。表明本發(fā)明所述單抗可與ros1蛋白特異性結(jié)合。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110>無錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗ros1蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗ros1單克隆抗體和應(yīng)用

<210>1

<211>864

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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