技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大孔吸附樹脂分離純化黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II的工藝，屬于天然藥物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：中藥黨參來源于桔梗科植物的3個(gè)品種，分別為黨參Codonopsispliosula（Franch）Nannf、素花黨參CodoncpsispilosulaNannf.var.modesta（Nannf）L.T.Shen或川黨參CodonopisistangshenOliv.的干燥根[1]。黨參具有補(bǔ)中益氣，生津和胃，健脾益肺等功效，為我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥，可以作為人參的替代品[2-4]。黨參藥材中指標(biāo)性成分蒼術(shù)內(nèi)酯的主要藥理作用為中樞抑制、解痙、光敏活性、抗炎活性等。大孔樹脂因?yàn)榫哂羞x擇性好、吸附迅速、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，在天然產(chǎn)物的提取純化方面得到了廣泛的應(yīng)用[5]。經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研，大孔樹脂分離純化黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯和蒼術(shù)內(nèi)酯的工藝研究未見報(bào)道。1.ChinesePharmacopoeiaCommission(國(guó)家藥典委員會(huì)).PharmacopoeiaofthePeople’sRepublicofChina(中華人民共和國(guó)藥典).Beijing:ChinaMedicalSciencePress,2005.VolⅠ,199.2.WangZT(王崢濤),ZhuEY(朱恩圓),HeQ(賀慶),etal.ChemicalStudyontheRootofCodonopsispilosula..JournalofChinaPharmaceuticalUniversity(中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)),2001,32:94-95.3.LiLX(李黎星),KangJF(康杰芳).AdvancesinstudiesonCodonopsis.ProgressinModernBlomedlelne(現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展),2009,9:2371-2373.4.ChenKK(陳克克).ResearchSurveyonCodonopsis.JournalofXi’anUniversityofArts&Scicncc(NatSciEd)(西安文理學(xué)院學(xué)報(bào)自然科學(xué)版),2008,11:33-39.5.ChenX(程賢),BiLW(畢良武),ZhaoZD(趙振東),,etal.StaticAdsorptionandDesorptionofRosmarinicAcidonMacroporousresins..NaturalProductResearchandDevelopment(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2016,4:601-606.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：黨參中的蒼術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)內(nèi)酯II含量較低，富集、分離、純化存在一定的困難，尤其是蒼術(shù)內(nèi)酯II，提取液中因含量太低無法測(cè)出。為解決上述問題，采用了如下技術(shù)手段：一種大孔吸附樹脂分離純化黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II的工藝，包括如下步驟：第1步，將黨參用乙醇溶液進(jìn)行提取，得到醇提液，將醇提液減壓濃縮至干，固體物為黨參粗提物，加水溶解后制備得到提取物溶液；第2步，將提取物溶液采用DM130大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，再用乙醇溶液進(jìn)行解吸，得到解吸液；第3步，將解吸液減壓濃縮至干后，得到含蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II的提取物。所述的第1步中，黨參與乙醇溶液的重量比是1：3～6，更優(yōu)選是1：5；提取是采用回流提取1～3h，更優(yōu)選是2h；所述的乙醇溶液的體積濃度是95%。所述的第1步中，提取物溶液是黨參粗提物與水按照重量/體積比0.05～0.5g/ml稀釋后得到，更優(yōu)選的重量/體積比是0.125g/mL。所述的第2步中，吸附過程溫度范圍是25～35℃，更優(yōu)選是30℃，吸附過程的上樣流速是6ml/min。所述的第2步中，解吸過程采用的解吸液是體積濃度在30～95℃內(nèi)的乙醇溶液，更優(yōu)選是95%，解吸過程洗脫液的洗脫流速是4ml/min。所述的第1步中，在得到了提取物溶液后，將其送入C18硅膠柱色譜進(jìn)行吸附，再用體積比為25∶75的甲醇-水體系洗脫5BV，棄洗脫液，再用體積比為45∶65的甲醇-水體系洗脫5BV，收集洗脫液，再將洗脫液減壓蒸干之后，加水稀釋作為純化后的提取物溶液，送入第2步中處理。所述的提取物溶液與C18反相硅膠重量比是2：1。有益效果利用DM130大孔樹脂吸附分離純化黨參中的蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脫率高等特點(diǎn)，且產(chǎn)品的解吸率穩(wěn)定,是黨參深度利用的有效技術(shù)。與原液相比較，蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II在干固體中的含量分別增加了32.3和25.6倍。附圖說明圖1是對(duì)照品的色譜圖（1：蒼術(shù)內(nèi)酯II；2：蒼術(shù)內(nèi)酯I）圖2是蒼術(shù)內(nèi)酯I的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線圖3是蒼術(shù)內(nèi)酯I等溫吸附曲線圖4是蒼術(shù)內(nèi)酯I的泄漏曲線圖5是蒼術(shù)內(nèi)酯I洗脫曲線圖6是蒼術(shù)內(nèi)酯II洗脫曲線圖7純化前蒼術(shù)內(nèi)酯II的色譜圖圖8純化后蒼術(shù)內(nèi)酯II的色譜圖圖9純化前蒼術(shù)內(nèi)酯I的色譜圖圖10純化后蒼術(shù)內(nèi)酯I的色譜圖具體實(shí)施方式儀器、樣品與試藥儀器超聲波清洗器（KH-500DE，昆山禾創(chuàng)造聲儀器有限公司）；高速粉碎機(jī)（YK-400B，山東省青州市益康中藥機(jī)械有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-601，金壇市恒豐儀器廠）；氣流烘干器（豫康牌C型，上海豫康科教設(shè)備儀器有限公司）；電子天平（BS110S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent1100Series，美國(guó)安捷倫公司）；真空干燥箱（DZF-6020型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱（766-3型，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）。樣品黨參來源于甘肅省天水市甘谷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室林麗高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsispliosula（Franch）Nannf的干燥根。試劑乙腈（德國(guó)默克，色譜純）；重蒸水；甲醇（色譜純，工業(yè)純）；乙醇（工業(yè)純）；乙酸乙酯（分析純，批號(hào)：20120408，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；正丁醇（分析純，批號(hào)：20120211，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。對(duì)照品蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II(批號(hào)：MUST-11122210，MUST-11122211，成都曼思特股份有限公司)；大孔吸附樹脂（D101、HPD-100、H103、DM130和S-8，滄州市寶恩化工有限公司）。高效液相色譜分析對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品蒼術(shù)內(nèi)酯I1.07mg，蒼術(shù)內(nèi)酯II1.12mg、置10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品1。將對(duì)照品1分別吸取1mL，置l00mL的容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品2。含量測(cè)定方法色譜條件：色譜柱：ThermoODSHYPERSIL柱；檢測(cè)波長(zhǎng):蒼術(shù)內(nèi)酯I為277nm、蒼術(shù)內(nèi)酯II為220nm；柱溫：25℃；流速：1mL/min；流動(dòng)相：乙腈(B)-水(A)；梯度洗脫：0~13min,25%B；13~35min，60%B；35~40min,100%B；40~55min，100%B；進(jìn)樣量：20μL。色譜條件的優(yōu)化檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：選擇吸收波長(zhǎng)為220、267、238、250和277nm，測(cè)得蒼術(shù)內(nèi)酯I的最大吸收波長(zhǎng)為277nm，蒼術(shù)內(nèi)酯II的最大吸收波長(zhǎng)為220nm，在267nm均處無吸收。在277和220nm處，蒼術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)內(nèi)酯II分離良好，故選擇277nm和220nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相選擇：分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水等流動(dòng)相進(jìn)行了考察，并考察了等度洗脫及不同比例梯度洗脫條件，最終以乙腈（B）-水（A）為流動(dòng)進(jìn)行梯度洗脫(0~13min，25%B；13~35min，60%B；35~40min，100%B；40~55min，100%B)，樣品的分離較好，且重復(fù)性良好。在選定條件下，色譜峰能達(dá)到基線分離，蒼術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)內(nèi)酯II與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3000。色譜圖見圖1。樹脂的預(yù)處理稱取不同型號(hào)的大孔吸附樹脂，加入95%的乙醇50ml浸泡超過24h，濕法裝柱后，先用95%的乙醇洗滌樹脂至流出液加水（1:4）不呈白色渾濁為止，再用蒸餾水洗至水液澄清無醇味。實(shí)施例1黨參粗提物的制備將黨參與95%乙醇按照重量比1：5混合，升溫至回流提取2h，結(jié)束后過濾，濾液減壓濃縮至干，固體物為黨參粗提物，可加水制備得到不同濃度的提取物溶液。實(shí)施例2大孔吸附樹脂類型的選擇實(shí)施例1中的黨參粗提物與水按照重量/體積比0.125g/mL制備得到提取物溶液。稱取已處理好的D101、HPD-100、H103、DM130、S-85種大孔樹脂1.00g，置具塞錐形瓶中，各精密加入提取物溶液30mL，置于搖床上振搖24h，取出，抽濾，濾液經(jīng)處理后進(jìn)行含量測(cè)定。樹脂再精密加入95%乙醇溶液50mL，于搖床上振搖24h取出，抽濾，濾液作為解吸液經(jīng)處理后進(jìn)行含量測(cè)定，根據(jù)公式計(jì)算蒼術(shù)內(nèi)酯I的吸附量、解吸量、解吸率和干固量。大孔樹脂吸附量、吸附率、解吸附量、解吸附率的計(jì)算公式如下：吸附量＝（C0－Ce）×V（1）吸附率＝［（C0－Ce）/C0］×100％（2）解吸量＝V1×C1（3）解吸率＝［V1C1/（C0－Ce）V］×100％（4）吸附量（mg/干樹脂g）＝（C0－Ce）×V/M（5）干固體含量（蒼術(shù)內(nèi)酯I或者蒼術(shù)內(nèi)酯II）=解吸量/解吸液干固體重量C0為起始濃度；Ce為平衡時(shí)濃度；C1為解析液濃度；V為吸附液體積；V1為解吸液體積；M為干樹脂重。5種不同型號(hào)樹脂的各項(xiàng)指標(biāo)如表1所示，樹脂的吸附能力是由樹脂孔徑、比表面積、表面電性或形成氫鍵等綜合性所決定。大孔樹脂吸附有機(jī)物是有機(jī)物通過樹脂的孔徑擴(kuò)散到樹脂孔內(nèi)被吸附,因此孔徑大小直接影響吸附效果，同時(shí)巨大的比表面積大大增加了樹脂的吸性能。本項(xiàng)研究針對(duì)蒼術(shù)內(nèi)酯類化合物溶于乙醇，而不溶于水(能溶于熱水)的特點(diǎn)，將95%乙醇回流提取液濃縮至無醇味，加熱水使溶解,抽濾，濾液上大孔樹脂柱，這樣大大增加了大孔樹脂的吸附能力。通過吸附作用的比較，結(jié)果顯示樹脂HPD-100和DM130的吸附量和解吸量較好，再根據(jù)干固量的計(jì)算表明樹脂DM130純化出的黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯I的含量較高，所以選用大孔吸附樹脂DM130純化黨參的有效成分（表2）表1不同型號(hào)樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)表2不同型號(hào)樹脂吸附作用比較靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線的繪制精密稱取預(yù)處理好的大孔樹脂（DM130）1.00g，置具塞錐形瓶中，加入黨參粗提物與水按照重量/體積比0.125g/mL制備得到提取物溶液30mL，置搖床上振搖，然后按間隔時(shí)間0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及24h，每次吸取1mL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算吸附量。由圖2中的動(dòng)力學(xué)曲線可發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂DM130對(duì)黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯I的靜態(tài)吸附10h后即達(dá)平衡，故靜態(tài)吸附的最佳時(shí)間為10h。靜態(tài)吸附等溫曲線的繪制分別吸取黨參粗提物與水按照重量/體積比0.125g/mL制備得到提取物溶液10、20、25、28、30、35、40mL定容至25mL，加入已處理好的樹脂（DM130）1.00g中，于恒溫水浴振蕩器中25℃、30℃、35℃振搖12h測(cè)其吸附量，繪制等溫曲線。由圖3可知靜態(tài)吸附黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯I的最適溫度為30℃。實(shí)施例3動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)上樣液濃度考察分別將黨參粗提物與水按照重量/體積比0.25g/mL、0.125g/mL、0.0625g/mL制備得到提取物溶液。量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.00g三份濕法裝柱，將不同濃度、相同體積的提取物溶液400mL以相同流速（3mL/min）通過大孔吸附樹脂色譜柱，計(jì)算吸附量，確定最佳動(dòng)態(tài)吸附濃度。結(jié)果：藥液濃度：0.25g/mL，吸附量：0.0145mg/g；藥液濃度：0.125g/mL，吸附量：0.0215mg/g；藥液濃度：0.0625g/mL，吸附量：0.0062mg/g。結(jié)果顯示蒼術(shù)內(nèi)酯I的吸附量隨著上樣液濃度的增加而增大，但相差不大。故選擇0.125g/mL為最佳上樣濃度。上樣液流速考察量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g三份濕法裝柱，將相同濃度0.125g/mL、相同體積400mL的供試品上樣液，以不同流速(3mL/min、6mL/min、8mL/min）通過大孔吸附樹脂層析柱，計(jì)算吸附量，確定動(dòng)態(tài)吸附上柱液的最佳流速。結(jié)果：流速：3mL/min，吸附量:0.01931mg/g；流速：6mL/min，吸附量:0.01815mg/g；流速：8mL/min，吸附量:0.01059mg/g。結(jié)果顯示隨著上柱液流速的增加，蒼術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)內(nèi)酯II的吸附量減小。說明流速增加使擴(kuò)散時(shí)間減小，泄漏加快，吸附率降低。從生產(chǎn)周期以及經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，選擇6mL/min為最佳動(dòng)態(tài)吸附上柱液流速。泄漏曲線的測(cè)定量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g濕法裝柱，將0.125g/mL供試品溶液上樣,6mL/min流速通過大孔吸附樹脂色譜柱。流出液每40mL接一份，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制蒼術(shù)內(nèi)酯I的泄露曲線。由圖4可知大孔樹脂（DM130）對(duì)蒼術(shù)內(nèi)酯I的吸附收集液至400mL時(shí)達(dá)到吸附平衡，故最大上樣液體積為400mL。不同洗脫溶劑考察量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g濕法裝柱，將0.125g/mL濃度的供試品上樣液，以6mL/min通過大孔吸附樹脂層析柱，上樣液體積為400mL。對(duì)吸附飽和的大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗至無糖，再分別用95%、70%、50%、30%乙醇200mL作洗脫劑，以相同流速(6mL/min）通過大孔吸附樹脂層析柱。將洗脫液水浴蒸干用甲醇定容至25mL的容量瓶中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算解吸率、干固量，確定動(dòng)態(tài)解吸的最佳洗脫溶劑。由表3可得，根據(jù)計(jì)算所得的解吸率、解吸量顯示95%乙醇洗脫的蒼術(shù)內(nèi)酯純度較高，故選用95%乙醇做洗脫劑。表3乙醇洗脫濃度選擇洗脫溶劑解吸率(%)干固體含量(mg/g)95%91.80.121970%48.40.104350%6.30.020530%——不同洗脫流速考察量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g濕法裝柱，將0.125g/mL濃度的供試品上樣液，以6mL/min通過大孔吸附樹脂層析柱，上樣液體積為400mL。對(duì)已吸附飽和的大孔樹脂，先用蒸餾水洗至無糖，再用95%乙醇200mL以不同流速(2mL/min、3mL/min、4mL/min、6mL/min)洗脫，將洗脫液水浴蒸干用甲醇定容，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算解吸率，確定洗脫液的最佳流速。蒼術(shù)內(nèi)酯I的解吸率分別為：74.12%、83.74%、90.59%和83.15%，結(jié)果顯示洗脫流速為4mL/min時(shí)蒼術(shù)內(nèi)酯I的解吸率最大，故4mL/min為最佳洗脫流速。洗脫體積考察量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g濕法裝柱，將0.125g/mL濃度的供試品上樣液，以6mL/min通過大孔吸附樹脂層析柱，上樣液體積為400mL。對(duì)已吸附飽和的大孔樹脂，先用蒸餾水洗至無糖，再用95%乙醇200mL以流速4mL/min洗脫，將洗脫液每20mL接一份水浴蒸干用甲醇定容至5mL的容量瓶中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算解吸量，確定洗脫液的用量。由洗脫曲線（圖5和圖6）可知，用洗脫體積為30mL時(shí)解吸量最大，隨后減小，100mL以后保持平衡，說明已洗脫完全，故洗脫體積的最大用量為100mL。實(shí)施例4動(dòng)態(tài)吸附解吸驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，確定了DM130型大孔吸附樹脂純化黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)內(nèi)酯II的最優(yōu)工藝條件，驗(yàn)證試驗(yàn)如下：將實(shí)施例1中得到的提取物用水溶解制成重量/體積比0.125g/mL的提取物溶液，量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g濕法裝柱，取400mL，在30℃下將上樣流速為6mL/min；95%乙醇作洗脫劑，洗脫劑流速為4mL/min，洗脫體積的用量為100mL。在此條件下，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-解吸驗(yàn)證試驗(yàn)。純化前后的色譜圖見圖7-10。表4吸附解吸效果實(shí)施例5改進(jìn)的提取方式為了進(jìn)一步地提高樹脂的吸附、解吸量，發(fā)現(xiàn)通過采用反相C18硅膠柱進(jìn)行吸附和解吸操作之后，可以有效地去除影響DM130吸附解吸的物質(zhì)，能夠提高蒼術(shù)內(nèi)酯I、蒼術(shù)內(nèi)酯II的提取收率。在實(shí)施例4的基礎(chǔ)上，本實(shí)施例對(duì)上述工藝進(jìn)行了改進(jìn)：將實(shí)施例1中得到的提取物用水溶解制成重量/體積比0.125g/mL的提取物溶液，送入反相C18硅膠柱色譜分離，提取物溶液與C18反相硅膠重量比是2：1，先在35℃下用甲醇-水體積比為25∶75洗脫5BV后棄去洗脫液，再在40℃下用體積比為45∶65的甲醇-水體系洗脫5BV，收集洗脫液并減壓回收溶劑，即得純化后的提取物，再將純化后的提取物用水溶解制成重量/體積比0.125g/mL進(jìn)行上樣，量取已處理好的大孔樹脂（DM130）1.0g濕法裝柱，取400mL，在30℃下將上樣流速為6mL/min；95%乙醇作洗脫劑，洗脫劑流速為4mL/min，洗脫體積的用量為100mL。表5吸附解吸效果可以看出，通過以上實(shí)施例5通過對(duì)提取物溶液進(jìn)行了C18反相硅膠樹脂處理之后，可以有效地去除影響DM130吸附解吸的雜質(zhì)，提高吸附和解吸效果。當(dāng)前第1頁1 2 3