本發(fā)明涉及我國水稻重要害蟲褐飛虱的室內(nèi)RNAi人工飼養(yǎng)技術和定量評價其控制效果的方法。

背景技術：

褐飛虱Nilaparvata lugens屬半翅目，飛虱科，是一種季節(jié)性、遷飛性、r-對策、暴發(fā)性害蟲，在亞洲分布廣泛，南亞、東南亞、東亞、南太平洋島嶼及澳大利亞均有分布，西起巴基斯坦東至日本和東南亞的一些群島、密克羅尼西亞和巴布亞新幾內(nèi)亞也均有分布。褐飛虱為單食性害蟲，只能在水稻上和普通的野生稻上取食和繁殖后代。自20世紀60年代以來，由于水稻矮稈品種的推廣、大量使用N肥及其它栽培措施的改變、化學殺蟲劑的密集使用等因素，促使褐飛虱頻頻暴發(fā)成災，嚴重威脅著糧食生產(chǎn)安全。在水稻種植區(qū)，農(nóng)民普遍用各種殺蟲劑(有機磷類，氨基甲酸酯，新煙堿類化合物)防治褐飛虱種群，化學防治也是一直作為防治褐飛虱最有效途徑。長時間以來，為防治各種水稻害蟲多種殺蟲劑交替使用，導致靶標害蟲產(chǎn)生抗藥性和非靶標害蟲刺激生殖。褐飛虱是一種典型的殺蟲劑誘導型再猖獗型害蟲。因此，防治褐飛虱再猖獗的新方法和新途徑是目前十分迫切需要解的問題。

RNAi技術是通過降解靶基因的mRNA或mRNA的3’末端的非轉錄片段結合而阻止基因的表達使特異性基因發(fā)生沉默的一種高度保守基因調(diào)控機制。由于RNAi具有靶標特異性、高效性、持久性、快捷性等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于多種生物的基因功能的研究中。在害蟲防治領域，RNAi技術作來一種新型的害蟲防治策略近幾年已被人們逐漸接受，并在實驗室條件下成功應用于鱗翅目、鞘翅目、半翅目等害蟲。在RNAi研究中，合適的靶基因和適當?shù)膶敕椒ㄊ瞧涑晒Φ年P鍵。在昆蟲學研究中，現(xiàn)主要采用微量注射法(廣泛用于一些鱗翅目昆蟲)、飼喂法(體型較小的刺吸式口器昆蟲)和轉基因植物法?；谶@些原因，只要找到合適的PHF靶基因，然后利用RNAi技術就能夠很好的控制害蟲種群的增長。利用RNAi技術既不會使害蟲產(chǎn)生抗藥性，也不會刺激害蟲再猖獗，又能減少農(nóng)藥的使用和維護生態(tài)平衡，提高農(nóng)作物產(chǎn)品安全。此外，我們研究的主要區(qū)別在于從雄性不育角度研究對害蟲種群長的控制效果進行評價，并且通過這些重要的生殖參數(shù)指標可以作為評價控制褐飛虱種群增長的定量指標。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供褐飛虱室內(nèi)RNAi人工飼養(yǎng)技術和定量評價控制效果的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案是：

一種基于RNAi后雄性不育對褐飛虱種群控制效果的飼養(yǎng)和評價方法，利用RNAi技術控制雄蟲不育，然后再利用不育的雄蟲與雌蟲交配后檢測其雄蟲或雌蟲的生殖參數(shù)來定量評估褐飛虱種群增長的控制效果,飼養(yǎng)方法包括如下步驟：

(1)dsRNA引物設計：根據(jù)已知的NlPHF7基因(NLU00303)序列設計引物，采用引物設計軟件設計特異性物；對每條引物進行評價和修改，以避免在引物內(nèi)或引物間二聚體以及引物錯配位點的出現(xiàn)等，最終設計出dsPHF7雙鏈引物；

(2)褐飛虱雄蟲RNA的提取和cDNA合成：采用試劑盒提取褐飛虱雄蟲總RNA，然后合成cDNA；

(3)dsPHF7合成：采用試劑盒合成dsPHF7后，通過紫外吸收光譜法定量測定純化的dsPHF7濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測以確保其完整性；

(4)褐飛虱種群室內(nèi)RNAi的飼養(yǎng)：褐飛虱3齡若蟲用人工飼料進行飼養(yǎng)，用玻璃雙通管作為飼養(yǎng)室，兩側開口用Parafilm膜封住，加40μL含有濃度為0.05μg/mL的dsPHF7的液態(tài)人工飼料，再用Parafilm膜將飼料封住。

飼養(yǎng)方法步驟(4)中，每個玻璃雙通管釋放30頭褐飛虱若蟲；每兩天換一次新鮮的人工飼料。

飼養(yǎng)方法步驟(4)中，玻璃雙通管放置于生物培養(yǎng)箱，用黑色棉布包裹，利用昆蟲的趨光性使其到玻璃雙通管兩端，取食兩側封口膜間的飼料。

所述的基于RNAi后雄性不育對褐飛虱種群控制效果的飼養(yǎng)和評價方法：評價方法包括如下步驟：

(1)褐飛虱3齡若蟲RNAi飼養(yǎng)至5齡末期后，將其吸出放置于放有同樣分蘗期水稻莖桿的玻璃杯中，進行飼養(yǎng)至剛羽化成成蟲，然后將剛羽化的成蟲進行一雌一雄進行配對，放置新鮮分蘗期的水稻稻莖干進行產(chǎn)卵實驗；

(2)每隔2天換一次水稻莖干，然后在顯微鏡下解剖計算其每次的產(chǎn)卵量，在整個過程記錄雌蟲產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵期、壽命和產(chǎn)卵總數(shù)及雄蟲的壽命指標；每個處理組指標和對照組指標至少20個生物學重復；

(3)對羽化后1天、3天和5天的雄蟲進行生殖參數(shù)指標的測定，對交配后2天和3天的雌蟲進行生殖參數(shù)指標的測定，然后解剖雌、雄蟲內(nèi)生殖器系統(tǒng)，觀察其內(nèi)生殖系統(tǒng)是否畸形；

(4)處理組的雌雄蟲的生殖參數(shù)及雌蟲的產(chǎn)卵量與對照組相比，能夠準確的評價雄性不育對控制對褐飛虱種群的控制效果。

其中，羽化后1天、3天和5天的雄蟲的行生殖參數(shù)指標包括精氨酸和附腺蛋白含量；交配后2天和3天的雌蟲的生殖參數(shù)指標包括產(chǎn)卵量、脂肪體和卵巢內(nèi)蛋白質及Nlvg表達水平。

有益效果：

本發(fā)明提供了一種褐飛虱室內(nèi)RNAi人工飼養(yǎng)技術和褐飛虱種群定量評價控制效果的方法。在褐飛虱室內(nèi)RNAi人工飼養(yǎng)方面，主要目的是利用RNAi技術沉默雄蟲生殖基因NlPHF7，根據(jù)NlPHF7基因(NLU00303)設計特異性dsRNA雙鏈引物(引物如表1所示)，再利用T7 RiboMax RNAi System(Progema,Madism,WI,USA)合成純化的dsRNA雙鏈(圖1)，純化的dsPHF7雙鏈(終濃度為0.05μg/mL)后加入人工飼料中，然后將褐飛虱3齡若蟲進行RNAi室內(nèi)飼養(yǎng)。

褐飛虱種群定量評價其控制效果的方法，主要在于RNAi技術沉默褐飛虱雄蟲目標基因后，待褐飛虱剛羽化成蟲后，雌、雄成蟲分別交配或單獨飼養(yǎng)，然后測定雌、雄蟲生殖參數(shù)，通過處理組與對照組雄蟲的附腺蛋白含量和精氨酸含量、雌蟲的產(chǎn)卵量和Nlvg基因的表達倍數(shù)等生殖參數(shù)比較，能夠很好的評價雄性不育對褐飛虱的控制效果，并且這些重要生殖參數(shù)可以作為褐飛虱種群增長與否的衡量指標，為褐飛虱的防治提供了新途徑和新方法。

附圖說明

圖1：發(fā)明利用NlPHF7基因設計特異性引物合成dsPHF7電泳檢測圖譜。(圖中：1.正義ssRNA；2.反義ssRNA；3.雙鏈dsPHF7)。

圖2：利用本發(fā)明合成純化的褐飛虱dsPHF7室內(nèi)RNAi飼養(yǎng)及雌雄蟲交配流程圖。(圖中：A.褐飛虱RNAi室內(nèi)飼養(yǎng)及種群控制效果示意圖；B.褐飛虱RNAi室內(nèi)飼養(yǎng)；C.褐飛虱取食dsRAN+人工飼料；D.剛羽化的雌雄蟲交配；E.單雄單雌交配)。

圖3：利用本發(fā)RNAi飼喂的雄蟲與雌蟲交配后的雌雄蟲內(nèi)生殖器比較圖。(圖中：A.雌蟲卵巢(對照)；B.dsGFP處理的雌蟲卵巢(陰性對照)；C.dsNlPHF7處理的雌蟲卵巢；D.雄蟲內(nèi)生殖器(對照)；E.dsGFP處理雄蟲內(nèi)生殖器(陰性對照)；F.dsNlPHF7處理的雄蟲內(nèi)生殖器)。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

1.dsRNA引物設計

根據(jù)已知的NlPHF7基因(NlU00303)序列設計引物。根據(jù)引物設計原則及注意事項，盡量在特異區(qū)域進行引物的設計，使用Primer primer 5.0、Oligo 6.71和Primer 3.0online引物設計軟件設計特異性物，再用Oligo 6.71引物設計軟件對每條引物進行評價和修改，以避免在引物內(nèi)或引物間二聚體以及引物錯配位點的出現(xiàn)等，最終設計出dsPHF7雙鏈引物(表1)

2.褐飛虱雄蟲RNA的提取和cDNA合成

本實驗采用美國Progega公司SV total isolation system Kit(Promega,Corporation,Madison,WI,USA)試劑盒提取褐飛虱雄蟲總RNA。該方法操作簡單、快速、高效且無毒，提取的RNA符合本研究要求，具體步驟如下：

1)將5頭羽化后2天的褐飛虱雄蟲置于1.5mL離心管中，加入175μL RNA Lysis到離心管中研磨勻漿，加入350μL的RNA Dilution Buffer(藍色)，顛倒3-4次混合。70℃水浴3min；

2)12,000×g離心10min，上清液移至新的1.5mL離心管中；

3)加入95％乙醇200μL，用移液槍混勻3-4次，轉移至離心柱裝配體中，12，000×g離心1min；

4)棄去收集管中的液體，回收收集管，加入600μL RNA Wash Solution,12,000×g離心1min；

5)棄去收集管中的液體，向離心柱內(nèi)膜加入40μL Yellow Core Buffer和5μL 0.09M Mncl₂及5μL DNase I的孵育混合物(現(xiàn)配)；

6)室溫(25℃)環(huán)境下孵育15min，然后加入200μL DNAase Stop Solution,12,000×g離心1min；

7)然后直接加入600μL RNA Wash Solution,12,000×g離心1min；

8)棄去液體，向離心柱內(nèi)加250μL RNA Wash Solution,12,000×g離心2min；

9)將離心柱移至到洗脫管上進行洗脫，向柱中央加入40μL Nuclease-free water,覆于膜表面，靜置1min后，12，000×g離心1min，使用前放置-80℃保存。

根據(jù)第一鏈cDNA試劑盒PrimeScript^TM 1^st stand cDNA synthesis Kit(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd)合成cDNA。

3.dsPHF7合成

雙鏈dsPHF7合成是根據(jù)T7 RiboMAX^TM Express RNAi System(Progema Corporation,Madison,WI,USA)試劑盒。具體步驟如下：

1)正義ssRNA(單鏈)合成，反應體系如下：

2)反義ssRNA(單鏈)合成，反應體系如下

PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性40S，55℃(Tm)退火40S，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

根據(jù)PCR反應條件合成的ssRNA進一步合成dsRNA

上述試劑混勻后37℃水浴4h。然后分別將上述合成的正義鏈ssRNA和反義ssRNA各20μL混合后進行退火反應，70℃孵育10min，然后冷卻至室溫約20min，總反應體積為40μL。再加放2μL didution RNAase A solution(1:200)和2μL RNase-free DNase加入到轉錄反應混合液的離心管中，37℃水浴30min，再加放110μL 95％乙醇和4.4μL 3M醋酸鈉(pH5.2)，12,000×g離心1min，再用用0.5mL 70％乙醇洗滌沉淀，然后室溫干燥，用50μL Nuclear-free water溶解。紫外吸收光譜法定量測定純化的dsPHF7(260nm)濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測以確保其完整性。

4.褐飛虱種群室內(nèi)RNAi的飼養(yǎng)

褐飛虱3齡若蟲用人工飼料進行飼養(yǎng)，用玻璃雙通管(15×2.5cm)作為飼養(yǎng)室，兩側開口用Parafilm膜封住加含有dsPHF7(設計dsRNA，最終濃度為0.05ng/mL)的液態(tài)人工飼料(40μL)，再用一層Parafilm膜將飼料封住。每個玻璃雙通管釋放30頭褐飛虱若蟲。玻璃管放置于生物培養(yǎng)箱(浙江寧波江南儀器有限公司)(溫度：26±2℃；濕度為75-80％；光照為16L:8D)，用黑色棉布包裹(圖2)，利用昆蟲的趨光性使其到玻璃管兩端，取食兩側封口膜間的飼料。每兩天換一次新鮮的人工飼料。

5.褐飛虱種群增長控制效果的定量評價方法

褐飛虱3齡若蟲RNAi飼養(yǎng)至5齡末期(大約8～10天)后，將其吸出放置于放有同樣分蘗期水稻莖桿的玻璃杯(高12cm，口徑10cm)中進行飼養(yǎng)至剛羽化成成蟲，然后將剛羽化的成蟲進行一雌一雄進行配對放置新鮮分蘗期的水稻稻莖干進行產(chǎn)卵實驗。每隔2天換一次水稻莖干，然后在顯微鏡下解剖計算其每次的產(chǎn)卵量，整個過程可以記錄雌蟲產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵期、壽命和產(chǎn)卵總數(shù)及雄蟲的壽命等指標。每個處理和對照至少20個生物學重復。對羽化后1天、3天和5天的雄蟲進行生殖參數(shù)指標(精氨酸和附腺蛋白含量)的測定，交配后2天和3天的雌蟲進行生殖參數(shù)指標(產(chǎn)卵量、脂肪體和卵巢內(nèi)蛋白質及Nlvg表達水平)的測定，然后解剖雌、雄蟲內(nèi)生殖器系統(tǒng)，觀察其內(nèi)生殖系統(tǒng)是否畸形(圖3)。處理組的雌雄蟲的生殖參數(shù)及雌蟲的產(chǎn)卵量與對照相比，能夠準確的評價雄性不育對控制對褐飛虱種群的控制效果。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內(nèi)，依據(jù)本發(fā)明的技術實質，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍之內(nèi)。