本發(fā)明涉及一種泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，屬于微生物生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
泰樂(lè)菌素(Tylosin)又稱泰樂(lè)星、泰勒霉素，是一種16元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它是一種禽、畜專用的高效無(wú)殘留的抗菌促生劑，廣泛應(yīng)用于飼料、獸藥添加劑。泰勒菌素工業(yè)生產(chǎn)菌為弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)。泰樂(lè)菌素主要是由泰樂(lè)菌素A、脫碳霉糖泰樂(lè)菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四種組分組成，其中A組分具有最強(qiáng)的生物活性。泰勒菌素生物合成過(guò)程十分復(fù)雜，具體明確的生物合成途徑尚未闡明。通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，改造泰樂(lè)菌素的生物合成基因簇仍在不斷探索之中?；诳股剡z傳背景的分子育種手段過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)用大，成功率低。對(duì)于泰樂(lè)菌素的工業(yè)化生產(chǎn)，出發(fā)菌株必須滿足一定的優(yōu)良特性。經(jīng)典誘變使用理化方法誘導(dǎo)DNA突變，方法簡(jiǎn)單，適用范圍廣。高通量篩選技術(shù)結(jié)合經(jīng)典誘變簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，提高了篩選效率。
目前的泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株，一般是采用搖瓶發(fā)酵后用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)方法繁瑣等缺陷。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株的高效篩選方法。本發(fā)明方法結(jié)合了常壓室溫等離子體(ARTP)、酶標(biāo)儀檢測(cè)和高通量篩選技術(shù)，提高泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株的篩選效率。
所述出發(fā)菌株齊魯制藥(內(nèi)蒙古)有限公司提供。
本發(fā)明的泰樂(lè)菌素高產(chǎn)菌株的高效篩選方法，主要包括步驟如下：
(1)將待篩選的弗氏鏈霉菌菌懸液涂布在固體平板培養(yǎng)基上，待孢子成熟后挑選接種于裝有種子培養(yǎng)液的96淺孔板中培養(yǎng)；
(2)將96淺孔板中得到的種子液平行轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的48孔板中發(fā)酵培養(yǎng)；
(3)發(fā)酵結(jié)束后，離心取菌體，吸取上清液用0.1mol/LHCl稀釋至泰樂(lè)菌素濃度為0～330μg/mL，然后取稀釋液200μL稀釋液于96酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀測(cè)定OD290值，根據(jù)y＝0.0116x+0.0414(其中，x為泰樂(lè)菌素濃度(μg/mL)，y為OD290nm)計(jì)算得到泰樂(lè)菌素濃度，進(jìn)而根據(jù)稀釋倍數(shù)換算得到發(fā)酵液的泰樂(lè)菌素濃度，即得到產(chǎn)泰樂(lè)菌素相對(duì)較高的菌株。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的固體平板培養(yǎng)基上的培養(yǎng)是在30℃培養(yǎng)4d。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的固體平板培養(yǎng)基配方(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白胨1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，瓊脂20g，pH調(diào)節(jié)至7.2。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的種子培養(yǎng)液(g/L)：豆餅粉5g，酵母粉5g，玉米漿6g，輕質(zhì)CaCO33g，豆油4mL，pH調(diào)節(jié)至7.18。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的96淺孔板中培養(yǎng)是在750r/min、30℃搖床培養(yǎng)2d。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)液(g/L)：魚(yú)粉10.5g，玉米粉17g，玉米淀粉10.5g，甜菜堿0.37g，NaCl 0.1g，KCl 0.9g，(NH4)2HPO 4g，NiSO43g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO31.9g。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)是將種子液以10％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至48孔板中，于750r/min、30℃發(fā)酵培養(yǎng)6d。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)的離心是在4000r/min離心15min。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述待篩選的弗氏鏈霉菌菌懸液，是將弗氏鏈霉菌進(jìn)行誘變后得到的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述誘變，可以是物理誘變或者化學(xué)誘變，比如常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外誘變、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、硫酸二乙酯(DES)誘變等等。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)96淺孔板中種子培養(yǎng)液添加量為200μL/孔。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)48孔板中發(fā)酵培養(yǎng)液的添加量為900μL/孔。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明建立了一種新型的高通量篩選的方法。本發(fā)明方法有效提高了孢子生長(zhǎng)速度，有效提高了后續(xù)篩選效率。同時(shí)，本發(fā)明通過(guò)對(duì)進(jìn)行優(yōu)化，得到了線性關(guān)系好的檢測(cè)方法，有效提高了篩選的效率和準(zhǔn)確性，防止了提取效果不佳導(dǎo)致的篩選準(zhǔn)確性不足的問(wèn)題。
附圖說(shuō)明：
圖1：泰樂(lè)菌素濃度與OD的關(guān)系曲線。
具體實(shí)施方式
泰樂(lè)菌素的測(cè)定：高效液相色譜(HPLC)
儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(配紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和工作站)，色譜條件：
色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18
流動(dòng)相：16.8％高氯酸鈉(用HCL調(diào)節(jié)pH至2.5)+40％乙腈+43.2％去離子水
流速：1.0mL/min
柱溫：35℃
進(jìn)樣量：10μL
紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：290nm(檢測(cè)泰樂(lè)菌素)
樣品制備：取一定量的發(fā)酵液，用20％的Al2(SO4)3調(diào)節(jié)pH至4.01～4.10，用濾紙過(guò)濾得濾液，濾液經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屘幚砗徒?jīng)0.22μL濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行高效液相色譜分析。
致死率的計(jì)算：
其中A表示空白對(duì)照平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)，B表示經(jīng)過(guò)誘變處理后平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)。
所需培養(yǎng)基：
平板培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白胨1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O1g，瓊脂20g，pH調(diào)節(jié)至7.2。
種子培養(yǎng)基(g/L)：豆餅粉5g，酵母粉5g，玉米漿6g，輕質(zhì)CaCO33g，豆油4mL，pH調(diào)節(jié)至7.18。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：魚(yú)粉10.5g，玉米粉17g，玉米淀粉10.5g，甜菜堿0.37g，NaCl 0.1g，KCl 0.9g，(NH4)2HPO 4g，NiSO43g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO31.9g。
實(shí)施例1：ARTP誘變
出發(fā)菌株斜面菌種在29℃培養(yǎng)6天，刮取適量孢子于裝有2mL無(wú)菌生理鹽水試管中，振蕩器振勻制成菌懸液后無(wú)菌濾紙過(guò)濾。吸取10μL合適濃度的菌懸液均勻涂布于無(wú)菌的載片表面，將載片置于載臺(tái)上，用ARTP誘變儀進(jìn)行誘變。條件：入射功率為100W、氦氣流量為10SLM、分別照射0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s，樣品處理完畢，用無(wú)菌鑷子將載片放至裝有1mL生理鹽水的EP管中振蕩洗脫后梯度稀釋。分別吸取100μL稀釋后的菌懸液涂布固體平板上(每組做3組平行)。29℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，孢子成熟。計(jì)數(shù)每塊平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)，再計(jì)算出每個(gè)誘變處理時(shí)間的致死率，進(jìn)而得到在入射功率為100W，氦氣流量為10SLM條件下的致死曲線。
實(shí)施例2：酶標(biāo)儀檢測(cè)
根據(jù)泰勒菌素在290nm處有最大光吸收這一特點(diǎn)，選擇酶標(biāo)儀檢測(cè)泰樂(lè)菌素OD值作為初篩方法。配置一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝0.0116x+0.0414，R2＝0.9998。x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)，y為OD290nm，標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為0～330μg/mL。裝有培養(yǎng)液48孔板4000r/min離心15min，取上清用0.1mol/L HCl稀釋一定倍數(shù)，取200μL稀釋液于96酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定290nm可見(jiàn)光下的吸光值OD。
實(shí)施例3：高產(chǎn)菌株的篩選
將ARTP誘變或其他誘變技術(shù)處理不同時(shí)間后的菌懸液稀釋成合適的濃度，吸取100μL的菌懸液均勻涂布在平板上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，利用QPix 420儀器或類似菌落挑選設(shè)備或手工挑取平板上誘變單菌落于96淺孔板(裝有種子培養(yǎng)液200μL)中，在750r/min，30℃的孔板搖床上培養(yǎng)2d。以10％(v/v)的接種量，將96孔板中的種子液平行轉(zhuǎn)接至48孔板(裝有發(fā)酵培養(yǎng)液900μL)中，750r/min，30℃發(fā)酵培養(yǎng)6d。剩余96孔板中的種子液用40％甘油保存于4℃冰箱。
發(fā)酵結(jié)束后，離心取菌體，吸取上清液用0.1mol/L HCl稀釋至泰樂(lè)菌素濃度為0～330μg/mL，然后取稀釋液200μL稀釋液于96酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀測(cè)定OD290值，根據(jù)y＝0.0116x+0.0414(其中，x為泰樂(lè)菌素濃度(μg/mL)，y為OD290nm)計(jì)算得到泰樂(lè)菌素濃度，進(jìn)而根據(jù)稀釋倍數(shù)換算得到發(fā)酵液的泰樂(lè)菌素濃度，即得到產(chǎn)泰樂(lè)菌素相對(duì)較高的菌株。
實(shí)施例4：篩選方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證
將實(shí)施例3的待篩選菌株采用搖瓶培養(yǎng)并用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)施例4方法得到的結(jié)果，與搖瓶+HPLC方法得到的結(jié)果一一對(duì)應(yīng)，即實(shí)施例4得到的產(chǎn)泰樂(lè)菌素相對(duì)較高的菌株也是搖瓶+HPLC方法得到的相對(duì)較高的菌株。說(shuō)明，實(shí)施例4的方法準(zhǔn)確性好、可靠性強(qiáng)。
另外，利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察篩選方法的重復(fù)性以及準(zhǔn)確度。依據(jù)酶標(biāo)儀顯色法的RSD應(yīng)該控制在2.0％以下。利用單菌落出發(fā)菌株高通量初篩方法重復(fù)6次平行試驗(yàn)，得到，RSD＝0.144％，重復(fù)性良好。
此外，發(fā)明人還研究了提取條件對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的方法，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)有效準(zhǔn)確檢測(cè)泰樂(lè)菌素產(chǎn)量。發(fā)明人嘗試了其他添加種類的稀釋劑，結(jié)果稀釋劑不當(dāng)會(huì)使泰樂(lè)菌素濃度與OD290nm的線性關(guān)系受到影響，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果而最終導(dǎo)致部分高產(chǎn)菌株被篩選剔除。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。