本發(fā)明涉及一種篩選高產(chǎn)量金霉素誘變菌株的方法，屬于微生物生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

金霉素(Chorotetracycline，即CTC)屬于四環(huán)素類的一種廣譜抗生素。金霉素能夠抑菌、促生長(zhǎng)、飼料利用率高、在肌體內(nèi)殘留量低。其生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，生產(chǎn)成本也較低，成為目前飼料工業(yè)中用量最大的抑菌促生長(zhǎng)劑。目前國(guó)內(nèi)工廠金霉素的產(chǎn)率還較低(效價(jià)在18000μg/mL左右)，因此提高金霉素的產(chǎn)率很有必要。金霉素是由金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)發(fā)酵得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量合成性狀受多基因決定，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。影響金霉素發(fā)酵過(guò)程的因素也很多，如種子的質(zhì)量、培養(yǎng)基的組成、工藝條件以及發(fā)酵過(guò)程的代謝控制等。目前微生物育種技術(shù)已經(jīng)從誘變、推理、重組技術(shù)發(fā)展到代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)和異源生物合成等方法。但傳統(tǒng)誘變育種仍具有諸多優(yōu)勢(shì)。如不需要知道生物遺傳背景、代謝模型，只需要獲得有效突變庫(kù)和定向篩選。高通量篩選與常規(guī)誘變結(jié)合，適用于以提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量為目標(biāo)的工業(yè)生產(chǎn)菌株選育，盡可能減少漏篩現(xiàn)象。

現(xiàn)有的金霉素菌株的篩選，一般是采用搖瓶發(fā)酵后用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)方法繁瑣等缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種金霉素高產(chǎn)菌株的高效篩選方法。本發(fā)明方法結(jié)合了常壓室溫等離子體(ARTP)、酶標(biāo)儀檢測(cè)和高通量篩選技術(shù)，提高金霉素高產(chǎn)菌株的篩選效率。

所述出發(fā)菌株金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)是由齊魯制藥(內(nèi)蒙古)有限公司提供的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

本發(fā)明的金霉素高產(chǎn)菌株的高效篩選方法，主要包括步驟如下：

(1)將待篩選的金色鏈霉菌菌懸液涂布在固體平板培養(yǎng)基上，待孢子成熟后挑選接種于裝有種子培養(yǎng)液的96淺孔板中培養(yǎng)；

(2)將96淺孔板中得到的種子液平行轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的48孔板中發(fā)酵培養(yǎng)；

(3)發(fā)酵結(jié)束后，離心取菌體，吸取上清液稀釋至金霉素濃度為0～20mg/L，然后取稀釋液100μL添加到提前加入40μL Tris-HCl緩沖溶液和60μL Sm(NO)₃溶液的96孔板中，震蕩混勻，8min后顯色完全，酶標(biāo)儀測(cè)定各濃度的OD₄₀₅值，根據(jù)y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905(其中，x為金霉素濃度濃度(μg/mL)，y為OD₄₀₅nm)計(jì)算得到金霉素濃度，進(jìn)而根據(jù)稀釋倍數(shù)換算得到發(fā)酵液的金霉素濃度，即得到產(chǎn)金霉素相對(duì)較高的菌株。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的固體平板培養(yǎng)基上的培養(yǎng)是在34℃培養(yǎng)4d。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的固體平板培養(yǎng)基配方(g/L)：蔗糖20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH₂PO₄0.8g，瓊脂18g。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的種子培養(yǎng)液(g/L)：蔗糖30g，進(jìn)口酵母粉5g，MgSO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄3g，NaCl 4g，KH₂PO₄1g，CaCO₃0.2g。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)的96淺孔板中培養(yǎng)是在750r/min、30～32℃搖床培養(yǎng)23～25h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)液(g/L)：蔗糖30g，MgSO₄0.5g，CaCO₃0.33g，檸檬酸2.55g，(NH₄)₂SO₄3g，1mL混合液(0.3％CuSO₄·5H₂O、0.5％ZnSO₄·7H₂O、0.25％MnSO₄`4H₂O)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)是將種子液以8％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至48孔板中，于750r/min、30～31℃發(fā)酵培養(yǎng)96～110h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)的離心是在4000r/min離心15min。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述待篩選的金色鏈霉菌菌懸液，是將金色鏈霉菌進(jìn)行誘變后得到的。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述誘變，可以是物理誘變或者化學(xué)誘變，比如常壓室溫等離子體(ARTP)誘變、紫外誘變、甲基磺酸乙酯(EMS)誘變、亞硝基胍(NTG)誘變、硫酸二乙酯(DES)誘變等等。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(1)96淺孔板中種子培養(yǎng)液添加量為180μL/孔。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)48孔板中發(fā)酵培養(yǎng)液的添加量為1000μL/孔。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Tris-HCl緩沖溶液的pH為6.7，Sm(NO)₃溶液的濃度為5×10^-4mol/L。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明建立了一種新型的結(jié)合了金霉素顯色反應(yīng)和高通量篩選的方法。本發(fā)明研究了金霉素5種能夠生長(zhǎng)并可以檢測(cè)到金霉素的平板培養(yǎng)基的生長(zhǎng)和產(chǎn)抗量情況，得到了最佳平板培養(yǎng)及配方，有效提高了孢子生長(zhǎng)速度，有效提高了后續(xù)篩選效率。同時(shí)，本發(fā)明通過(guò)對(duì)顯色反應(yīng)試劑等進(jìn)行優(yōu)化，得到了線性關(guān)系好的檢測(cè)方法，有效提高了篩選的效率和準(zhǔn)確性，防止了提取效果不佳導(dǎo)致的篩選準(zhǔn)確性不足的問(wèn)題。

具體實(shí)施方式

金霉素的測(cè)定：高效液相色譜(HPLC)

儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(配紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和工作站)，色譜條件：

色譜柱：ZORBAX LEclipse Lus Plus C18

流動(dòng)相：28％N-N二甲基甲酰胺+2％2mol/LH₃PO₄+70％去離子水

流速：1mL/min

柱溫：35℃

進(jìn)樣量：10μL

紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：365nm(檢測(cè)金霉素)

樣品制備：稱取發(fā)酵液1g于試管中，用0.01mol/LHCl定容至50mL，超聲5min，0.22μL無(wú)機(jī)系濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行高效液相色譜分析。

致死率的計(jì)算：

其中A表示空白對(duì)照平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)，B表示經(jīng)過(guò)誘變處理后平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)。

培養(yǎng)基：

固體平板培養(yǎng)基1號(hào)(g/L)：蔗糖20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH₂PO₄0.8g，瓊脂18g。

固體平板培養(yǎng)基2號(hào)(g/L)：可溶性淀粉20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH₂PO₄0.8g，瓊脂18g。

固體平板培養(yǎng)基3號(hào)(g/L)：葡萄糖20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH₂PO₄0.8g，瓊脂18g。

固體平板培養(yǎng)基4號(hào)(g/L)：甘油20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH₂PO₄0.8g，瓊脂18g。

固體平板培養(yǎng)基5號(hào)(g/L)：面粉20g，進(jìn)口酵母粉0.5g，KH₂PO₄0.8g，瓊脂18g。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30g，進(jìn)口酵母粉5g，MgSO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄3g，NaCl 4g，KH₂PO₄1g，CaCO₃0.2g。

孔板發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30g，MgSO₄0.5g，CaCO₃0.33g，檸檬酸2.55g，(NH₄)₂SO₄3g，1mL混合液(0.3％CuSO₄·5H₂O、0.5％ZnSO₄·7H₂O、0.25％MnSO₄`4H₂O)。

實(shí)施例1：最佳平板培養(yǎng)基選擇

配制五中不同配方的斜平板培養(yǎng)基，將稀釋后的無(wú)菌金色鏈霉菌菌懸液涂布于固體斜面培養(yǎng)基上。觀察金色鏈霉菌在平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，并檢測(cè)其產(chǎn)抗量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)固體平板培養(yǎng)基1號(hào)上菌株能快速生長(zhǎng)，孢子生長(zhǎng)良好，而且平板培養(yǎng)基顏色不會(huì)對(duì)后續(xù)單克隆挑選儀挑菌造成干擾。其他培養(yǎng)基，要么菌株生長(zhǎng)較慢，要么平板培養(yǎng)基顏色對(duì)于后續(xù)單克隆挑選儀挑菌造成干擾。

實(shí)施例2：ARTP誘變

出發(fā)菌株斜面菌種在34℃培養(yǎng)4-6d，刮取適量孢子于帶玻璃珠的裝有2mL生理鹽水的試管中打散，取10μL于已經(jīng)滅菌的特制載片上，放到ARTP誘變儀的載物臺(tái)上，調(diào)整功率10-100w，分別照射0、10、20、30、40、50、60s，將照射后的載片用鑷子夾取到裝有生理鹽水的EP管中，在震蕩器上充分震蕩后，梯度稀釋。吸取100μL稀釋液均勻涂布于平板上。34℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后，計(jì)數(shù)每塊平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)，再計(jì)算出每個(gè)誘變處理時(shí)間的致死率。在入射功率為10-100W，氦氣流量為1-10SLM條件下，0-25s照射時(shí)間作為最佳的誘變處理時(shí)間，致死率為80％-100％左右，有利于正突變株的產(chǎn)生。

實(shí)施例3：金霉素顯色反應(yīng)

根據(jù)金霉素與釤離子的顯色反應(yīng)作為初篩方法。金霉素與釤離子在近中性條件下形成淺黃色配合物，在405nm處有最大光吸收。考慮發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)基中含帶有顏色的原料對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。用生產(chǎn)發(fā)酵液配方，同時(shí)在孔板中培養(yǎng)與未培養(yǎng)菌體。結(jié)果表明，未培養(yǎng)菌體發(fā)酵液也有一定的OD值，說(shuō)明發(fā)酵液本身的顏色對(duì)OD值得測(cè)定確實(shí)存在影響，但培養(yǎng)菌體的發(fā)酵液OD值大于未培養(yǎng)菌體的發(fā)酵液，因此發(fā)酵液本身顏色對(duì)篩選金霉素高產(chǎn)菌株影響小。配置濃度在0.5～20mg/L的金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次吸取40μL Tris-HCl緩沖溶液，60μL Sm(NO)3溶液，100μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液震蕩混勻，8min后顯色完全，酶標(biāo)儀測(cè)定各濃度的OD₄₀₅值。確定OD₄₀₅與金霉素濃度C(mg/L)的回歸方程：y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905，其中x為樣品濃度(μg/mL)，y為OD₄₀₅nm，標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為0～20mg/L。

實(shí)施例4：高產(chǎn)菌株的篩選

將ARTP誘變處理后的菌懸液稀釋成合適的濃度，吸取100μL的菌懸液均勻涂布在平板上，于34℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，利用QPix 420儀器或類似菌落挑選設(shè)備或手工挑取平板上誘變單菌落于96淺孔板(裝有種子培養(yǎng)液180μL)中，在750r/min、31℃的孔板搖床上培養(yǎng)24h。以8％(v/v)的接種量，將96孔板中的種子液平行轉(zhuǎn)接至48孔板(裝有發(fā)酵培養(yǎng)液1000μL)中，750r/min，30℃發(fā)酵培養(yǎng)96h。剩余96孔板中的種子液用40％甘油保存于4℃冰箱。

發(fā)酵結(jié)束后，離心取菌體，吸取上清液稀釋至金霉素濃度為0～20mg/L，然后取稀釋液100μL添加到提前加入40μL Tris-HCl緩沖溶液(pH為6.7)和60μL Sm(NO)₃溶液(濃度為5×10^-4mol/L)的96孔板中，震蕩混勻，8min后顯色完全，酶標(biāo)儀測(cè)定各濃度的OD₄₀₅值，根據(jù)y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905(其中，x為金霉素濃度濃度(μg/mL)，y為OD₄₀₅nm)計(jì)算得到金霉素濃度，進(jìn)而根據(jù)稀釋倍數(shù)換算得到發(fā)酵液的金霉素濃度，即得到產(chǎn)金霉素相對(duì)較高的菌株。

實(shí)施例5：篩選方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

將實(shí)施例4的待篩選菌株采用搖瓶培養(yǎng)并用HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)施例4方法得到的結(jié)果，與搖瓶+HPLC方法得到的結(jié)果一一對(duì)應(yīng)，即實(shí)施例4得到的產(chǎn)金霉素相對(duì)較高的菌株也是搖瓶+HPLC方法得到的相對(duì)較高的菌株。說(shuō)明，實(shí)施例4的方法準(zhǔn)確性好、可靠性強(qiáng)。

另外，利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察初篩方法的重復(fù)性以及準(zhǔn)確度。依據(jù)酶標(biāo)儀顯色法的RSD應(yīng)該控制在2.0％以下。利用單菌落出發(fā)菌株高通量初篩方法重復(fù)6次平行試驗(yàn)，得到OD405＝0.07±0.0022，RSD＝0.144％，重復(fù)性良好。驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度：用酶標(biāo)儀檢測(cè)方法檢測(cè)濃度為5、10、15g/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度檢測(cè)兩次，RSD分別為0.035％、0.0322％、0.057％，準(zhǔn)確度良好。

此外，發(fā)明人還研究了提取條件對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的方法，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)有效準(zhǔn)確檢測(cè)金霉素產(chǎn)量。發(fā)明人嘗試了其他添加比例的發(fā)酵液、Tris-HCl緩沖溶液、Sm(NO)₃溶液，結(jié)果顯示不恰當(dāng)?shù)谋壤龝?huì)使金霉素濃度與OD_405nm的線性關(guān)系受到影響，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果而最終導(dǎo)致部分高產(chǎn)菌株被篩選剔除；也曾嘗試采用延長(zhǎng)或者明顯縮短顯色時(shí)間等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)會(huì)對(duì)OD_405nm發(fā)生明顯影響而導(dǎo)致最終檢測(cè)準(zhǔn)確性不足。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。