本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與食管鱗癌輔助診斷相關(guān)的血清miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。中國食管癌的死亡率居腫瘤第四位，2015年約有4.8萬食管癌新發(fā)病例及3.8萬食管癌相關(guān)致死患者。我國食管鱗癌病例約占食管癌總數(shù)的90％，盡管目前診斷方法、圍手術(shù)期策略及放化療手段不斷進(jìn)步，食管鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險仍然較大，并且五年生存率僅為15％-25％。由于食管鱗癌患者早期臨床表現(xiàn)無明顯特異性，大部分患者確診時已處于腫瘤中晚期，因此，早期診斷早期干預(yù)能夠有效地改善患者的預(yù)后及生存質(zhì)量。目前食管鱗癌的主要診斷措施包括：影像學(xué)檢查、內(nèi)鏡檢查以及病理學(xué)診斷，然而影像學(xué)及內(nèi)鏡檢查有一定的放射及創(chuàng)傷風(fēng)險。臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原(CEA)和鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC)等，也缺乏一定的靈敏性和特異性。因此，發(fā)現(xiàn)新的能夠早期診斷食管鱗癌的標(biāo)記物從而促進(jìn)食管鱗癌早期干預(yù)和治療具有重要的臨床意義。

微小RNA(miRNAs)是一類長度在22個左右的核苷酸的小非編碼RNA分子，其通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控廣泛參與了各種生命活動過程，包括腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)在腫瘤中有不同程度的上調(diào)和下調(diào)，為其能夠作為一種新興的腫瘤標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。2008年，Mitchell在外周血中檢測到游離的miRNA，發(fā)現(xiàn)其能夠穩(wěn)定存在于外周血中，并且可以作為診斷腫瘤的無創(chuàng)標(biāo)志物。現(xiàn)已有研究證實了循環(huán)miRNA在多種腫瘤(包括食管鱗癌)中的潛在診斷價值。但目前關(guān)于食管鱗癌的較大樣本miRNA譜系研究仍然較少。因此，本研究利用Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相對定量法，通過對大樣本的食管鱗癌血清的研究，旨在尋找對食管鱗癌具有潛在診斷價值的血清miRNA。并對這些miRNA在食管鱗癌組織中以及外周血清外泌體中的表達(dá)進(jìn)行驗證，以進(jìn)一步明確其與食管鱗癌的關(guān)系。若根據(jù)這類miRNA設(shè)計針對于食管鱗癌的診斷試劑盒，將會推動我國食管鱗癌的診治水平，也為將來對食管鱗癌的進(jìn)一步研究提供思路。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種與食管鱗癌輔助診斷相關(guān)的血清miRNA標(biāo)志物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述血清miRNA標(biāo)志物及其引物在制備食管鱗癌輔助診斷試劑盒以及在制備治療食管鱗癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的在于提供用于食管鱗癌輔助診斷和治療的試劑盒及藥物。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種與食管鱗癌輔助診斷相關(guān)的血清miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-20b-5p(CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG)、miR-28-3p(CACUAGAUUGUGAGCUCCUGGA)、miR-192-5p(CUGACCUAUGAAUUGACAGCC)、miR-223-3p(UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA)和miR-296-5p(AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU)中的一種或多種，如miR-20b-5p、miR-28-3p和miR-192-5p的組合，或miR-296-5p。該血清miRNA標(biāo)志物優(yōu)選為miR-10b-5p、miR-132-3p、miR-185-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p中兩種或兩種以上的組合，進(jìn)一步優(yōu)選為miR-10b-5p、miR-132-3p、miR-185-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p五種miRNA所組成的組合。

上述的血清miRNA標(biāo)志物在輔助診斷食管鱗癌中的應(yīng)用。

上述的血清miRNA標(biāo)志物在制備食管鱗癌輔助診斷試劑盒或治療食管鱗癌藥物中的應(yīng)用。

一種與食管鱗癌輔助診斷相關(guān)的血清miRNA標(biāo)志物的引物，該引物包含miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中的一種或多種miRNA的引物；優(yōu)選為包含血清miRNA中miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中兩種或兩種以上miRNA的引物；進(jìn)一步優(yōu)選為包含血清miRNA中miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p五種miRNA的引物。

上述的引物在輔助診斷食管鱗癌或制備食管鱗癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。

一種食管鱗癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中的一種或多種miRNA；優(yōu)選為用于檢測血清miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中兩種或兩種以上的miRNA；進(jìn)一步優(yōu)選為用于檢測血清中的miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p五種miRNA。

一種食管鱗癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒中含有血清miRNA中miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中的一種或多種miRNA的引物；優(yōu)選為含有血清miRNA中miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中兩種或兩種以上miRNA的引物；進(jìn)一步優(yōu)選為含有血清miRNA中miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p五種miRNA的引物。

該試劑盒還可以包括PCR技術(shù)常用試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水和Taq酶等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?/p>

本發(fā)明所涉及的與食管鱗癌診斷相關(guān)的血清miRNA標(biāo)志物miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p中的每種miRNA的序列均已公開，但是將各miRNA標(biāo)志物進(jìn)行組合作為食管鱗癌輔助診斷標(biāo)志物需要本領(lǐng)域技術(shù)人員付出創(chuàng)造性勞動。各miRNA標(biāo)志物的擴(kuò)增引物均可通過市場購買獲得，本發(fā)明實施例中使用的血清miRNA標(biāo)志物的引物為購自廣州銳博公司所合成生產(chǎn)的特異性miRNA莖環(huán)RT-PCR引物。

具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：(1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫：以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。(2)血清miRNA差異表達(dá)譜分析：分析食管鱗癌和正常對照人群中差異表達(dá)的血清miRNA，并對差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行進(jìn)一步大樣本多階段驗證。(3)通過多階段的驗證，明確這些miRNA診斷食管鱗癌的能力。(4)血清miRNA診斷試劑盒的研制：根據(jù)食管鱗癌患者與正常人群血清中的差異表達(dá)miRNA開發(fā)miRNAs診斷試劑盒，實現(xiàn)對食管鱗癌患者的無創(chuàng)輔助診斷。(4)分析這些miRNA在食管鱗癌組織以及外泌體中的表達(dá)情況，揭示這些miRNA與食管鱗癌的關(guān)系，為將來研制可能與這些miRNA相關(guān)的治療食管鱗癌的藥物提供依據(jù)。

本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨床資料，并采用了Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。

具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：

1.研究樣本選擇：初治、未行手術(shù)以及放化療干預(yù)且經(jīng)病理確認(rèn)為食管鱗癌的患者。正常對照為在醫(yī)院進(jìn)行體檢的正常人群。

2.Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩：利用TRIZOL-LS試劑對血清混合樣本進(jìn)行RNA提取，并進(jìn)行qRT-PCR操作獲得初篩結(jié)果。

3.訓(xùn)練集、驗證集以及額外驗證集：利用AM1556試劑盒(ABI公司)對每個血清樣本進(jìn)行RNA提取，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品，加入PCR引物和SYBR Green熒光染料進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過比對標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，得出樣本中的miRNA含量。

4.利用TRIZOL-LS試劑提取食管鱗癌和癌旁組織中的RNA，ExoQuick試劑盒(SBI公司)和AM1556試劑盒(ABI公司)提取外泌體中的RNA，通過qRT-PCR的方法，檢測miRNA在組織以及外泌體中的表達(dá)差異。

5.統(tǒng)計分析：運(yùn)用χ²檢驗、配對t檢驗以及非參數(shù)秩和檢驗比較miRNA表達(dá)水平在不同研究組中的差異。通過計算ROC曲線分析證實血清miRNA的診斷價值。

本發(fā)明研究組目前通過對食管鱗癌病人的外周血清中的miRNA進(jìn)行系統(tǒng)的表達(dá)分析，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了一組5個具有臨床診斷潛能的食管鱗癌血清microRNA標(biāo)記物(miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p)。

本發(fā)明的有益效果：

1.相較于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，血清miRNA作為新型的生物標(biāo)志物，具有穩(wěn)定性好、微創(chuàng)易獲取、靈敏性和特異性高的特點(diǎn)。這類分子標(biāo)志物的開發(fā)利用將為包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的診斷以及進(jìn)一步治療提供新的方向。

2.研究者通過Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的相對定量法，對食管鱗癌和正常對照人群血清中的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行嚴(yán)密、多階段的驗證和評價。證實了這組miRNA作為診斷食管鱗癌的無創(chuàng)標(biāo)記物的可靠性以及可重復(fù)性。

3.研究者發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p、miR-28-3p和miR-192-5p在食管鱗癌組織中的表達(dá)與血清中表達(dá)一致，同時miR-296-5p在血清外泌體中的表達(dá)也是高于正常對照的，顯示了這組miRNA與食管鱗癌之間的緊密關(guān)系。這些結(jié)果將給未來研究這些miRNA對于食管鱗癌的機(jī)制以及針對這些miRNA對于食管鱗癌的治療提供新的思路。

附圖說明

圖1：實驗流程圖

圖2：在食管鱗癌血清中高表達(dá)的5個miRNA

圖3：對所獲得的miRNA進(jìn)行ROC曲線分析

A：訓(xùn)練集與驗證集的合集；B：訓(xùn)練集；C：驗證集；D：外部驗證集。

圖4：5個miRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況

圖5：5個miRNA在食管鱗癌患者血清外泌體中的表達(dá)情況

具體實施方式

發(fā)明人于2013年至2015年從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及常州市第一人民醫(yī)院收集了大量的食管鱗癌患者和正常體檢人群的靜脈血清樣品，通過對樣品資料的整理，從中選擇了200例食管鱗癌和188例正常對照的樣本作為Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩和后續(xù)一系列qRT-PCR驗證的實驗樣品。同時還留取了36例食管鱗癌組織和36例癌旁組織。所選擇的患者血清樣本均來自于初治、未行手術(shù)以及放化療干預(yù)且經(jīng)病理確認(rèn)為食管鱗癌的病人。并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料、臨床資料。

參照流程圖(圖1)，從食管鱗癌以及正常對照血清樣本中隨機(jī)選擇了30例食管鱗癌樣本以及10例正常對照，并且分別混合成了3例食管鱗癌血清混合樣本和1個正?；旌蠘颖?一個混合樣本由10例200ul血清樣本匯合形成2ml的樣本)。對這4例混合樣本進(jìn)行Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩和分析，具體步驟參照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的說明書：

1.血清抽提

取出血清樣品，樣品化凍后3000x g離心5min去除一些碎片及一些不溶成分。轉(zhuǎn)移250ul上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZOL-LS后，劇烈震蕩5s。

2.兩相分離

勻漿后樣品于15到30℃孵育5分鐘。每1ml的TRIZOL-LS試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下13,000g離心15分鐘。

3.RNA沉淀

將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為：1ml TRIZOL-LS試劑勻漿的樣品中加0.5ml的異丙醇和5ul的糖元。4℃靜置半小時，讓RNA盡可能的析出。于4℃13,000g離心15分鐘。

4.RNA清洗

移去上清液，每1ml TRIZOL-LS試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。靜置10分鐘，然后4℃下10000g離心5分鐘。

5.重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘，加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55到60℃孵育10分鐘。

6.測量濃度：

通常能得到～5μg RNA/50ml血清。

7.cDNA合成

(1)稀釋模板RNA：使用DEPC水將20－25ng模板RNA稀釋至14ul(終濃度為1.492－1.786ng/μl)。

(2)準(zhǔn)備反應(yīng)液：將5×Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震蕩混勻。Enzyme mix置于-20℃冰盒，使用前輕彈混勻后置于冰上。所有試劑均離心后使用。

(3)配置反應(yīng)液：配置下表中的反應(yīng)液

(4)混合并離心試劑：震蕩或者抽吸混勻反應(yīng)液后離心，以保證所有溶液徹底混合均勻。

(5)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熱失活：將反應(yīng)液于42℃溫育60分鐘后，于95℃溫育5分鐘以失活逆轉(zhuǎn)錄酶。

8.Real-Time PCR

試劑：

Nuclease free water(Exiqon)

SYBR^TM Green master mix(Exiqon)

cDNA模板

ROX(Invitrogen)

miRNA PCR ARRAY(Exiqon)

儀器：

ABI PRISM7900system(Applied Biosystems)

(1)準(zhǔn)備Real-time PCR試劑：將制備的cDNA模板，DEPC水和SYBR^TM Green master mix置于冰上溶解15-20分鐘。

(2)稀釋cDNA模板：將RT反應(yīng)獲得的cDNA模板用nuclease free water稀釋110倍(例如，向20μl反應(yīng)液中加入2180ul nuclease free water)。

(3)混合所有反應(yīng)試劑：

A.將PCR板簡單離心后，移去封膜。

B.將110倍稀釋的cDNA模板與2×SYBR Green master mix按照1：1體積比混合。

C.倒置混勻反應(yīng)液并離心

D.將混合反應(yīng)液加入板中的每個孔

E.重新封好PCR板

(4)將PCR板簡單低溫離心

(5)Real-time PCR擴(kuò)增：根據(jù)下表中的反應(yīng)條件進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增和溶解曲線分析。

Real-time PCR循環(huán)條件如下表：

數(shù)據(jù)分析：采用ΔΔCt方法

使用PCR儀器附帶的軟件進(jìn)行初步數(shù)據(jù)分析，獲得原始的Cq值(Cp或Ct，依儀器不同名稱可能不同)。

我們建議使用GenEx qPCR分析軟件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和深入的數(shù)據(jù)分析。

a.計算每個處理組中的每個通路相關(guān)基因的ΔCt。

ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 1array

ΔCt(group 2)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 2array

b.計算2個PCR Array(或兩組)中每個基因的ΔΔCt。

ΔΔCt＝ΔCt(組2)-ΔCt(組1)

備注：通常組1是對照，組2是實驗組。

c.通過2-ΔΔCt計算組2與組1對應(yīng)基因的表達(dá)差異。

在芯片初篩后，得到了如下表中的36個差異表達(dá)miRNA(3個食管鱗癌血清混合樣本中相對于正常樣本都超過了1.5倍差異)。

對于初篩得到的36個差異表達(dá)miRNA，通過訓(xùn)練集、驗證集和額外驗證集，采用基于qRT-PCR的相對定量法進(jìn)行驗證，具體步驟為：

1.血清RNA提取：選用ABI公司血清RNA提取試劑盒(AM1556)，參照試劑盒說明，每個樣本吸取200ul進(jìn)行提取RNA，并最后用100ul DEPC水進(jìn)行溶解。

2.cDNA的制備：

1)采用50μL反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗

以上反應(yīng)體系混勻，瞬時離心后，以下列程序進(jìn)行反應(yīng)：

2)上述反應(yīng)之后再反應(yīng)體系中再加入如下反應(yīng)物

3.qPCR

1)采用5μL反應(yīng)體系，按以下比例進(jìn)行試驗

反應(yīng)體系混勻，瞬時離心后，放置于實時定量PCR儀中，以下列程序進(jìn)行反應(yīng)：

反應(yīng)結(jié)束后添加溶解曲線。

數(shù)據(jù)分析：通過ΔΔCt方法可以計算獲得每個樣本中的miRNA的相對濃度。利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到了一組在訓(xùn)練集和驗證集中均一致于食管鱗癌血清中高表達(dá)的5個miRNA：miR-20b-5p、miR-28-3p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-296-5p(在訓(xùn)練集和驗證集中P值都小于0.05，圖2)。通過這5個miRNA，可以計算每個樣本的ROC曲線。如圖3，這5個miRNA組成的分子標(biāo)志物能夠很好的區(qū)分食管鱗癌患者和正常人群。

研究組之后進(jìn)一步檢測了這5個miRNA在食管鱗癌組織以及血清中外泌體的表達(dá)，食管鱗癌組織提取RNA利用TRIZOL，外泌體提取試劑盒為ExoQuick試劑盒(SBI公司)。200ul血清所提取出的外泌體用200ul DEPC水重懸后，利用AM1556試劑盒(ABI公司)對外泌體RNA進(jìn)行提取，步驟同血清RNA提取過程。

運(yùn)用非參數(shù)檢驗分析發(fā)現(xiàn)，miR-20b-5p、miR-28-3p和miR-192-5p在食管鱗癌組織中的表達(dá)要高于癌旁組織(圖4)。miR-296-5p在食管鱗癌血清外泌體中的表達(dá)亦明顯高于正常人群(圖5)。

試劑盒包括一批血清miRNA qRT-PCR引物，還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如：逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，熒光探針，RNA酶抑制劑，Taq酶等，可根據(jù)具體采用的實驗方法選用，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對照(如定量標(biāo)化的正常人樣本等)。此試劑盒的價值在于只需要血清而不需要其它組織樣品，通過最精簡的熒光法檢測血清樣本中miRNA的表達(dá)含量，來輔助診斷該樣本來源患者的罹患食管鱗癌的可能性。血清miRNA檢測方便，且定量精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導(dǎo)診斷以及進(jìn)一步的個體化治療。