1.一種藍色犁頭霉菌株,屬于真菌界、接合菌門、毛霉目、小克銀漢霉科,保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”,保藏時間為2013年6月8日,保藏號為:CGMCC No.7688。
2.一種權利要求1所述的藍色犁頭霉菌株在以甾體中間體RSA為底物制備氫化可的松產(chǎn)物中的應用。
3.一種權利要求1所述的藍色犁頭霉菌株在以甾體中間體RSA為底物生產(chǎn)氫化可的松的方法,其特征在于包括以下步驟:
⑴原種復活:在菌種生長溫度條件下,將保存的原種在PDA培養(yǎng)基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培養(yǎng),直到氣生菌絲長滿斜面;
⑵制備菌懸液:取無菌水倒入培養(yǎng)好菌種的茄子瓶中,用接種針攪拌完全,再取菌懸液稀釋后,涂布在PDA平板上,在菌種生長溫度條件下培養(yǎng);
⑶制備茄子瓶或者克氏瓶斜面:在培養(yǎng)的PDA平板上選擇單個菌落接種在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上,在菌種生長溫度條件下培養(yǎng);
⑷制備一級種子液:在培養(yǎng)好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌種中加入無菌水制備菌懸液并移入已經(jīng)滅菌的搖瓶培養(yǎng)液中,在菌種生長溫度條件下,在搖床上培養(yǎng),pH到4.5以下獲得一級種子液;
⑸制備二級種子液:培養(yǎng)基以及裝量與上一步相同,將一級種子液按照20%移種量移入二級搖瓶培養(yǎng),在菌種生長溫度條件下,在搖床上培養(yǎng),pH到3.5以下即得二級種子液;
⑹投料發(fā)酵:按照0.2wt%的投料量投入RSA酒精溶液到二級種子液中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液;
⑺結果檢測:將每個搖瓶的發(fā)酵液經(jīng)抽濾后,取濾液加入等量醋酸丁酯進行萃取并濃縮結晶,將結晶物抽濾得到氫化可的松粗品和母液,將氫化可的松粗品烘干稱取粗品重量,根據(jù)投料量計算粗品收率和轉(zhuǎn)化率;
⑻選取生產(chǎn)菌株:在收率80%以上、轉(zhuǎn)化率70%以上的菌株中選擇收率和轉(zhuǎn)化率高于平均值的菌株,一方面制成砂土管原種或者牛奶凍干管在4℃條件下保存于冰箱中作為原種為以后生產(chǎn)和選育優(yōu)良菌株備用,另一方面?zhèn)鞔糜阽摅w發(fā)酵生產(chǎn);
⑼傳代培養(yǎng):在菌種生長溫度條件下,將選取的生產(chǎn)菌株接入PDA培養(yǎng)基茄子瓶斜面上培養(yǎng),直到氣生菌絲長滿斜面;
⑽培養(yǎng)生產(chǎn)母種:將傳代培養(yǎng)后的菌種從茄子瓶斜面上接入PDA培養(yǎng)基克氏瓶斜面上培養(yǎng),在菌種生長溫度條件下培養(yǎng),使得氣生菌絲長滿克氏瓶并呈藍黑色;
⑾培養(yǎng)一級生產(chǎn)種子液:將生產(chǎn)母種接入種子罐中,培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)液相同,在菌種生長溫度條件下培養(yǎng),取樣鏡檢確定沒有被污染并且PH到4.5以下,菌絲體體積達到85%以上標準后即可移入二級發(fā)酵罐中培養(yǎng);
⑿底物溶液制備:溶解罐中投入RSA,加入水和酒精,密閉后升溫回流至RSA溶清,溶液清亮透明,然后保溫備用;
⒀培養(yǎng)二級生產(chǎn)種子液:在發(fā)酵罐中置入培養(yǎng)液,然后將種子罐中的一級生產(chǎn)種子液移入該發(fā)酵罐,在菌種生長溫度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)后,取樣鏡檢確定沒有被污染并且pH到3.5以下,菌絲體體積在40%~60%之間,降溫并加片堿水溶液壓入底物溶液;
⒁投底物發(fā)酵:壓入RSA底物溶液,在菌種生長溫度下發(fā)酵培養(yǎng),根據(jù)取樣檢測當時的發(fā)酵罐中的轉(zhuǎn)化情況決定發(fā)酵終止時間;
⒂壓濾:在發(fā)酵達到終止條件后加硫酸水溶液調(diào)節(jié)pH至5.4后對發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液進行壓濾,取濾液備用;
⒃濾液提取:將濾液壓入提取罐,加入發(fā)酵液量1/4~1/5的醋酸丁酯,攪拌,靜置分層后取上清液至濃縮罐進行減壓濃縮,再打入同樣的醋酸丁酯循環(huán)攪拌、提取,直至濾液提取干凈;
⒄粗品濃縮:將上步的提取液減壓濃縮至粥狀物,放入結晶鍋內(nèi)用冰鹽水降溫結晶;
⒅粗品離心:將上步溶液置入離心機離心甩干;
⒆粗品烘干:將上述甩干物分裝入烘盤內(nèi)放入烘箱,烘烤獲得粗品;
⒇精制品:進行粗制品的分離,然后采用甲醇進行重結晶得精制品。
4.按權利要求3所述的藍色犁頭霉菌株在以甾體中間體RSA為底物生產(chǎn)氫化可的松的方法,其特征是:
a.步驟⑴中,原種復活溫度條件為27~29℃;
b.步驟⑵中,菌懸液涂布在直徑150mm的PDA平板上;
c.步驟⑷中,一級種子液搖床上轉(zhuǎn)速為200~220轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)18~20h;
d.步驟⑸中,二級種子液搖床上轉(zhuǎn)速為200~220轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)11~13h:
e.步驟⑹中,投料發(fā)酵的培養(yǎng)時間為24~48h;
f.步驟⑼中,傳代培養(yǎng)的生產(chǎn)菌株培養(yǎng)時間為5~6天;
g.步驟⑽中,生產(chǎn)母種在克氏瓶斜面上培養(yǎng)6~7天;
h.步驟⑾中,一級生產(chǎn)種子液培養(yǎng)時間為20~22h;
i.步驟⑿中,溶解罐中投入RSA后,再加入2倍水和18倍酒精;
j.步驟⒀中,一級生產(chǎn)種子液在發(fā)酵罐中應培養(yǎng)11~13h后,取樣鏡檢后,降溫并加片堿水溶液調(diào)節(jié)至pH5.2~5.4后壓入底物溶液;
k.步驟⒁步驟中,投底物發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)時間為18~32h;
l.步驟⒃中,濾液與醋酸丁酯混合時間為攪拌20~30min,靜置分層30min;
m.步驟⒇中,粗制品分離的方法采用中國專利專利ZL200710066229的方法。