本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術領域：
，尤其涉及一種二氨基嘧啶化合物及包含該化合物的組合物。
背景技術：
：在過去30年中，肺癌死亡率上升了465％，發(fā)病率每年增長26.9％，已成為我國首位惡性腫瘤死亡原因。其中非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)占所有肺癌的80％以上，僅有三分之一的NSCLC患者存在手術治療的機會，約70％的患者在就診時已屬局部晚期或者出現(xiàn)遠處轉移，失去了手術的機會，這種情況下，藥物治療顯得尤為重要。間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)基因融合在近期已經成為一個重要的生物標志物，為特定NSCLC亞組的患者選擇、從而采用對應抑制劑進行治療提供幫助。肺癌研究國際協(xié)會(IASLC)推薦采用ALK融合檢測來指導患者篩選，在晚期腺癌患者中選擇可采納ALK抑制劑治療的患者，不論其性別、種族、吸煙史或其他臨床風險因素。采用雙標簽分離探針的熒光原位雜交(FISH)檢測用于選擇可接受ALK－TKI治療的病人，這種診斷方法獲得美國FDA批準，已在克唑替尼治療ALK重排腫瘤的研究中被采用?？诉蛱婺崾强诜腿姿嵯佘?ATP)競爭性抑制劑，可抑制ALK和MET酪氨酸激酶，還能夠抑制ROS1和RON激酶的活性。但是，克唑替尼會出現(xiàn)如下副作用：視覺障礙、胃腸道副作用，16％的病例發(fā)生3-4級肝轉氨酶水平升高。此外，ALK陽性患者經過開始階段的克唑替尼治療敏感期后不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥。因此，針對需要開發(fā)對具有ALK激酶抑制活性的和/或具有更好藥效學/藥代動力學性能的化合物。技術實現(xiàn)要素：針對以上技術問題，本發(fā)明公開了一種二氨基嘧啶化合物及包含該化合物的組合物，其具有更好的ALK激酶抑制活性和/或具有更好藥效學/藥代動力學性能。對此，本發(fā)明采用的技術方案為：本發(fā)明的目的是提供一類新型的具有ALK激酶抑制活性的和/或具有更好藥效學/藥代動力學性能的化合物。本發(fā)明的第一方面中，提供了一種式(I)所示的二氨基嘧啶化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化合物。式中：其中：R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11、R12、R13、R14a、R14b、R14c、R15、R16、R17a、R17b、R17c、R18a、R18b、R18c、R19、R20、R21和R22各自獨立地為氫、氘、鹵素或三氟甲基；R16為氫、氘、鹵素、氰基、未氘代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基、一次或多次氘代的或全氘代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基，或者一個或多個鹵素取代的或全鹵素取代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；附加條件是R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11、R12、R13、R14a、R14b、R14c、R15、R16、R17a、R17b、R17c、R18a、R18b、R18c、R19、R20、R21和R22中至少一個是氘代的或氘。氘在藥物分子中的形狀和體積與氫基本上相同，如果藥物分子中氫被選擇性替換為氘，氘代藥物一般還會保留原來的生物活性和選擇性。同時發(fā)明人經過實驗證實，碳氘鍵的結合比碳氫鍵的結合更穩(wěn)定，可直接影響一些藥物的吸收、分布、代謝和排泄等屬性，從而提高藥物的療效、安全性和耐受性。在另一優(yōu)選例中，氘在各氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，較佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。具體地說，在本發(fā)明中R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11、R12、R13、R14a、R14b、R14c、R15、R16、R17a、R17b、R17c、R18a、R18b、R18c、R19、R20、R21和R22各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，較佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。在另一優(yōu)選例中，式(I)中化合物至少含有一個氘原子，其含氘原子的個數(shù)可以是1到38中的任意一個。在另一優(yōu)選例中，式(I)中化合物至少含有一個氘原子，其含氘原子的個數(shù)可以是1到38中的任意一個。在另一優(yōu)選例中，式(I)中化合物的R1a、R1b、R1c、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11、R12、R13、R14a、R14b、R14c、R15、R16、R17a、R17b、R17c、R18a、R18b、R18c、R19、R20、R21和R22，至少其中一個R含氘，更佳地兩個R含氘，更佳地三個R含氘，更佳地四個R含氘，更佳地五個R含氘，更佳地六個R含氘，更佳地七個R含氘，更佳地八個R含氘，更佳地九個R含氘，更佳地十個R含氘，更佳地十一個R含氘，更佳地十二個R含氘，更佳地十三個R含氘，更佳地十四個R含氘，更佳地十五個R含氘，更佳地十六個R含氘，更佳地十七個R含氘，更佳地十八個R含氘，更佳地十九個R含氘，更佳地二十個R含氘，更佳地二十一個R含氘，更佳地二十二個R含氘，更佳地二十三個R含氘，更佳地二十四個R含氘，更佳地二十五個R含氘，更佳地二十六個R含氘，更佳地二十七個R含氘，更佳地二十八個R含氘，更佳地二十九個R含氘，更佳地三十個R含氘，更佳地三十一個R含氘，更佳地三十二個R含氘，更佳地三十三個R含氘，更佳地三十四個R含氘，更佳地三十五個R含氘，更佳地三十六個R含氘，更佳地三十七個R含氘，更佳地三十八個R含氘。在另一優(yōu)選例中，R1a、R1b和R1c各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a和R5b各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R6為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a和R10b各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R11、R12和R13各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R14a、R14b和R14c各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R17a、R17b和R17c各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R18a、R18b和R18c各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R19、R20、R21和R22各自獨立地為氘或氫。在另一優(yōu)選例中，R16分別獨立地選擇鹵素、三氟甲基、氰基、一次或多次氘代的烷基及烷氧基。在另一優(yōu)選例中，其特征在于，R16是氯。在另一優(yōu)選例中，其特征在于，R1a、R1b、R1c是氘。在另一優(yōu)選例中，其特征在于，R2a、R2b、R5a、R5b是氘。在另一優(yōu)選例中，其特征在于，R3a、R3b、R4a、R4b是氘。在另一優(yōu)選例中，R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b是氘。在另一優(yōu)選例中，R6是氘。在另一優(yōu)選例中，R7a、R7b、R10a、R10b是氘。在另一優(yōu)選例中，R8a、R8b、R9a、R9b是氘。在另一優(yōu)選例中，R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b是氘。在另一優(yōu)選例中，R11、R13是氘。在另一優(yōu)選例中，R11、R12、R13是氘。在另一優(yōu)選例中，R14a、R14b、R14c是氘。在另一優(yōu)選例中，R17a、R17b、R17c、R18a、R18b、R18c是氘。在另一優(yōu)選例中，R20、R22是氘。在另一優(yōu)選例中，R19、R20、R21、R22是氘。在另一優(yōu)選例中，所述化合物選自下組化合物或其藥學上可接受的鹽：5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-d3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺，結構式如式(2)所示；5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-d3-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺，結構式如式(3)所示；5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-4-d-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺，結構式如式(4)所示；5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-3,3,5,5-d4-哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺，結構式如式(5)所示；在另一優(yōu)選例中，所述化合物選自下組化合物或其藥學上可接受的鹽：在另一優(yōu)選例中，所述化合物不包括非氘代化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的非氘代化合物為5-氯-N4-(2-(二甲基氧膦基)苯基)-N2-(2-甲氧基-4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)苯基)嘧啶-2,4-二胺。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種制備藥物組合物的方法，包括步驟：將藥學上可接受的載體與本發(fā)明第一方面中所述的化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物進行混合，從而形成藥物組合物。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，它含有藥學上可接受的載體和本發(fā)明第一方面中所述的化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為注射劑、囊劑、片劑、丸劑、散劑或顆粒劑。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有另外的治療藥物，所述的另外的治療藥物為癌癥、心血管疾病、炎癥、感染、免疫性疾病、細胞增殖性疾病、病毒性疾病、代謝性疾病、或器官移植的藥物。在本發(fā)明的第四方面中，提供了本發(fā)明第一方面中所述的化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、前藥、立體異構體、同位素變體、水合物或溶劑合物的用途，它們被用于制備抑制蛋白酶的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于治療和預防以下疾?。喊┌Y、細胞增殖性疾病、炎癥、感染、免疫性疾病、器官移植、病毒性疾病、心血管疾病或代謝性疾病。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括但并不限于：肺癌、頭頸癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、直腸癌、結腸癌、鼻咽癌、子宮癌、胰腺癌、淋巴瘤、血癌、骨肉瘤、黑色素瘤、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、甲狀腺癌或大腸癌。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫性疾病或炎癥包括但并不限于：類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、類風濕性脊柱炎、痛風、哮喘、支氣管炎、鼻炎、慢性阻塞性肺病、囊性纖維化病。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞增殖性疾病是指肺癌、頭頸癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、直腸癌、結腸癌、鼻咽癌、子宮癌、胰腺癌、淋巴瘤、血癌、骨肉瘤、黑色素瘤、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、甲狀腺癌或大腸癌。在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥為非小細胞肺癌。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種抑制蛋白激酶(如ALK激酶)的方法或一種疾病(如癌癥、細胞增殖性疾病、炎癥、感染、免疫性疾病、器官移植、病毒性疾病、心血管疾病或代謝性疾病)的治療方法，它包括步驟：給需要治療的對象施用本發(fā)明第一方面中所述的化合物，或其晶型、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物，或施用本發(fā)明第三方面中所述的藥物組合物。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本發(fā)明還包括同位素標記的化合物，等同于原始化合物在此公開?？梢粤袨楸景l(fā)明的化合物同位素的例子包括氫，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分別如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F以及36Cl。本發(fā)明中的化合物，或對映體，非對映體，異構體，或藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中含有上述化合物的同位素或其他其他同位素原子都在本發(fā)明的范圍之內。本發(fā)明中某些同位素標記化合物，例如3H和14C的放射性同位素也在其中，在藥物和底物的組織分布實驗中是有用的。氚，即3H和碳-14，即14C，它們的制備和檢測比較容易，是同位素中的首選。此外，較重同位素取代如氘，即2H，由于其很好的代謝穩(wěn)定性在某些療法中有優(yōu)勢，例如在體內增加半衰期或減少用量，因此，在某些情況下可以優(yōu)先考慮。同位素標記的化合物可以用一般的方法，通過用易得的同位素標記試劑替換為非同位素的試劑，用示例中的方案可以制備。本文中，如無特別說明，“鹵素”指F、Cl、Br、和I。更佳地，鹵原子選自F、Cl和Br。本文中，如無特別說明，“C1-C6烷基”是指包括1-6個碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、或類似基團。本文中，如無特別說明，“氘代”指化合物或基團中的一個或多個氫被氘所取代；氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。術語“一個或多個氘代的”與“一次或多次氘代”可互換使用。本文中，如無特別說明，“非氘代的化合物”是指含氘原子比例不高于天然氘同位素含量(0.015％)的化合物。本發(fā)明中，藥學上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有機酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與堿形成的鹽，例如堿金屬鹽(例如鈉鹽或鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鎂鹽或鈣鹽)、銨鹽(如低級的烷醇銨鹽以及其它藥學上可接受的胺鹽)，例如甲胺鹽、乙胺鹽、丙胺鹽、二甲基胺鹽、三甲基胺鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、叔丁基胺鹽、乙二胺鹽、羥乙胺鹽、二羥乙胺鹽、三羥乙胺鹽，以及分別由嗎啉、哌嗪、賴氨酸形成的胺鹽。術語“溶劑合物”指本發(fā)明化合物與溶劑分子配位形成特定比例的配合物?！八衔铩笔侵副景l(fā)明化合物與水進行配位形成的配合物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明化合物對蛋白激酶(kinase)(例如ALK激酶)具有優(yōu)異的抑制性。(2)通過氘化這一技術改變化合物在生物體中的代謝，使化合物具有更好的藥代動力學參數(shù)特性。在這種情況下，可以改變劑量并形成長效制劑，改善適用性。(3)用氘取代化合物中的氫原子，由于其氘同位素效應，能夠提高化合物在動物體內的藥物濃度，以提高藥物療效。(4)用氘取代化合物中的氫原子，由于某些代謝產物被抑制，可能提高化合物的安全性。具體實施方式下面更具體地描述本發(fā)明式(I)結構化合物的制備方法，但這些具體方法不對本發(fā)明構成任何限制。本發(fā)明化合物還可以任選將在本說明書中描述的或本領域已知的各種合成方法組合起來而方便地制得，這樣的組合可由本發(fā)明所屬領域的技術人員容易地進行。本發(fā)明使用的未氘代的二氨基嘧啶化合物及其生理上相容的鹽的制備方法是已知的。對應氘代的二氨基嘧啶化合物的制備可以用相應的氘代起始化合物為原料，用同樣的路線合成。例如，本發(fā)明式(I)化合物可按WO2012061299中所述的制備方法制備，不同點在于在反應中用氘代的原料代替非氘代的原料。通常，在制備流程中，各反應通常在惰性溶劑中，在室溫至回流溫度(如0℃～100℃，優(yōu)選0℃～80℃)下進行。反應時間通常為0.1小時-60小時，較佳地為0.5-24小時。下面的通用制備路線可以用于合成本發(fā)明式(I)結構的化合物。合成路線如下所示：哌嗪取代哌啶胺的合成如下所示：下面結合實施例進行詳細說明。實施例1按照以下合成路線制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-N2-{2-d3-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(下述合成路線中的化合物9)：采用以下步驟制備：(1)制備化合物2：在100mL單口瓶中加入30mL丙酮，攪拌下依次加入5-氟-2-硝基苯酚(2.0g，12.7mmol)、無水碳酸鉀(3.5g，25.4mmol)、氘代碘甲烷(2.4g，16.5mmol)，升溫到60℃并保溫攪拌2h。冷卻到室溫，旋轉蒸發(fā)掉丙酮，殘留物加入水20mL，乙酸乙酯萃取(30mLx3)，合并有機層，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得白色固體2.0g，收率90％。1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)8.00-7.95(m,1H),6.83-6.71(m,2H)，LC-MS(APCI):m/z＝175.2(M+1)+,95％。(2)制備化合物4：在25mL單口燒瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺(4mL)，攪拌下依次加入4-氟-2-d3-甲氧基硝基苯(0.4g，2.3mmol)、1-甲基-4-(哌啶-4-基)哌嗪鹽酸鹽(0.7g，3.2mmol)、無水碳酸鉀(0.95g，6.9mmol)，反應混合物升溫到80℃，N2氛下反應過夜。冷卻到室溫，倒入冰水(80mL)中，析出大量黃色固體，過濾，并溶于DCM(40mL)中，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色固體0.55g，收率70.9％。LC-MS(APCI):m/z＝338.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)8.01(d,J＝9.3Hz,1H),6.43(dd,J＝9.6Hz,J＝2.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),3.98-3.94(m,2H),3.03-2.94(m,2H),2.65-2.62(m,4H),2.54-2.46(m,5H),2.32(s,3H),2.01-1.96(m,2H),1.65-1.60(m,2H)。(3)制備化合物5：在25mL單口瓶中加入乙醇6mL和水2mL，攪拌下依次加入1-(1-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基)-4-甲基哌嗪(0.2g，0.59mmol)、還原鐵粉(0.20g，3.55mmol)、氯化銨(16mg，0.30mmol)，反應混合物N2氛下升溫到85℃，并保溫攪拌反應1h。冷卻到室溫，濾掉固體物質，濾液濃縮，殘留物中加入飽和碳酸氫鈉(5mL)，二氯甲烷萃取(15mLx2)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得類白色固體0.15g，收率79.6％，直接投于下一步。(4)制備化合物8：25mL單口瓶中加入DMF(3mL)，攪拌下依次加入2,5,6-三氯嘧啶(0.72g，3.9mmol)、2-(二甲基氧化膦基)苯胺(0.5g，3mmol)、無水碳酸鉀(0.62g，4.5mmol)，升溫到60℃并保溫攪拌4h。冷卻到室溫，依次加入乙酸乙酯(30mL)、水(30mL)，震蕩分層，水層用乙酸乙酯萃取(30mLx2)，合并有機相，水洗(60mLx2)，有機層無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘留物過硅膠柱得淡黃色固體0.8g，收率84.6％。LC-MS(APCI):m/z＝175.2(M+1)+；1HNMR(CDCl3,300MHz)(δ/ppm)8.00-7.95(m,1H),6.83-6.71(m,2H)。(5)制備化合物9：在25mL單口瓶中加入乙二醇單甲醚2mL，攪拌下依次加入2,5-二氯-N-(2-(二甲基氧磷基)苯基)嘧啶-4-胺(60mg，0.19mmol)、1-(1-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基)-4-甲基哌嗪(60mg，0.2mmol)、濃鹽酸(兩滴)，反應混合物N2氛下升溫到100℃，并保溫攪拌反應過夜。冷卻到室溫，加入飽和碳酸氫鈉水液(10mL)，二氯甲烷萃取(15mLx3)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，過硅膠柱得白色固體60mg，收率50.1％；LC-MS(APCI):m/z＝587.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)(δ/ppm)11.18(s,1H),8.51-8.47(m,1H),0.08-8.07(m,2H),7.57-7.50(m,1H),7.40-7.32(m,2H),7.12-7.07(m,1H),6.62(d,J＝2.4Hz,1H),6.47(dd,J＝9.0Hz,2.4Hz,1H),3.77-3.72(m,2H),2.82-2.61(m,11H),2.48-2.34(m,3H),1.91-1.85(m,2H),1.79(s,3H),1.74(s,3H),1.59-1.52(m,2H)。實施例2按照以下合成路線制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-d3-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(下述合成路線中的化合物15)：包括以下步驟：(1)制備化合物10：在100mL單口燒瓶加入N，N-二甲基甲酰胺(10mL)，攪拌下依次加入4-氟-2-甲氧基硝基苯(2g，11.8mmol)、哌啶-4-酮鹽酸鹽(2.23g，16.5mmol)、無水碳酸鉀(4.88g，35.4mmol)，反應混合物升溫到80℃，N2氛下反應過夜。冷卻到室溫，倒入冰水(80mL)中，析出大量黃色固體，過濾，并溶于DCM(100mL)中，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得黃色固體2.2g，收率74.6％。LC-MS(APCI):m/z＝251.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)(δ/ppm)7.93(d,J＝9.6Hz,1H),6.62(dd,J＝9.6Hz,2.4Hz,1H),6.53(d,J＝2.4Hz,1H),3.94(s,3H),3.84(t,J＝6.3Hz,4H),2.50(t,J＝6.3Hz,4H)。(2)制備化合物11：在100mL單口燒瓶中加入甲苯20mL，攪拌下依次加入1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-酮(0.53g，2.1mmol)、三乙胺(0.8mL)、N-Boc哌嗪(0.85g，4.5mmol)，N2氛下攪拌反應30min，一次性加入醋酸硼氫化鈉(0.4g，1.92mmol)，攪拌30min，分三次再次補加醋酸硼氫化鈉1.2g，反應完全。加入飽和碳酸氫鈉水液(30mL)，分出有機層，水層乙酸乙酯萃取(30mLx2)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘留物過硅膠柱得淡黃色固體0.58g，收率65.7％。LC-MS(APCI):m/z＝421.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)8.01(d,J＝9.3Hz,1H),6.43(dd,J＝9.6Hz,2.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),3.94(s,3H),3.03-2.94(m,2H),2.65-2.62(m,4H),2.54-2.46(m,5H),2.32(s,3H),2.01-1.96(m,2H),1.65-1.60(m,2H),1.51(s，9H)。(3)制備化合物12：在100mL單口燒瓶中加入二氯甲烷20mL，攪拌下依次加入4-(1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基)哌嗪基-1-叔丁酯(0.58g，1.4mmol)、三氟醋酸(2mL)，N2氛下常溫攪拌反應1h，反應液濃縮至干，加入飽和碳酸氫鈉水液(10mL)，混合物二氯甲烷萃取(20mLx3)，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得黃色固體0.45g，收率100％，LC-MS(APCI):m/z＝321.2(M+1)+。(4)制備化合物13：在25mL單口燒瓶中加入乙腈5mL，攪拌下依次加入4-(1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基)哌嗪(0.32g，1mmol)、加入三乙胺(0.12g，1.2mmol)，冰水浴冷卻，緩慢滴加入氘代碘甲烷(0.16g，1.1mmol)，冰水浴下攪拌反應30min，減壓濃縮至干，殘留物過硅膠柱得黃色固體0.15g，收率44.5％。LC-MS(APCI):m/z＝338.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)8.01(d,J＝9.3Hz,1H),6.43(dd,J＝9.6Hz,2.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),3.98-3.94(m,2H),3.92(s,3H),3.03-2.94(m,2H),2.65-2.62(m,4H),2.54-2.46(m,5H),2.01-1.96(m,2H),1.65-1.60(m,2H)。(5)制備化合物14，其制備方法與化合物5的制備方法一致，不同之處在于用1-(1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基)-4-d3-甲基哌嗪替代1-(1-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基)-4-甲基哌嗪。(6)制備5-氯-N4-[2-(二甲基氧膦基)苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-d3-甲基哌嗪-1-基)-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(化合物14)，其制備方法與化合物9的制備方法一致，不同之處在于使用1-(1-(3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基)-4-d3-甲基哌嗪替代1-(1-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基)-4-甲基哌嗪。LC-MS(APCI):m/z＝587.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)(δ/ppm)11.18(s,1H),8.51-8.47(m,1H),0.08-8.07(m,2H),7.57-7.50(m,1H),7.40-7.32(m,2H),7.12-7.07(m,1H),6.62(d,J＝2.4Hz,1H),6.47(dd,J＝9.0Hz,2.4Hz,1H),3.76-3.71(m,6H),2.82-2.61(m,11H),2.48-2.34(m,3H),1.91-1.85(m,2H),1.79(s,3H),1.74(s,3H),1.59-1.52(m,2H)。實施例3按照以下合成路線制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-d-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(下述合成路線中的化合物20)：包括以下步驟：(1)制備化合物16：在50mL單口燒瓶中加入氘代甲醇10mL，冰水浴攪拌下加入1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-酮(0.25g，1mmol)，完全溶清后緩慢加入氘代硼氫化鈉(42mg，1mmol)，冰水浴N2氛下攪拌反應5min，加入重水(2mL)淬滅反應，并常溫攪拌30min，依次加入水(30mL)和乙酸乙酯(30mL)，分出有機層，水層乙酸乙酯萃取(30mLx2)，濃縮，殘留物再次溶于乙酸乙酯(50mL)，飽和食鹽水洗滌(20mLx1)，有機相無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮得黃色固體0.25g，收率96％。LC-MS(ESI):m/z＝254.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)(δ/ppm)7.88(d,J＝9.3Hz,1H),6.58(dd,J＝9.3Hz,2.4Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),4.75(s,1H),3.90(s,3H),3.83-3.77(m,2H),3.23-3.14(s,2H),1.84-1.76(m,2H),1.45-1.37(m,2H)。(2)制備化合物17：在50mL單口燒瓶中加入二氯甲烷(15mL)，冰水浴下加入1-(3-甲基-4-硝基苯基)-4-d-哌啶-4-醇(0.25g，1mmol)，攪拌下加入三乙胺(0.18g，1.8mmol)，緩慢滴加入甲基磺酰氯(0.17g，1.5mmol)，常溫N2氛下攪拌反應1h。加入水(20mL)，震蕩分出有機層，水層二氯甲烷萃取(20mLx2)，合并有機層，依次用0.5MHCl水液(20mLx1)、飽和碳酸氫鈉水液(15mLx1)、飽和食鹽水(15mLx1)，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮至干得黃色固體0.3g，收率90.9％，直接用于下一步。(3)制備化合物18：在25mL單口燒瓶中加入DMF(3mL)，攪拌下依次加入1-(3-甲基-4-硝基苯基)-4-d-哌啶-4-甲基磺酸酯(0.3g，0.9mmol)、1-甲基哌嗪(0.36g，3.6mmol)、無水碳酸鉀(0.62g，4.5mmol)，混合物升溫到100℃，N2氛下保溫攪拌反應過夜。冷卻到室溫，加入水(30mL)和乙酸乙酯(30mL)，分出有機層，水層乙酸乙酯萃取(20mLx2)，合并有機相，水洗(40mLx3)，有機層無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘留物過硅膠柱得黃色固體100mg，收率33.1％。LC-MS(APCI):m/z＝339.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)8.01(d,J＝9.3Hz,1H),6.43(dd,J＝9.6Hz,2.7Hz,1H),6.31(d,J＝2.4Hz,1H),3.98-3.94(m,2H),3.03-2.94(m,2H),2.65-2.62(m,4H),2.54-2.46(m,5H),2.32(s,3H),2.01-1.96(m,2H),1.65-1.60(m,2H)。(4)制備1-[1-(3-甲氧基-4-胺基苯基)-4-d-哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪(化合物19)，其制備方法與化合物5的制備方法一致，不同之處在于用1-[1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)-4-d-哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪替代1-[1-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪。(5)制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-d-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(化合物20)，其制備方法與化合物9的制備方法一致，不同之處在于使用1-[1-(3-甲氧基-4-胺基苯基)-4-d-哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪替代1-[1-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪。LC-MS(APCI):m/z＝587.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.18(s,1H),8.51-8.47(m,1H),0.08-8.07(m,2H),7.57-7.50(m,1H),7.40-7.32(m,2H),7.12-7.07(m,1H),6.62(d,J＝2.4Hz,1H),6.47(dd,J＝9.0Hz,2.4Hz,1H),3.76-3.71(m,6H),2.82-2.61(m,10H),2.48-2.34(m,3H),1.91-1.85(m,2H),1.79(s,3H),1.74(s,3H),1.59-1.52(m,2H)。實施例4制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-甲基-3,3,5,5-d4-哌嗪-1-基)-哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(化合物21)，結構式如下所示：與實施例2所述相似方法，不同點在于使用4-甲基-3,3,5,5-d4-哌嗪代替N-甲基哌嗪，從而制得目標化合物。實施例5制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-甲基2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(化合物22)，結構式如下所示：與實施例2所述相似方法，不同點在于使用4-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪代替N-甲基哌嗪，從而制得目標化合物。LC-MS(APCI):m/z＝592.4(M+1)+；1HNMR(400MHz,CD3OD)(δ/ppm)8.35(dd,J＝8.4Hz,4.4Hz,1H),8.04(s,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.65-7.59(m,1H),7.53(t,J＝8Hz,1H),7.29-7.25(m,1H),6.67(d,J＝2.4Hz,1H),6.46(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),3.86(s,3H),3.71(d,J＝12.8Hz,2H),2.76-2.70(m,2H),2.61-2.56(m,4H),2.04(d,J＝12.8Hz,2H),1.87(s,3H),1.83(s,3H),1.76-1.65(m,2H)。實施例6按照以下合成路線制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-N2-{2-d3-甲氧基-4-[4-(4-d3-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(下述合成路線中的化合物25)：(1)制備化合物23：在25mL單口燒瓶中加入乙腈5mL，攪拌下依次加入4-(1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基)哌嗪(0.32g，1mmol)、加入三乙胺(0.12g，1.2mmol)，冰水浴冷卻，緩慢滴加入氘代碘甲烷(0.16g，1.1mmol)，冰水浴下攪拌反應30min，減壓濃縮至干，殘留物過硅膠柱得黃色固體0.15g，收率44.5％。LC-MS(APCI):m/z＝340.2(M+1)+。(2)制備化合物24，其制備方法與化合物5的制備方法一致，不同之處在于用1-[1-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]-4-d3-甲基哌嗪替代1-[1-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪。(3)制備化合物25，其制備方法與化合物9的制備方法一致，不同之處在于使用1-[1-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基]-4-d3-甲基哌嗪替代1-[1-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪。LC-MS(APCI):m/z＝587.2(M+1)+；1HNMR(300MHz,DMSO-d6)(δ/ppm)11.18(s,1H),8.51-8.47(m,1H),0.08-8.07(m,2H),7.57-7.50(m,1H),7.40-7.32(m,2H),7.12-7.07(m,1H),6.62(d,J＝2.4Hz,1H),6.47(dd,J＝9.0Hz,2.4Hz,1H),3.76-3.71(m,6H),2.82-2.61(m,11H),2.48-2.34(m,3H),1.91-1.85(m,2H),1.79(s,3H),1.74(s,3H),1.59-1.52(m,2H)。實施例7按照以下合成路線制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-甲氧基-4-[4-(4-d3-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(下述合成路線中的化合物29)：(1)制備化合物27：將化合物26(214mg,652μmol)、氘代甲醛的重水溶液(313mg,1.95mmol,20％/D2O)、和CH3COOD(1滴)在室溫下攪拌10分鐘，加入氘代氰基硼氫化鈉(129mg,1.95mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘后，加入三乙胺中和，濃縮后通過柱色譜分離純化得到黃色固體175mg，收率為77.8％。LC-MS(APCI):m/z＝346.4(M+1)+。(2)制備化合物28，其制備方法與化合物5的制備方法一致，不同之處在于用1-[1-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]-4-d3-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪替代1-[1-(3-d3-甲氧基-4-硝基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪。(3)制備化合物29，其制備方法與化合物9的制備方法一致，不同之處在于使用1-[1-(甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基]-4-d3-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪替代1-[1-(3-d3-甲氧基-4-胺基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基哌嗪。LC-MS(APCI):m/z＝595.4(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)10.80(s,1H),8.63(dd,J＝4.8Hz,2.4Hz,1H),8.09-8.07(m,2H),7.50(t,J＝4.5Hz,1H),7.30-7.25(m,2H),7.14-7.10(m,1H),6.55(d,J＝1.5Hz,1H),6.49(dd,J＝5.4Hz,1.5Hz,1H),3.87(s,3H),3.66(d,J＝7.5Hz,2H),2.73-2.68(m,2H),2.40-2.36(m,1H),1.95(d,J＝7.5Hz,2H),1.85(s,3H),1.82(s,3H),1.76-1.68(m,2H)。實施例8按照以下合成路線制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-d3-甲氧基-4-[4-(4-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(下述合成路線中的化合物32)：(1)制備化合物30，其制備方法與化合物10的制備方法一致，不同之處在于用d3-5-氟-2-硝基苯甲醚替代5-氟-2-硝基苯甲醚。LC-MS(APCI):m/z＝254.5(M+1)+。(2)制備化合物31：將鈦酸四異丙酯(Ti(Oi-Pr)4，5mL)加入至化合物30(900mg,3.6mmol)和2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪(474mg,5.03mmol)的溶液中，室溫下攪拌過夜，加入10mL乙醇，繼續(xù)加入腈基硼氫化鈉(678mg,10.79mmol)，將此混合液在室溫下攪拌3小時后，倒入溶有5g寅式鹽(celite)的水(10mL)，繼續(xù)攪拌30分鐘，移除溶劑后通過柱色譜分離純化得到黃色固體產物300mg，收率為25.4％。LC-MS(APCI):m/z＝332.5(M+1)+。(3)制備化合物32，其制備方法與化合物29的制備方法一致，不同之處在于用化合物31替代化合物26，甲醛替代氘代甲醛，腈基硼氫化鈉替代氘代硼氫化鈉。最終得到目標產物為白色固體，共40mg，收率為53.0％。LC-MS(APCI):m/z＝595.5(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)10.80(s,1H),8.62(dd,J＝8.1Hz,4.5Hz,1H),8.11-8.08(m,2H),7.50(t,J＝7.8Hz,1H),7.32-7.25(m,2H),7.16-7.11(m,1H),6.54(d,J＝1.6Hz,1H),6.48(dd,J＝8.4Hz,2.4Hz,1H),3.66(d,J＝12Hz,2H),2.74-2.67(m,2H),2.61-2.55(m,1H),2.48(s,3H),2.02(d,J＝12.3Hz,2H),1.84(s,3H),1.81(s,3H),1.79-1.73(m,2H)。實施例9制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-d3-甲氧基-4-[4-(4-d2-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(化合物33)，結構式如下所示：與實施例7所述方法相似，不同之處在于用化合物31替代化合物26，腈基硼氫化鈉替代氘代硼氫化鈉。最終得到目標產物為黃色固體，共70mg，收率為27.2％。LC-MS(APCI):m/z＝597.4(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)10.82(s,1H),8.62(dd,J＝8.4Hz,4.5Hz,1H),8.13-8.09(m,2H),7.50(t,J＝7.5Hz,1H),7.33-7.26(m,2H),7.16-7.10(m,1H),6.54(d,J＝2.1Hz,1H),6.48(dd,J＝9.0Hz,2.4Hz,1H),3.66(d,J＝12.6Hz,2H),2.76-2.59(m,3H),2.56(s,1H),2.08-2.00(m,2H),1.86(s,3H),1.81(s,3H),1.79-1.72(m,2H)。實施例10制備5-氯-N4-[2-(二甲基磷?；?苯基]-N2-{2-d3-甲氧基-4-[4-(4-d3-甲基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8-哌嗪-1-基)哌啶-1-基]苯基}嘧啶-2,4-二胺(化合物34)，結構式如下所示：與實施例7所述方法相似，不同之處在于用化合物31替代化合物26。最終得到目標產物為白色固體，共110mg，收率為36.7％。LC-MS(APCI):m/z＝598.4(M+1)+；1HNMR(300MHz,CDCl3)(δ/ppm)8.35(dd,J＝8.4Hz,4.4Hz,1H),8.04(s,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,1H),7.65-7.59(m,1H),7.52(t,J＝8Hz,1H),7.29-7.25(m,1H),6.67(d,J＝6.8Hz,1H),6.46(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),3.71(d,J＝12.4Hz,2H),2.76-2.70(m,2H),2.64-2.58(m,1H),2.04(d,J＝12.4Hz,2H),1.87(s,3H),1.83(s,3H),1.76-1.66(m,2H)。實施例11化合物的生物評價對本發(fā)明的化合物在多個測試中進行評價以確定它們的生物學活性。例如，可測試本發(fā)明化合物抑制多種關注的蛋白激酶的能力。一些測試的化合物對ALK激酶顯示出強效的抑制活性。(1)激酶抑制作用評價化合物配制：受試化合物溶于DMSO配成20mM母液。使用前將化合物在DMSO中稀釋成0.1mM(100倍終濃度的稀釋液)，并做3倍梯度稀釋，11個濃度。加藥時用緩沖液稀釋成4倍終濃度的稀釋液。激酶檢測：配制緩沖液后，將酶與預先稀釋配制的不同濃度化合物混合，室溫放置30分鐘，每個濃度雙復孔。加入對應底物及ATP，室溫反應60分鐘(其中設置陰陽性對照)。反應完畢加入抗體檢測，室溫孵育60分鐘后Evnvision檢測，采集數(shù)據(jù)。根據(jù)XLfit5軟件進行數(shù)據(jù)分析及擬圖。并采用克唑替尼作為對照品。IC50＝[(ABS測試-ABS開始)/(ABS對照-ABS開始)]x100實施實例中的激酶抑制作用結果如表1所示。表1實施例1～10與對照品克唑替尼的激酶抑制作用對比表實施例編號ALKWTIC50(nM)ALKL1196MIC50(nM)實施例1<20<20實施例2<20<20實施例3<20<20實施例4<20<20實施例5<20<20實施例6<20<20實施例7<20<20實施例8<20<20實施例9<20<20實施例10<20<20對照品克唑替尼<20>75如表1所示，同現(xiàn)有的ALK抑制劑克唑替尼比較，本發(fā)明化合物對ALKL1196M突變體表現(xiàn)出優(yōu)良的抑制活性(IC50小于20)，說明本發(fā)明化合物能夠對間變型淋巴瘤激酶(ALK)具有很強的抑制能力。(2)細胞毒性實驗采用四唑鹽(MTS)法檢測了對實施例1～10的化合物對腫瘤細胞的抑制作用，并以克唑替尼為對照品。實驗結果如表2所示。表2實施例1～10與對照品克唑替尼的細胞毒性實驗對比表實施例編號ALKWTIC50(nM)ALKL1196MIC50(nM)實施例1<20<50實施例2<20<50實施例3<20<50實施例4<20<50實施例5<20<20實施例6<20<20實施例7<20<20實施例8<20<20實施例9<20<20實施例10<20<20對照品克唑替尼>70>600如表2所示，同現(xiàn)有的ALK抑制劑克唑替尼比較，本發(fā)明化合物都表現(xiàn)出抑制表達ALK突變體L1196M癌細胞生長的優(yōu)良抗癌活性。(3)代謝穩(wěn)定性評價微粒體實驗：人肝微粒體：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒體：0.5mg/mL，Xenotech；輔酶(NADPH/NADH)：1mM，SigmaLifeScience；氯化鎂：5mM，100mM磷酸鹽緩沖劑(pH為7.4)。儲備液的配制：精密稱取一定量的實施例化合物，并用DMSO分別溶解至5mM。磷酸鹽緩沖液(100mM，pH7.4)的配制：取預先配好的0.5M磷酸二氫鉀150mL和700mL的0.5M磷酸氫二鉀溶液混合，再用0.5M磷酸氫二鉀溶液調節(jié)混合液pH值至7.4，使用前用超純水稀釋5倍，加入氯化鎂，得到磷酸鹽緩沖液(100mM)，其中含100mM磷酸鉀，3.3mM氯化鎂，pH為7.4。配制NADPH再生系統(tǒng)溶液(含有6.5mMNADP，16.5mMG-6-P，3U/mLG-6-PD，3.3mM氯化鎂)，使用前置于濕冰上。配制終止液：含有50ng/mL鹽酸普萘洛爾和200ng/mL甲苯磺丁脲(內標)的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5μL人肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。取25057.5μL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5μLSD大鼠肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。樣品的孵育：用含70％乙腈的水溶液將相應化合物的儲備液分別稀釋至0.25mM，作為工作液，備用。分別取398μL的人肝微粒體或者大鼠肝微粒體稀釋液加入96孔孵育板中(N＝2)，分別加入2μL0.25mM的的工作液中，混勻。代謝穩(wěn)定性的測定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL預冷的終止液，并置于冰上，作為終止板。將96孔孵育板和NADPH再生系統(tǒng)置于37℃水浴箱中，100轉/分鐘震蕩，預孵5min。從孵育板每孔取出80μL孵育液加入終止板，混勻，補充20μLNADPH再生系統(tǒng)溶液，作為0min樣品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系統(tǒng)溶液，啟動反應，開始計時。相應化合物的反應濃度為1μM，蛋白濃度為0.5mg/mL。分別于反應10、30、90min時，各取100μL反應液，加入終止板中，渦旋3min終止反應。將終止板于5000×g，4℃條件下離心10min。取100μL上清液至預先加入100μL蒸餾水的96孔板中，混勻，采用LC-MS/MS進行樣品分析。數(shù)據(jù)分析：通過LC-MS/MS系統(tǒng)檢測相應化合物及內標的峰面積，計算化合物與內標峰面積比值。通過化合物剩余量的百分率的自然對數(shù)與時間作圖測得斜率，并根據(jù)以下公式計算t1/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白濃度。對本發(fā)明化合物及其沒有氘代的化合物同時測驗比較，評價其在人與大鼠肝臟微粒體的代謝穩(wěn)定性。作為代謝穩(wěn)定性的指標的半衰期及肝固有清除率(Clint)如表3所示。表3中采用未經氘代的化合物AP26113作為對照樣品；所述AP26113為是現(xiàn)有技術的第三代ALK抑制劑，用于治療對克唑替尼耐受的轉移性ALK陽性非小細胞肺癌，其在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，對ALK陽性的非小細胞肺癌患者，包括腦轉移患者，AP26113均有持續(xù)性抗腫瘤活性。如表3所示，通過與未經氘代的化合物AP26113對照，本發(fā)明化合物可以顯著改善代謝穩(wěn)定性，進而更適于制備用于治療對克唑替尼耐受的轉移性ALK陽性非小細胞肺癌的藥物。表3實施例1～10與AP26113對照樣的代謝穩(wěn)定性對比表(4)大鼠中的藥代動力學評價6只雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周齡，體重約210g，分成2組，每組3只，經靜脈或口服單個劑量的化合物(經靜脈3mg/kg，口服10mg/kg)，比較其藥代動力學差異。大鼠采用標準飼料飼養(yǎng)，給予水。試驗前16小時開始禁食。藥物用PEG400和二甲亞砜溶解。眼眶采血，采血的時間點為給藥后0.083小時，0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時和24小時。大鼠吸入乙醚后短暫麻醉，眼眶采集300μL血樣于試管。試管內有30μL1％肝素鹽溶液。使用前，試管于60℃烘干過夜。在隨后一個時間點血樣采集完成之后，大鼠乙醚麻醉后處死。血樣采集后，立即溫和地顛倒試管至少5次，保證混合充分后放置于冰上。血樣在4℃5000rpm離心5分鐘，將血漿與紅細胞分離。用移液器吸出100μL血漿到干凈的塑料離心管中，表明化合物的名稱和時間點。血漿在進行分析前保存在-80℃。用LC-MS/MS測定血漿中本發(fā)明化合物的濃度。藥代動力學參數(shù)基于每只動物在不同時間點的血藥濃度進計算。實驗結果如下表4所示，相對于對照化合物AP26113，本發(fā)明中實施例2的化合物15的口服利用率(F)與對照化合物AP26113相當，但其半衰期延長，代謝穩(wěn)定性明顯提升；實施例1的化合物9的口服利用率大幅度提高(提高20％)，說明其在動物體內具有更好的藥物動力學。表4大鼠藥代動力學實驗應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則份數(shù)和百分比為重量份和重量百分比。以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3