本發(fā)明涉及一種運(yùn)用基因工程手段得到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Fungal immunomodulatory proteins,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為FIPs)具有增強(qiáng)免疫力等多種重要的生理功能。

FIPs最早是用食用菌類(lèi)提取而被發(fā)現(xiàn)的，但提取工藝復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高、得率低，很難開(kāi)發(fā)利用。雖然FIPs具有序列和結(jié)構(gòu)保守性，但是不同來(lái)源的FIPs活性和穩(wěn)定性差異很大。

通過(guò)基因工程方法從已完成基因組測(cè)序的真菌中獲得可開(kāi)發(fā)利用的新FIPs蛋白，既能豐富FIPs家族的種類(lèi)，更能為人類(lèi)健康的保健和治療提供新的免疫調(diào)節(jié)劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選到新的來(lái)源于真菌的免疫調(diào)節(jié)蛋白，使其能夠應(yīng)用于制備免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物。

本發(fā)明人通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選到一種來(lái)源于真菌Dichomitus squalens LYAD-421 SS1的免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2，發(fā)現(xiàn)其適合于在保健食品和醫(yī)藥中使用。

所述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2，全長(zhǎng)111個(gè)氨基酸，理論分子量為12.512kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

FIP-dsq2蛋白是一種新型的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明人通過(guò)將其氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)：FIP-dsq2蛋白與小孢靈芝、赤靈芝、紫靈芝和金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白GMI、FIP-gja、LZ-8和FIP-fve的序列同源性?xún)H分別為61.3％、60.4％、58.6％和51.8％。說(shuō)明FIP-dsq2是一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。

本發(fā)明還提供并合成了編碼上述真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的基因：通過(guò)一對(duì)引物FIP-dsq2-F(EcoRI)：5'-C CAA GAA TTC GTC GAC ACT TCC-3'和FIP-dsq2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG ATT CCA TTG AGC-3'，用基因合成的方法克隆了這一真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的基因，DNA全序列分析結(jié)果表明，fip-dsq2全長(zhǎng)336bp，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了包含蛋白FIP-dsq2基因的重組表達(dá)載體。方法是將本發(fā)明的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。優(yōu)選的表述載體是pGEX-6T-1。

作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，所述表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間是pGEX-6T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸表達(dá)載體pGEX-fip-dsq2。

將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌Rosetta，得到重組菌株Rosetta(pGEX-fip-dsq2)。

本發(fā)明還提供了包含真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株Rosetta(pGEX-fip-dsq2)。

本發(fā)明還提供了制備真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的方法，包括以下步驟：

1)將含F(xiàn)IP-dsq2基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2的表達(dá)；以及

3)回收并純化所表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。

經(jīng)腫瘤抑制、凋亡和遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)：FIP-dsq2蛋白對(duì)人肺腺癌腫瘤細(xì)胞A549具有明顯的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和阻止遷移的作用，可應(yīng)用于保健品和醫(yī)藥等工業(yè)(詳見(jiàn)實(shí)施例2～4)。

通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明提供的新的免疫調(diào)節(jié)蛋白的功能：

1、體外抗腫瘤活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FIP-dsq2對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有毒性作用，半致死計(jì)量IC₅₀為15.08μg/mL(圖2)；8μg/ml的不同來(lái)源的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)IP-dsq2對(duì)A549的毒性作用略弱于靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8，顯著高于金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve

結(jié)論：

FIP-dsq2對(duì)腫瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的高毒性作用，及具應(yīng)用潛力。(實(shí)施例3)

2、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FIPs對(duì)A549細(xì)胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve處理A549細(xì)胞24h后，凋亡率分別為20.71％、38.82％、10.88％(圖3)。

結(jié)論：

FIP-dsq2對(duì)腫瘤細(xì)胞A549具有凋亡作用，其誘導(dǎo)凋亡作用低于LZ-8，卻顯著高于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物(實(shí)施例4)。

3、抑制腫瘤細(xì)胞遷移檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

24h后，未處理細(xì)胞(NC)劃出傷口明顯愈合，8μg/ml的LZ-8處理后，傷口愈合現(xiàn)象不明顯；8μg/ml的FIP-dsq2處理后，傷口愈合現(xiàn)象較為顯著；而8μg/ml的FIP-fve處理A549細(xì)胞24h后，傷口愈合情況極為顯著，與陰性對(duì)照極為相似(圖4)。

結(jié)論：

FIP-dsq2可以抑制腫瘤細(xì)胞A549遷移，F(xiàn)IP-dsq2對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的遷移抑制作用略微差于LZ-8，卻顯著強(qiáng)于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物(實(shí)施例5)。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1、可以提供相當(dāng)數(shù)量的免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)FIP-dsq2純品，完全能滿足臨床與醫(yī)藥應(yīng)用需求。

FIP-dsq2在該大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，表達(dá)量為29mg/L(實(shí)施例2)；經(jīng)柱純化后，蛋白質(zhì)的含量達(dá)到電泳純(圖1)。而目前通常從幾千克食用菌中只能提取毫克級(jí)蛋白。

2、FIP-dsq2具有抗腫瘤活性，具有治療應(yīng)用潛力。

抗腫瘤效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)IP-dsq2對(duì)A549具有毒性作用(實(shí)施例3)，可以誘導(dǎo)A549凋亡(實(shí)施例4)，抑制A549遷移(實(shí)施例5)；其抗腫瘤效應(yīng)與靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8相當(dāng)，但顯著高于金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve，極具應(yīng)用潛力。

3、首次運(yùn)用基因工程手段提供了一個(gè)新的真菌來(lái)源的免疫調(diào)節(jié)蛋白。

由于運(yùn)用基因工程手段來(lái)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2產(chǎn)品還未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明首次提供了一個(gè)新的真菌來(lái)源的免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。而且，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。

附圖說(shuō)明：

圖1～圖4是對(duì)本發(fā)明純化制備的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2進(jìn)行分析和功能實(shí)驗(yàn)，其中：

圖1是SDS-PAGE分析純化的FIPs：其中，條帶1和4為蛋白marker，條帶2、3、5分別為純化的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8、金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve和Dichomitus squalens免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2。

圖2是FIP-dsq2蛋白抑制腫瘤細(xì)胞A549增殖結(jié)果。

圖3是FIP-dsq2蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞A549凋亡結(jié)果。

圖4是FIP-dsq2蛋白抑制腫瘤細(xì)胞A549遷移結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的方法，并不限制本發(fā)明的范圍。

試驗(yàn)材料

1、細(xì)胞株：人肺腺癌細(xì)胞A549，購(gòu)買(mǎi)于北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心。

2、試劑耗材

CCK試劑盒：全式金細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒；

TransDetct^TM Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit：全式金細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；

PCR引物合成和基因測(cè)序均由上海生工生物公司完成；

酶類(lèi)：內(nèi)切酶EcoRI和XhoI購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自Invitrogen公司；Prescission Protease由實(shí)驗(yàn)室制備；

儀器：離心機(jī)、振蕩搖床、顯微鏡、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀；

生化試劑：氨芐青霉素、青霉素(鈉鹽)、硫酸鏈霉素、溴酚蘭、噻唑蘭(MTT)、胎牛血清(FBS)，二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產(chǎn)品。

3、培養(yǎng)基

高糖DMEM培養(yǎng)液，加入10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，0.22μm濾膜過(guò)濾滅菌后4℃保存。

說(shuō)明：以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

本實(shí)施例中的抗腫瘤效應(yīng)檢測(cè)，均以靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(LZ-8)和金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-fve)為陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)施例1真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2編碼基因篩選、克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

以金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve為誘餌，在NCBI真菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，在擔(dān)子真菌Dichomitus squalens LYAD-421SS1基因組中發(fā)現(xiàn)與FIP-fve同源性為51.8％的FIP-dsq2編碼基因，基因全長(zhǎng)336bp(333bp外加一個(gè)終止密碼子TAA)，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。經(jīng)密碼子優(yōu)化后，合成基因。

設(shè)計(jì)并合成引物FIP-dsq2-F(EcoRI)：5'-C CAA GAA TTC GTC GAC ACT TCC-3'和FIP-dsq2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG ATT CCA TTG AGC-3'，用以上引物擴(kuò)增合成基因。用EcoRI和XhoI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得目標(biāo)基因fip-dsq2，將目標(biāo)基因連接到經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體pGEX-6T-1，獲得含有真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2基因的重組表達(dá)載體pGEX-fip-dsq2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，獲得重組菌株Rosetta(pGEX-fip-dsq2)。

實(shí)施例2真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2表達(dá)純化

取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Rosetta(pGEX-fip-dsq2)菌株，接種于20mL含有50μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm過(guò)夜活化。次日，以2％的接菌量，接種于200mL含有50μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)液中，37℃200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.8-1.0，加0.1mM IPTG，20℃200rpm過(guò)夜誘導(dǎo)16h后，離心收集菌體。0.2體積的PBS溶解菌體，超聲波破碎，離心收集上清。GST柱純化后，用100U/ml的Prescission Protease 4℃過(guò)夜酶切，去除GST標(biāo)簽。過(guò)Q柱和分子篩純化FIP-dsq2蛋白。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

經(jīng)以上表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FIP-dsq2蛋白的理論分子量為14.08KDa(包括部分載體序列和限制酶切位點(diǎn)翻譯氨基酸)；FIP-dsq2在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)量為29mg/L；經(jīng)柱純化后，蛋白質(zhì)的含量達(dá)到電泳純(圖1)。

結(jié)論：

FIP-dsq2在該大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，因此可以快速提供相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)純品，以滿足臨床與醫(yī)藥應(yīng)用需求。

實(shí)施例3CCK法測(cè)定真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2體外抗腫瘤活性

實(shí)驗(yàn)方法：

1)在DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞，計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，稀釋到終濃度為2.5×10⁵細(xì)胞/ml。

2)在96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入100μl腫瘤細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)24h后，分別加入100μl的重組蛋白樣品，終濃度為0、1、2、4、8、16、32和64μg/ml。同時(shí)加入相同方法制備的8μg/mL靈芝和金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8和FIP-fve做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品5個(gè)平行。

3)混勻后，放于5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

4)24小時(shí)后，CCK法檢測(cè)細(xì)胞活性(具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū))。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FIP-dsq2對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有毒性作用，半致死計(jì)量IC₅₀為15.08μg/mL(圖2)；8μg/ml的不同來(lái)源的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)IP-dsq2對(duì)A549的毒性作用略弱于靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8，顯著高于金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve。

結(jié)論：

FIP-dsq2對(duì)腫瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的高毒性作用，及具應(yīng)用潛力。

實(shí)施例4真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡分析

實(shí)驗(yàn)方法：

1)在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，使其終濃度為lx10⁶細(xì)胞/ml。

2)在6孔培養(yǎng)板中每孔加入0.8ml腫瘤細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)24h后，分別加入0.2ml終濃度為8μg/ml的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve，以正常生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞做陰性對(duì)照；在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

3)去上清，胰酶消化，3000rpm，室溫離心5分鐘，收集腫瘤細(xì)胞。凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡，具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FIPs對(duì)A549細(xì)胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve處理A549細(xì)胞24h后，凋亡率分別為20.71％、38.82％、10.88％(圖3)。

結(jié)論：

FIP-dsq2對(duì)腫瘤細(xì)胞A549具有凋亡作用，其誘導(dǎo)凋亡作用低于LZ-8，卻顯著高于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物。

實(shí)施例5真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2抑制腫瘤細(xì)胞遷移檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)方法：

4)在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，使其終濃度為5x10⁵細(xì)胞/ml。

5)在6孔培養(yǎng)板中加入上述腫瘤細(xì)胞懸浮液，在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞平鋪長(zhǎng)滿，用tip頭在培養(yǎng)板單層細(xì)胞中間劃線，PBS洗去懸浮細(xì)胞和碎片。

6)分別加入終濃度為8μg/ml的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-dsq2、LZ-8和FIP-fve，以正常生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞做陰性對(duì)照；在5％CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

7)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并拍照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

24h后，未處理細(xì)胞(NC)劃出傷口明顯愈合，8μg/ml的LZ-8處理后，傷口愈合現(xiàn)象不明顯；8μg/ml的FIP-dsq2處理后，傷口愈合現(xiàn)象較為顯著；而8μg/ml的FIP-fve處理A549細(xì)胞24h后，傷口愈合情況極為顯著，與陰性對(duì)照極為相似(圖4)。

結(jié)論：

FIP-dsq2可以抑制腫瘤細(xì)胞A549遷移，F(xiàn)IP-dsq2對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的遷移抑制作用略微差于LZ-8，卻顯著強(qiáng)于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物。