版權(quán)通知

按照37 C.F.R. 1.71(e)，申請(qǐng)人注意到，本公開(kāi)的一部分包含受到版權(quán)保護(hù)的材料（諸如但不限于圖、裝置照片或這個(gè)提案（其版權(quán)保護(hù)在任何管轄區(qū)中是或可能是可得到的）的任何其它方面。版權(quán)所有者不反對(duì)由專利文件或?qū)＠_(kāi)的任何人的傳真復(fù)制，因?yàn)樗趯＠虡?biāo)局專利文件或記錄中出現(xiàn)，但在其它方面無(wú)論如何保留所有版權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明在各種實(shí)施例中涉及用于使用微流控系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲行為或其它微小物體的有關(guān)行為的化驗(yàn)、系統(tǒng)和裝置。特別的實(shí)施例涉及可與各種標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)處理系統(tǒng)、與培養(yǎng)基的主動(dòng)或被動(dòng)裝載和灌注一起使用并提供用于分析細(xì)胞侵襲、移動(dòng)、趨化性或其它性質(zhì)的高吞吐量多化驗(yàn)自動(dòng)系統(tǒng)的配置。

技術(shù)背景

在這個(gè)提案（包括與本申請(qǐng)一起提交的任何文檔）中的任何地方對(duì)任何工作、公布物、銷(xiāo)售或活動(dòng)的討論不應(yīng)被理解為承認(rèn)任何這樣的工作構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。在本文中的任何活動(dòng)、工作或公布物的討論并不承認(rèn)這樣的活動(dòng)、工作或公布物在任何特別的管轄區(qū)中存在或是已知的。

微流控細(xì)胞培養(yǎng)是用于在藥物篩選、組織培養(yǎng)、毒性篩選和生物研究中的應(yīng)用的重要技術(shù)，并可提供改進(jìn)的生物功能、較高質(zhì)量基于細(xì)胞的數(shù)據(jù)、減少的試劑消耗和較低成本。高質(zhì)量分子和細(xì)胞樣品制備對(duì)各種臨床、研究和其它應(yīng)用是重要的。體外樣品（其接近地表示其體內(nèi)特性）可潛在地有益于寬范圍的分子和細(xì)胞應(yīng)用。細(xì)胞或其它生物上或化學(xué)上活性的材料（諸如涂覆有各種生物分子的珠子）的處理、特性化、培養(yǎng)和可視化在藥物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷和分析以及多種其它治療和實(shí)驗(yàn)工作方面變得日益受重視。

在上面引用的和有關(guān)的專利申請(qǐng)中討論了涉及微流控系統(tǒng)、裝置、方法和制造的很多方面。雖然從那些申請(qǐng)到本文中呈現(xiàn)的任何權(quán)利要求中不應(yīng)讀到特別的限制，但這些合并的文檔提供關(guān)于特定實(shí)施例的有用背景材料。

在細(xì)胞化驗(yàn)系統(tǒng)中的所感興趣的一個(gè)領(lǐng)域是能夠確定細(xì)胞遷移的特性的化驗(yàn)。這樣的化驗(yàn)在各種類型的惡性細(xì)胞的特性化中以及也在各種刺激下的其它細(xì)胞的特性化中是重要的。

已經(jīng)提出了使用微室或微流控學(xué)的一些化驗(yàn)。其它系統(tǒng)使用具有各種障礙插入物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板來(lái)試圖檢測(cè)細(xì)胞侵襲。然而當(dāng)前可用的系統(tǒng)關(guān)于對(duì)使用方便、高吞吐量或自動(dòng)應(yīng)用所必要的很多方面已經(jīng)是失敗的。

如上面引用的早些時(shí)候的工作和專利申請(qǐng)討論了與微流控細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的各種配置、方法和系統(tǒng)，且該工作和那些公布物通過(guò)引用被并入本文中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及與改進(jìn)的微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置和系統(tǒng)——特別是用于侵襲性或以其它方式新陳代謝或能動(dòng)細(xì)胞的培養(yǎng)和分析的系統(tǒng)——有關(guān)的各種部件、系統(tǒng)和方法。在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及具有優(yōu)于使用多培養(yǎng)室板或微流控結(jié)構(gòu)的前面提到的侵襲或遷移或移動(dòng)化驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)的新穎的微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置、系統(tǒng)和方法。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于將多個(gè)微流控細(xì)胞培養(yǎng)和/或細(xì)胞侵襲性化驗(yàn)單元集成到各種多細(xì)胞培養(yǎng)單元系統(tǒng)中，諸如到包括各種標(biāo)準(zhǔn)孔板格式（例如96孔SBS培養(yǎng)板或其它板格式，其包括具有6、12、24、96、384或1536樣品孔以及開(kāi)放底部標(biāo)準(zhǔn)孔板，從而允許附接到如在本文中所述的微流控結(jié)構(gòu)）的微量滴定孔板結(jié)構(gòu)中的新穎結(jié)構(gòu)和方法。

在特別的實(shí)施例和示例中，設(shè)計(jì)特征包括以常規(guī)格式提供侵襲化驗(yàn)裝置，其允許管道和到板本身的連接器的消除、使用被動(dòng)重力驅(qū)動(dòng)流來(lái)維持長(zhǎng)期連續(xù)灌注細(xì)胞培養(yǎng)的能力、對(duì)微流控板的出口孔和/或細(xì)胞侵襲觀察孔或培養(yǎng)孔執(zhí)行直接分析的能力、有效地處理凝膠培養(yǎng)培養(yǎng)基的能力。

雖然在本文中詳細(xì)討論的很多示例被設(shè)計(jì)成結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)或定制孔板來(lái)使用，但如本文中描述的各種配置的微流控結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)單元和系統(tǒng)和方法也可獨(dú)立于任何孔板（諸如在各種集成芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)中）被采用，實(shí)施集成芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)并不被配置成結(jié)合孔板或各種其它微流控裝置或系統(tǒng)來(lái)使用。

為了清楚的目的，這個(gè)討論在特定示例方面提及裝置、方法和概念。然而，本發(fā)明及其方面可應(yīng)用于各種類型的裝置和系統(tǒng)。因此意圖是本發(fā)明并不被限制，除了如在所附權(quán)利要求和等效形式中提供的。

此外，在本領(lǐng)域中公知的，諸如在本文中描述的系統(tǒng)和實(shí)施例可以以模塊化樣式包括多種不同的部件和不同的功能。本發(fā)明的不同實(shí)施例可包括元件和功能的不同混合，并可將各種功能分組為各種元件的部分。為了清楚的目的，在包括很多不同的創(chuàng)新部件和創(chuàng)新部件及已知部件的創(chuàng)新組合的系統(tǒng)方面描述了本發(fā)明。不應(yīng)推斷的是，將本發(fā)明限制到包含在本說(shuō)明書(shū)中的任何例證性實(shí)施例中列出的所有創(chuàng)新部件的組合。除非在本文中另有具體規(guī)定，本文中描述的元件的任何組合應(yīng)被理解為包括那些元件的任何子集的每個(gè)子組合以及還包括與本文中描述的任何其它元件組合的那些元件的任何子集的任何子組合，如本領(lǐng)域中的技術(shù)從業(yè)人員將理解的。

在下面的附圖和詳細(xì)描述中的一些中，在多部件裝置或系統(tǒng)的重要獨(dú)立實(shí)施例方面描述了本發(fā)明。這不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的各種新穎方面，其使用本文中提供的教導(dǎo)可應(yīng)用于很多其它情況。在下面的附圖和描述中的一些中，在包括與結(jié)構(gòu)的尺寸、液體的壓力或體積、溫度、電氣值、持續(xù)時(shí)間等有關(guān)的特定參數(shù)的很多特定的示例實(shí)施例方面描述了本發(fā)明。除了在所附權(quán)利要求中這樣提供的場(chǎng)合以外，這些參數(shù)作為示例被提供且不限制本發(fā)明，其包括具有不同尺寸的其它裝置或系統(tǒng)。為了提供更啟發(fā)性的描述的目的，特定已知的制作步驟、細(xì)胞處理步驟、試劑、化學(xué)或機(jī)械工藝和可被包括來(lái)根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例制成系統(tǒng)或制造裝置的其它已知部件作為示例被給出。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將理解，除了在本文中另有具體提到的以外，可在本文中描述的過(guò)程中做出各種已知的替代。

在這個(gè)提交中引用的所有參考、公布物、專利和專利申請(qǐng)由此為了所有目的通過(guò)引用被全部并入。

附圖說(shuō)明

本專利的文件包括以彩色執(zhí)行的至少一個(gè)附圖。具有彩色附圖的本專利的副本將在請(qǐng)求和支付必要的費(fèi)用時(shí)由美國(guó)專利和商標(biāo)局提供。

圖1（A）是根據(jù)特定實(shí)施例的示例微流控板設(shè)計(jì)的示意圖，在該示例中具有在96孔板上的24個(gè)侵襲化驗(yàn)單元，每個(gè)單元在該示例中包含4個(gè)孔：流入口、細(xì)胞/凝膠入口、侵襲室和流出口。（B）是示出根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的一個(gè)侵襲培養(yǎng)單元的細(xì)節(jié)的示意圖。

圖2是用從頂部（A）和底部（B）獲取的圖像圖示填充有藍(lán)色染料的示例單個(gè)流單元的照片，其中底部圖片通過(guò)在自上而下的方向上翻過(guò)板而被獲取，使得入口孔在兩個(gè)圖片中的左側(cè)。

圖3A-C是根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的在裝有凝膠以示出按梯度的侵襲化驗(yàn)操作和細(xì)胞遷移之后的侵襲室的區(qū)域的一系列顯微照片。

圖4A-B是示出根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的在化驗(yàn)系統(tǒng)和裝置中的按梯度的癌細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移的顯微照片。

圖5A-B圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的具有多個(gè)入口的示例細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)的配置和操作。

圖6A-C圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的示例大致矩形的細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)和梯度室設(shè)計(jì)的配置和操作。

圖7圖示用于微流控活細(xì)胞成像的示例定制板框架的機(jī)械附圖，并且其圖示了4個(gè)獨(dú)立的單元（例如行）、用于改進(jìn)的光學(xué)器件的大成像窗口、空氣進(jìn)入/出來(lái)口（例如相鄰于成像窗口）和在該示例中用來(lái)改進(jìn)歧管的真空密封的孔之間的擴(kuò)展空間。在該示例中，在具有2個(gè)出口孔（在該示例中，一個(gè)出口孔放大以容納更多的體積）的情況下存在每單元6個(gè)入口孔，。

圖8圖示根據(jù)特定實(shí)施例的針對(duì)每一個(gè)單元有三個(gè)流入口、成像窗口、細(xì)胞入口和流出口的2個(gè)培養(yǎng)單元板。

圖9圖示根據(jù)特定實(shí)施例的針對(duì)每一個(gè)單元有三個(gè)流入口、成像窗口、細(xì)胞入口和流出口的培養(yǎng)單元板的16單元版本。

圖10圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的具有氣體灌注線的示例板歧管的附圖。

圖11A-B是圖示根據(jù)特定實(shí)施例的具有四個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)單元的活性控制板的示例的示意圖和照片，每一個(gè)培養(yǎng)單元具有6個(gè)流入口、培養(yǎng)室和兩個(gè)流出口。

圖12A-C是圖示根據(jù)特定實(shí)施例的具有四個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)單元的進(jìn)一步的示例培養(yǎng)板的圖解，每一個(gè)培養(yǎng)單元具有可用于實(shí)踐在本文中描述的一個(gè)或多個(gè)方法的6個(gè)流入口、培養(yǎng)室和兩個(gè)流出口。

圖13圖示根據(jù)特定實(shí)施例的在暴露于穩(wěn)定梯度之后的細(xì)胞遷移的一個(gè)示例。

圖14作為示例圖示根據(jù)特定實(shí)施例的用來(lái)更好地說(shuō)明梯度對(duì)在微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞移動(dòng)的影響的示例X/Y細(xì)胞遷移繪圖。

圖15作為示例圖示根據(jù)特定實(shí)施例的作為在微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置中行進(jìn)的距離的函數(shù)的示例細(xì)胞遷移。

圖16作為示例圖示根據(jù)特定實(shí)施例示出在微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置中暴露于穩(wěn)定梯度的細(xì)胞比在穩(wěn)定培養(yǎng)基環(huán)境中的細(xì)胞移動(dòng)得更快的繪圖。

圖17圖示示出根據(jù)特定實(shí)施例的對(duì)梯度的暴露刺激細(xì)胞朝著高濃度匯點(diǎn)的主動(dòng)遷移的一個(gè)示例。

圖18A-C示出根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的示例歧管的示意圖的頂視圖、側(cè)視圖和平面視圖。在該示例中，右邊的八個(gè)管道線用于壓縮的空氣，且每一個(gè)管道線被配置成向微流控陣列中的一列細(xì)胞入口孔的提供壓力。在圖中最左邊的線用于真空并連接到在歧管周?chē)耐獠空婵窄h(huán)。孔的每一列一般連接到單個(gè)壓力線，其中在成像區(qū)之上的孔被跳過(guò)。

圖19圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的用于操作微流控板的示例系統(tǒng)和歧管。

圖20圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的具有附加的氣體線和物鏡并示出在連接到培養(yǎng)裝置的微流控板中的五個(gè)活性孔的歧管。

圖21是示出代表性示例邏輯裝置的方框圖，其中本發(fā)明的各種方面可被體現(xiàn)。

圖22（表1）圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的可被評(píng)估或者藥物或其它治療可針對(duì)其被測(cè)試的疾病、狀況或狀態(tài)的示例。

具體實(shí)施方式

1．概述

定義

“顆?！敝干锛?xì)胞，狀如哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞、病毒顆?；蛑|(zhì)體或根據(jù)本發(fā)明可受到化驗(yàn)的其它顆粒。這樣的顆粒具有在大約50-100 nm之間的最小尺寸，并可大至20微米或更大。當(dāng)用于描述根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞化驗(yàn)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“顆?！焙汀凹?xì)胞”可互換地使用。

“微通道”或“通道”或“流通道”通常指的是用于流體地連接根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的系統(tǒng)和裝置的各種部件的微米尺度通道。微通道通常具有矩形（例如正方形）或圓形橫截面，其中在優(yōu)選實(shí)施例中側(cè)邊和深度尺寸分別在10和500微米之間以及10和500微米之間。在微通道中流動(dòng)的流體可展示微流控行為。當(dāng)用于提及在本發(fā)明的微孔陣列裝置內(nèi)的微通道時(shí)，術(shù)語(yǔ)“微通道”和“通道”可互換地使用。“流通道”一般表示設(shè)計(jì)成使培養(yǎng)基、試劑或其它流體或凝膠和在一些實(shí)施例中細(xì)胞通過(guò)的通道?！芭囵B(yǎng)通道”或“細(xì)胞培養(yǎng)通道”一般表示細(xì)胞被設(shè)計(jì)成流經(jīng)的且也在細(xì)胞培養(yǎng)期間保留的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的一部分（雖然在一些實(shí)施例中細(xì)胞可位于培養(yǎng)通道的特別的培養(yǎng)區(qū)中）?！翱諝馔ǖ馈币话惚硎居糜谠试S氣體（諸如空氣、富含氧的混合物等）在流通道或培養(yǎng)區(qū)附近通過(guò)的大致微米尺度的通道?！肮嘧⑼ǖ馈庇袝r(shí)用于指示允許培養(yǎng)基灌注到培養(yǎng)區(qū)的流通道和任何灌注通路或結(jié)構(gòu)。

“障礙”或“擴(kuò)散障礙”或“灌注障礙”或“質(zhì)量轉(zhuǎn)移障礙”指的是實(shí)心結(jié)構(gòu)和比流通道小的通路的組合，其一般使流通道與細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)或室分離。通路一般比微通道高度和/或?qū)挾刃。ɡ绱蠹s5-50%或大約10%），且在一些實(shí)施例中被設(shè)計(jì)成防止細(xì)胞、其它培養(yǎng)物品和在一些實(shí)施例中的凝膠遷移到流通道中，同時(shí)允許通過(guò)擴(kuò)散、灌注或質(zhì)量轉(zhuǎn)移機(jī)制的任何組合的一些流體流動(dòng)，其一般具有比在流通道中的流體流動(dòng)高得多的流體阻力。在一個(gè)示例實(shí)施例中，障礙具有4微米高且以其它方式沿著微通道的大部分長(zhǎng)度延伸的通路。在其它實(shí)施例中，障礙具有大約與微流控通道一樣高但大約4微米寬的很多通路。障礙也可允許細(xì)胞或細(xì)胞成分穿過(guò)障礙或其它材料或小到足以穿過(guò)通路的顆粒的一些遷移。

“微流控裝置”指的是具有由微米尺度微通道連接的各種臺(tái)或孔的裝置，其中流體將在其穿過(guò)通道的流動(dòng)中展示微流控行為。

“微孔陣列”指在襯底上形成的兩個(gè)或更多的微孔的陣列。

“裝置”是廣泛用在本領(lǐng)域中的并包括寬范圍的意義的術(shù)語(yǔ)。例如在其最基本和最不復(fù)雜的水平處，“裝置”可簡(jiǎn)單地表示具有諸如通道、室和口的特征的襯底。在增加的復(fù)雜水平處，“裝置”還可包括圍繞所述特征的襯底或具有一致地或獨(dú)立地操作的微流控特征的其它層。在其最復(fù)雜的水平處，“裝置”可包括與促進(jìn)在外部世界和襯底的微流控特征之間的交互作用的對(duì)象配合的全功能襯底。這樣的對(duì)象可以被不同地稱為支持物、外殼、殼體或如下討論的類似術(shù)語(yǔ)。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“裝置”指的是上下文可指示的這些實(shí)施例或復(fù)雜水平中的任何一個(gè)。

如在本文中使用的元件或權(quán)利要求的“任何組合”指的是元件提及物或所提及的任何個(gè)別元件的組合。

微流控系統(tǒng)提供強(qiáng)大的工具來(lái)引導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)。最近，基于彈性體的微流控學(xué)由于其光學(xué)透明度、氣體滲透性和簡(jiǎn)單的制作方法而尤其獲得普及。然而，與最終用戶的接口要求穿過(guò)彈性體穿出的勞動(dòng)力密集的孔以及管道和注射器泵連接的附加步驟。

本發(fā)明涉及用于各種培養(yǎng)和化驗(yàn)應(yīng)用的集成微流控。本發(fā)明還涉及用于使用這樣的板使細(xì)胞培養(yǎng)自動(dòng)化的微流控和部件和系統(tǒng)的制造方法。特定實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板格式、無(wú)管道細(xì)胞培養(yǎng)和用于化驗(yàn)侵襲、遷移或趨化性細(xì)胞行為的仿生微環(huán)境的使用。

可使用用于處理標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和裝備來(lái)操作根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的系統(tǒng)（例如使用96孔標(biāo)準(zhǔn)板），如在本領(lǐng)域中公知的。例如，用標(biāo)準(zhǔn)吸移管機(jī)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)液體和/或凝膠或細(xì)胞分配，且可進(jìn)行與現(xiàn)有的培養(yǎng)箱和板閱讀器兼容的細(xì)胞培養(yǎng)和分析。

根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施例，新穎的細(xì)胞裝載系統(tǒng)使用氣動(dòng)歧管和氣動(dòng)壓力來(lái)將細(xì)胞放置在微培養(yǎng)區(qū)中。在添加這個(gè)細(xì)胞裝載系統(tǒng)的情況下，可使用存在來(lái)用于處理標(biāo)準(zhǔn)滴定板的其它自動(dòng)設(shè)備來(lái)完全自動(dòng)化微流控細(xì)胞培養(yǎng)和分析。

在另外的實(shí)施例中，重力驅(qū)動(dòng)流培養(yǎng)配置利用在入口和出口孔之間的培養(yǎng)基水平差以及設(shè)計(jì)流體阻力來(lái)實(shí)現(xiàn)在nL/min狀況中的期望流率。這提供能夠使培養(yǎng)基“被動(dòng)地”流動(dòng)長(zhǎng)時(shí)間段（例如多達(dá)4天）的顯著優(yōu)點(diǎn)，而不使用龐大的外部泵或管，其在侵襲化驗(yàn)的情況下允許在培養(yǎng)開(kāi)始之后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間段的分析的容易建立和侵襲化驗(yàn)結(jié)構(gòu)的容易讀取。

在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用來(lái)允許對(duì)粘附和/或侵襲或遷移細(xì)胞的長(zhǎng)期時(shí)間推移顯微鏡檢查的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的控制的微流控系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例，本發(fā)明提供了允許時(shí)間推移顯微鏡檢查實(shí)驗(yàn)和在其它化驗(yàn)當(dāng)中的細(xì)胞侵襲的檢查的多重微流控流體室。微流控室使用灌注障礙來(lái)分離細(xì)胞與流通道和侵襲障礙以研究在培養(yǎng)室和侵襲室之間的細(xì)胞的侵襲性質(zhì)。示例實(shí)施例被格式化到標(biāo)準(zhǔn)孔板，其允許液體和細(xì)胞/凝膠樣品使用標(biāo)準(zhǔn)裝備直接被吸移到適當(dāng)?shù)娜肟趦?chǔ)器中。

在一些實(shí)施例中，定制氣動(dòng)流控制器可用于將細(xì)胞裝載到培養(yǎng)區(qū)中以及在不同的暴露溶液之間切換。數(shù)字軟件接口可用于允許用戶對(duì)特定的輸入（脈沖、斜面等）隨著時(shí)間的編程以使細(xì)胞在時(shí)間推移成像期間暴露于復(fù)雜功能。

在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)響應(yīng)是用于現(xiàn)象（諸如生物信號(hào)處理、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、區(qū)分和細(xì)胞分裂）的基礎(chǔ)。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及能夠以與當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)方法兼容的多重格式控制細(xì)胞微環(huán)境的系統(tǒng)。可使用高放大率熒光顯微鏡來(lái)量化細(xì)胞響應(yīng)以得到具有子細(xì)胞分辨率的動(dòng)力學(xué)信息。這個(gè)能力在細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用，其中動(dòng)態(tài)單細(xì)胞響應(yīng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)前是不實(shí)際的。雖然根據(jù)特定實(shí)施例的一些侵襲化驗(yàn)實(shí)施例可使用在暴露于僅僅一個(gè)培養(yǎng)基/試劑混合物的情況下的大部分或完全被動(dòng)系統(tǒng)，可使用復(fù)雜的試劑調(diào)度利用如本文中所述的歧管來(lái)執(zhí)行根據(jù)特定實(shí)施例的其它侵襲化驗(yàn)。

2．微流控培養(yǎng)系統(tǒng)和陣列

上面提到的申請(qǐng)討論了多種不同的細(xì)胞培養(yǎng)配置和制作技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)的操作的部分和材料作為本討論的背景是有用的。在其中的一些示例中，一個(gè)或多個(gè)微培養(yǎng)區(qū)經(jīng)由流體通路的柵格（或擴(kuò)散入口或?qū)Ч埽┻B接到培養(yǎng)基或試劑通道，其中柵格包括多個(gè)交叉高流體阻力灌注通路。在一個(gè)所討論的示例中，柵格中的通路在高度上是大約1到4 μm、在長(zhǎng)度上是大約25到50 μm和在寬度上是大約5到10 μm，柵格允許在培養(yǎng)基或試劑通道和培養(yǎng)區(qū)之間的更均勻的擴(kuò)散，并允許更容易的制造和更均勻的擴(kuò)散。還討論了在微室和灌注/擴(kuò)散通路或柵格之間的高流體阻力比（例如在大約10:1、20:1到30:1的范圍內(nèi)的比）較早的申請(qǐng)?zhí)峁┘?xì)胞培養(yǎng)的很多優(yōu)點(diǎn)，諸如：（1）細(xì)胞的大小排除；（2）在微室內(nèi)部的細(xì)胞的定位；（3）促進(jìn)用于細(xì)胞生長(zhǎng)的統(tǒng)一流體環(huán)境；（4）配置微室或培養(yǎng)區(qū)的陣列的能力；（4）制作的容易，以及（5）沒(méi)有大規(guī)模閥網(wǎng)絡(luò)的試劑的操縱。圖示了示例，其中根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例，柵格狀灌注障礙可以比培養(yǎng)區(qū)短得多或可接近于相同的高度或在相同的高度處，且另外其中圖示了培養(yǎng)裝置的各種配置。

3．侵襲化驗(yàn)單元

在特定實(shí)施例中，本發(fā)明還包括用于3D癌細(xì)胞侵襲化驗(yàn)的微流控板。在特定的示例實(shí)現(xiàn)中，板使用具有由微流控通道連接的4個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)96孔板格式來(lái)創(chuàng)建每一個(gè)個(gè)別的流動(dòng)和侵襲化驗(yàn)單元（在特定實(shí)施例中每板具有例如24個(gè)單元）。在一些實(shí)施例中，流由如在本文中其它地方討論的毛細(xì)管力和重力驅(qū)動(dòng)，其在細(xì)胞和培養(yǎng)基的最初引入之后允許板在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中操作而沒(méi)有外部連接。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明的裝置將在3D凝膠中的細(xì)胞接收到培養(yǎng)室內(nèi)。培養(yǎng)室通過(guò)侵襲障礙與侵襲室分離，且這兩者都通過(guò)一組例如8x8微米橫截面微流控孔隙或通路（在本文中有時(shí)被稱為侵襲障礙）與流通道分離，因而模仿腫瘤侵襲的體內(nèi)環(huán)境。

圖1（A）是根據(jù)特定實(shí)施例的示例微流控板設(shè)計(jì)的示意圖，其在該示例中具有在96孔板上的24個(gè)侵襲化驗(yàn)單元的，每一個(gè)單元在該示例中包含4個(gè)孔：流入口、細(xì)胞/凝膠入口、侵襲室和流出口。在這個(gè)實(shí)施例中，在流入口、細(xì)胞/凝膠入口和流出口中的液體與微通道接觸。在侵襲室之上的孔為了更好的成像質(zhì)量而保持空。板的底表面是玻璃載玻片。每板有24個(gè)流單元（每一個(gè)單元是1孔乘4孔，在8x12孔板上形成8x3陣列）。

返回到圖1A-B所示的示意圖，該圖提供三個(gè)放大水平。在圖1A-B中被標(biāo)記為F7以指示在示例96孔板中的特別孔位置的最放大的區(qū)示出根據(jù)特定實(shí)施例的一個(gè)侵襲室的細(xì)節(jié)。這個(gè)侵襲化驗(yàn)/培養(yǎng)區(qū)可被理解為包括5個(gè)主要區(qū)域。

細(xì)胞/凝膠裝載通道被示出在圖的底部處。根據(jù)特定的實(shí)施例，混合在凝膠（例如基質(zhì)膠、膠原、纖維蛋白等）中的細(xì)胞通過(guò)毛細(xì)管流或使用如本文中所述的其它主動(dòng)或被動(dòng)裝載裝置被裝載到底部通道中。在操作中，通道被設(shè)計(jì)成使得凝膠填充裝載通道并且也填充侵襲障礙和侵襲室的部分或全部，但不通過(guò)灌注障礙。在一個(gè)示例實(shí)施例中，裝載通道在寬度上是550 μm且在高度上是50 μm。

根據(jù)特定實(shí)施例，裝載通道通過(guò)侵襲障礙與侵襲室分離。在特定的示例中，侵襲障礙由近似50x8x8μm（LxWxH）尺寸的通道的網(wǎng)絡(luò)組成。這些在一些實(shí)施例中是或變得填充有凝膠或液體，并模仿在組織中的內(nèi)皮障礙。侵襲癌細(xì)胞能夠穿過(guò)侵襲障礙的窄通道移動(dòng)到侵襲室內(nèi)。在該示例中的侵襲室在尺寸（LxWxH）上大約是4.8 x 0.5 x .05 mm，且用于對(duì)侵襲或從裝載通道遷移通過(guò)侵襲障礙的細(xì)胞的數(shù)量計(jì)數(shù)。在化驗(yàn)操作期間，在這個(gè)室中的細(xì)胞可通過(guò)手動(dòng)或自動(dòng)顯微鏡或其它裝置被計(jì)數(shù)并被量化以確定孔的侵襲索引。

灌注障礙在特定的實(shí)施例中是100x4x2 μm（LxWxH）的尺寸的通道的網(wǎng)絡(luò)，其分離侵襲室與流通道。窄橫截面防止細(xì)胞和凝膠穿過(guò)灌輸障礙。培養(yǎng)基（和在培養(yǎng)基中攜帶的藥物，包括化學(xué)引誘劑、染料或在侵襲化驗(yàn)中或在細(xì)胞培養(yǎng)中使用的其它材料）跨越灌注障礙擴(kuò)散并對(duì)侵襲細(xì)胞形成梯度，模仿在脈管系統(tǒng)中的腫瘤環(huán)境。

100x50 μm（WxH）流通道攜帶從流入口孔通過(guò)侵襲室的流體，并倒空到流出口孔。來(lái)自通過(guò)灌注障礙的流的營(yíng)養(yǎng)物的擴(kuò)散喂養(yǎng)細(xì)胞。這個(gè)通道刺激身體中的血流。在特定的示例實(shí)施例中，重力驅(qū)動(dòng)流率被設(shè)置到~20 μl/天，其允許大于3天的連續(xù)流實(shí)驗(yàn)而不重新填充孔。

如上陳述的，本文中提供的尺寸用于示例培養(yǎng)單元。根據(jù)各種特定的實(shí)施例，適合于特別的培養(yǎng)基或培養(yǎng)物品的任何尺寸可根據(jù)本文中提供的其它教導(dǎo)來(lái)使用。

4．侵襲化驗(yàn)板

根據(jù)特定的實(shí)施例，如上所述的侵襲化驗(yàn)單元被配置到標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)孔板中以允許多個(gè)侵襲化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的同時(shí)運(yùn)行。這些實(shí)驗(yàn)可包括單個(gè)對(duì)象——相同或不同的組織樣品——的多個(gè)化驗(yàn)、來(lái)自不同對(duì)象的多個(gè)化驗(yàn)，并可包括將細(xì)胞暴露于不同的培養(yǎng)基、激素或其它刺激物、藥物、化學(xué)引誘劑等的化驗(yàn)。

雖然示出在96孔板上的4孔化驗(yàn)單元，但不同的單元大小和不同的培養(yǎng)板大小也可體現(xiàn)本發(fā)明，如從本文中提供的討論和在有關(guān)的并入的申請(qǐng)中將是清楚的。

圖2是用從頂部（A）和底部（B）獲取的圖像圖示填充有藍(lán)色染料的示例單流單元的照片，其中底部圖片通過(guò)在自上而下的方向上翻過(guò)板而被獲取，使得入口孔都在兩個(gè)圖片中的左側(cè)。

5．示例操作

圖3A-C是根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的在裝有凝膠以示出按梯度的侵襲化驗(yàn)操作和細(xì)胞遷移之后的侵襲室的區(qū)域的一系列顯微照片。與熒光染料（紅色）混合的基質(zhì)膠通過(guò)毛細(xì)管流裝載到裝載通道中并在37C下聚合15分鐘。圖3A圖示侵襲室的40倍放大，其示出凝膠填充裝載通道、侵襲障礙和侵襲室的部分。圖3B示出侵襲障礙的200倍放大。聚合凝膠可在侵襲障礙內(nèi)部以及在侵襲室中被看到。圖3C示出灌注障礙的200倍放大，其示出凝膠不能越過(guò)窄通道網(wǎng)絡(luò)。如將從本文中的教導(dǎo)進(jìn)一步理解的，“凝膠”可具有在特定的實(shí)施例和特定的測(cè)試中降至流體粘度的各種粘度。在特定的實(shí)施例中，灌注障礙允許根據(jù)本發(fā)明使用較寬范圍的凝膠粘度。

圖4A-B是示出根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的在化驗(yàn)系統(tǒng)和裝置中的按梯度的癌細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移的顯微照片。在該示例中，HT-1080侵襲性人類胸癌細(xì)胞被裝載在3D基質(zhì)膠中并灌注有包含10%血清的培養(yǎng)基。圖4A示出緊接著在凝膠的裝載和聚合之后的細(xì)胞位于侵襲障礙的底側(cè)上。圖4B示出在用包含培養(yǎng)基的血清（HT-1080侵襲的已知信號(hào)）的灌注培養(yǎng)的24小時(shí)之后的細(xì)胞，細(xì)胞中的一些細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠和侵襲障礙遷移以占據(jù)侵襲室。在40倍放大下用相襯獲取圖像。

在另外的實(shí)施例中，各種策略可用于移除在侵襲室中的所有細(xì)胞中的一些細(xì)胞，以進(jìn)行另外的分析。根據(jù)特定的實(shí)施例，本發(fā)明還通過(guò)在維持細(xì)胞的侵襲室中提供培養(yǎng)環(huán)境來(lái)促進(jìn)此，直到它們被移除。

在另外的實(shí)施例中，可通過(guò)如在本文中其它地方描述的空氣通路和氣孔來(lái)促進(jìn)穿過(guò)限定微流控通道（諸如硅酮彈性體聚二甲基硅氧烷（PDMS））結(jié)構(gòu)的材料進(jìn)入培養(yǎng)區(qū)中的空氣擴(kuò)散。

如在其它地方討論的，可對(duì)如上所述的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)進(jìn)行各種修改。各種配置對(duì)灌注障礙（諸如柵格狀通路結(jié)構(gòu)）是可能的。對(duì)于具有本文中提供的教導(dǎo)的本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將暗示其它變化。

上面公開(kāi)的結(jié)構(gòu)也可適于使用在標(biāo)準(zhǔn)微量滴定孔板或完全定制或部分定制的板上的更多或更少的孔的系統(tǒng)，諸如在所引用的文檔中和在本文中的其它示例中描述的系統(tǒng)。

如在本文中所述的板和系統(tǒng)可與如在上面引用的專利申請(qǐng)中描述的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)和侵襲室及微流控流結(jié)構(gòu)的其它配置一起使用。在一個(gè)修改的設(shè)計(jì)中，所提供的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)是本質(zhì)上矩形的細(xì)胞培養(yǎng)室。細(xì)胞培養(yǎng)室具有在右邊的細(xì)胞入口和出口通路，以及在右邊的流出口。在該示例中，細(xì)胞通路是成對(duì)的，其中中心對(duì)用于細(xì)胞流裝載，而在任一側(cè)上的對(duì)用作細(xì)胞流出口。

一旦細(xì)胞被裝載，在任何侵襲性細(xì)胞有足夠的時(shí)間來(lái)穿過(guò)侵襲障礙移動(dòng)之后，侵襲化驗(yàn)就如上面概述的繼續(xù)進(jìn)行。

圖5A-B圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的具有多個(gè)入口的示例細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)的配置和操作。該示例包括具有交叉艙口灌注通路設(shè)計(jì)的細(xì)胞/凝膠灌注障礙和如上面討論的侵襲障礙。交叉艙口設(shè)計(jì)允許在凝膠基質(zhì)中的細(xì)胞流到室中并允許培養(yǎng)基的灌注。雖然交叉艙口灌注障礙目前在一些設(shè)計(jì)中是優(yōu)選的，但根據(jù)特定的實(shí)施例也實(shí)現(xiàn)具有不同的灌注障礙或沒(méi)有灌注障礙的培養(yǎng)室。在培養(yǎng)基的通道周?chē)牧靼ㄔ谡系K的同一側(cè)上的出口和入口。圖5A圖示一般實(shí)施例，其中出口和入口開(kāi)口被示出在右邊。圖5B圖示左邊的入口通道和右邊的出口通道，該配置在使用如本文中所述的孔板的一些示例系統(tǒng)中更適合。該圖還提供根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的樣品設(shè)計(jì)的詳細(xì)示例尺寸。因此在另外的實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)室被修改以允許在3D凝膠基質(zhì)中的細(xì)胞的更容易培養(yǎng)。在這個(gè)設(shè)計(jì)中，灌注障礙分離如所示的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)和流通道。障礙被設(shè)計(jì)成將3D凝膠保持在培養(yǎng)室中。使障礙與上面描述的3通道細(xì)胞/凝膠入口設(shè)計(jì)耦合是提供改進(jìn)的性能的重要特征。通過(guò)在障礙的每一側(cè)上具有分開(kāi)的流入口/出口，可能將流體凝膠定位在培養(yǎng)室中，且不使它堵塞流通道。

如上所述的侵襲障礙被放置在由圖中的虛線指示的區(qū)域中，并用于使細(xì)胞進(jìn)入和培養(yǎng)室與侵襲室分離，如從本文中的教導(dǎo)中將理解的。在替換的實(shí)施例中，可提供灌注通道，使得它們只相鄰于侵襲室。

如在其它地方討論的，在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了例如使用溫度敏感凝膠培養(yǎng)基質(zhì)（諸如Matrigel?、Geltrex?、骨膠原等）的生物細(xì)胞培養(yǎng)和侵襲化驗(yàn)的3D凝膠環(huán)境。示例凝膠在4C下是液體，其例如在室溫或37C下聚合。在一個(gè)示例方法中，細(xì)胞最初與在冰上的細(xì)胞懸浮液混合。溶液然后被吸移到細(xì)胞入口孔中，并經(jīng)由毛細(xì)管流被運(yùn)送到微流控室以及培養(yǎng)和侵襲室中。在特定的示例中，板被保持在室溫下。流率允許足夠的細(xì)胞/凝膠溶液在聚合之前完全填充培養(yǎng)室，同時(shí)細(xì)胞在流體流動(dòng)期間由于侵襲通路的大小而不進(jìn)入侵襲室中。灌注障礙防止任何凝膠溶液漏到流通道中。當(dāng)凝膠變暖時(shí)，它聚合到半固體質(zhì)量中，其中細(xì)胞被嵌入培養(yǎng)區(qū)中。在流通道中的培養(yǎng)基的流通過(guò)侵襲室并通過(guò)凝膠擴(kuò)散到細(xì)胞培養(yǎng)室中，并滋養(yǎng)細(xì)胞以進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)為侵襲性細(xì)胞提供引誘劑以穿過(guò)侵襲障礙移動(dòng)到侵襲室。這個(gè)新穎設(shè)計(jì)允許本發(fā)明提供在微流控裝置中的3D凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)，同時(shí)避免使凝膠堵塞流通道的問(wèn)題。

在圖5B所示的示例中，藍(lán)色區(qū)指示空氣流，并且是可選的且不存在于所有實(shí)施例中?；疑珔^(qū)指示具有大約40 μm的示例高度的流通道，紅色區(qū)指示具有大約200 μm的示例高度的細(xì)胞培養(yǎng)和侵襲區(qū)，且綠色區(qū)指示具有大約2 μm的示例高度的灌注障礙。黃色侵襲障礙一般具有與培養(yǎng)區(qū)（例如200 μm）相同的高度或相似的高度，但將具有如上所述的侵襲障礙結(jié)構(gòu)。

一旦細(xì)胞被裝載，在任何侵襲性細(xì)胞有足夠的時(shí)間穿過(guò)侵襲障礙移動(dòng)之后，侵襲化驗(yàn)就如上概述的繼續(xù)進(jìn)行。

3D凝膠系統(tǒng)

在有時(shí)在本文中被稱為3D:M的一個(gè)示例系統(tǒng)中，可在3D凝膠基質(zhì)中執(zhí)行細(xì)胞的多重灌注成像。示例板包含可裝有如用戶選擇的細(xì)胞/凝膠的24個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)單元。在示例系統(tǒng)中，板的每一行（A-H）包含3個(gè)完全獨(dú)立的流單元（每一個(gè)流單元有4個(gè)孔），其由培養(yǎng)基入口（例如列1、5、9）、細(xì)胞培養(yǎng)/侵襲/成像孔（例如列2、6、10）、細(xì)胞/凝膠入口（列3、7、10）和出口（列4、8、12）組成。空氣擴(kuò)散通道（藍(lán)色）向細(xì)胞提供氣體轉(zhuǎn)移。入口被設(shè)計(jì)成允許培養(yǎng)基經(jīng)由重力驅(qū)動(dòng)過(guò)程以40 μl/天連續(xù)流到細(xì)胞。在該示例中，每一個(gè)室在大小上是1.5 x 0.5 mm，具有200 μm的高度。灌注障礙確保通過(guò)凝膠基質(zhì)的均勻營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)移，且薄覆蓋玻璃底部（170 μm）允許最佳成像質(zhì)量。侵襲障礙提供在培養(yǎng)區(qū)域和侵襲區(qū)域之間的分離?？扇缭谏厦婧驮诓⑷氲膮⒖贾兴龅膱?zhí)行在這樣的系統(tǒng)中的3D凝膠裝載。

如在本文中的其它地方討論的，各種新穎微流控細(xì)胞培養(yǎng)室和相關(guān)聯(lián)的微流控結(jié)構(gòu)中的任何一個(gè)可根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例與孔滴定板裝置集成，如通常在宏細(xì)胞培養(yǎng)化驗(yàn)中使用的。下面提供了很多特定的示例，雖然本發(fā)明包括用于與微流控裝置集成的其它系統(tǒng)。

在這個(gè)設(shè)計(jì)中，每一個(gè)培養(yǎng)單元由4個(gè)孔位置組成。第一孔用于灌注培養(yǎng)基，第二孔用于細(xì)胞入口，第三孔用于使微流控室成像，且第四孔是出口。細(xì)胞障礙/灌注通道將細(xì)胞定位到細(xì)胞區(qū)，并在連續(xù)灌注培養(yǎng)期間改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物運(yùn)輸。細(xì)胞入口到出口路徑的低流體阻力使細(xì)胞能夠經(jīng)由重力或表面張力方法被快速裝載，而沒(méi)有外部細(xì)胞裝載機(jī)制。灌注入口流通道的高流體阻力允許經(jīng)由重力流的培養(yǎng)基的長(zhǎng)期連續(xù)灌注，而沒(méi)有任何外部泵機(jī)制。侵襲障礙操作以使經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞與侵襲區(qū)域分離，以進(jìn)行侵襲化驗(yàn)。

在示例特定系統(tǒng)中，細(xì)胞室被設(shè)計(jì)成模仿空隙組織環(huán)境，其中細(xì)胞被嵌入或覆蓋在生理細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中，并經(jīng)由擴(kuò)散從連續(xù)灌注的毛細(xì)管通道被饋送。細(xì)胞微環(huán)境使得能夠進(jìn)行在例如200微米厚凝膠層中的長(zhǎng)期生長(zhǎng)。氧合通道維持足夠的氣體運(yùn)輸，且玻璃蓋玻片底部允許高質(zhì)量細(xì)胞成像。標(biāo)準(zhǔn)布局允許高級(jí)微流控單元恰好像典型96孔板一樣操作。重力驅(qū)動(dòng)灌注設(shè)計(jì)消除了對(duì)泵或管道連接的需要，如上所述。

在示例系統(tǒng)中，每單元細(xì)胞的預(yù)期數(shù)量是大約500個(gè)細(xì)胞。示例灌注速率對(duì)于單個(gè)單元是40 ul/天。細(xì)胞室體積是150 nL，且室尺寸是1.5x0.5x0.2 mm。氣體擴(kuò)散膜是具有底表面#1.5厚度蓋玻片的50 um硅酮。

用于連續(xù)灌注的開(kāi)放頂部微流控細(xì)胞培養(yǎng)室也可使用使侵襲區(qū)與培養(yǎng)區(qū)分離的第二障礙被修改。

6．示例梯度培養(yǎng)室

圖6A-C圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的示例大致矩形的細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)和梯度室設(shè)計(jì)的配置和操作。在示例設(shè)計(jì)中，所提供的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)是本質(zhì)上矩形的細(xì)胞培養(yǎng)室。如在圖6A和圖6B中圖示的細(xì)胞培養(yǎng)室具有在右邊示出的細(xì)胞入口和出口通路E2以及也在右邊示出的流出口E1。在該示例中，細(xì)胞通路是成對(duì)的，其中中心對(duì)用于細(xì)胞流裝載，且在任一側(cè)上的對(duì)用作細(xì)胞流出口。多個(gè)分離的流入口被示出在左邊，被標(biāo)記為A1、A2、B1、B2、C1、C2，且在這個(gè)示例設(shè)計(jì)中流入口具有柵格圖案以防止被細(xì)胞堵塞?？諝鈹U(kuò)散通道被示為圍繞室。出口E1提供部分地與培養(yǎng)室隔離的流體流的出口。

圖6B圖示如圖6A所示的培養(yǎng)單元的細(xì)胞裝載。細(xì)胞經(jīng)由低阻力流體路徑（具有流動(dòng)路徑中的較高阻力）被裝載。細(xì)胞通過(guò)阻力比（細(xì)胞優(yōu)先流到細(xì)胞出口而不是流通道）被防止堵塞流路徑。在這個(gè)特別的實(shí)施例中的通道被布置成使得細(xì)胞進(jìn)入和細(xì)胞出來(lái)通道在室的右側(cè)上。這導(dǎo)致唯一的特征，其中細(xì)胞的流進(jìn)入室內(nèi)，進(jìn)行180度轉(zhuǎn)彎，并流出來(lái)，如由圖6B所示的從細(xì)胞進(jìn)入到細(xì)胞出來(lái)通路的急劇彎曲的流線圖示的。因此，根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例，細(xì)胞從一個(gè)或多個(gè)中心右通道被裝載（經(jīng)由毛細(xì)管力）并從頂部和底部右通道出來(lái)。非常少量的流朝著側(cè)出口通道被引導(dǎo)（圖6B所示的較長(zhǎng)的較不彎曲的流線在室的左邊緣退出）。側(cè)流對(duì)于細(xì)胞裝載不是重要的，但用來(lái)幫助將細(xì)胞更均勻地分布在室中。由于流的低粘度，細(xì)胞自然停在室地面上，而不需要任何物理障礙。細(xì)胞出口路徑幫助使裝載變得對(duì)稱，以及增加裝載到室內(nèi)的細(xì)胞的數(shù)量。這個(gè)裝載機(jī)制可用于裝載細(xì)胞、微粒、珠子、凝膠、具有細(xì)胞的凝膠等。

圖6C示出諸如在圖6A-B中的設(shè)計(jì)的使用以在根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)計(jì)中建立穩(wěn)定的梯度。圖6C中的示例設(shè)計(jì)只稍微不同于圖6A-B的設(shè)計(jì)，且對(duì)本文中的這兩種設(shè)計(jì)之一描述的操作模式應(yīng)用于其它設(shè)計(jì)。在圖6C的示例中，細(xì)胞通路是不成對(duì)的。三個(gè)不成對(duì)的流入口被示出在左邊，且這些也具有柵格圖案來(lái)防止被細(xì)胞堵塞。空氣擴(kuò)散通道一般被放置在室附近，雖然沒(méi)有在這個(gè)圖中示出。圖6C還圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例在如上所述的微流控裝置中通過(guò)使2（或更多）種溶液流動(dòng)來(lái)在培養(yǎng)室中創(chuàng)建梯度。

7．活動(dòng)控制灌注板

圖7圖示用于微流控活細(xì)胞成像的示例定制板框架的機(jī)械附圖，并且其圖示了4個(gè)獨(dú)立的單元（例如行）、用于改進(jìn)的光學(xué)器件的大成像窗口、空氣進(jìn)入/出來(lái)口（例如相鄰于成像窗口）和在該示例中用來(lái)改進(jìn)歧管的真空密封的孔之間的擴(kuò)展空間。在該示例中，在具有2個(gè)出口孔（在該示例中，一個(gè)出口孔放大以容納更多的體積）的情況下存在每單元6個(gè)入口孔，。

圖8圖示根據(jù)特定實(shí)施例的每單元有三個(gè)流入口、成像窗口、細(xì)胞入口和流出口的2個(gè)培養(yǎng)單元板。

圖9圖示根據(jù)特定實(shí)施例的每單元有三個(gè)流入口、成像窗口、細(xì)胞入口和流出口的培養(yǎng)單元板的16單元版本。

圖10圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的具有氣體灌注線的示例板歧管的附圖。

圖11A-B是圖示根據(jù)特定實(shí)施例的具有四個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)單元的活性控制板的示例的示意圖和照片，每一個(gè)培養(yǎng)單元具有6個(gè)流入口、培養(yǎng)室和兩個(gè)流出口。圖11A示出具有4個(gè)獨(dú)立流單元（板的行）的板設(shè)計(jì)，其具有6個(gè)入口溶液、開(kāi)放室或其它培養(yǎng)室、出口和重力流通道。圖11B示出四個(gè)開(kāi)放室（綠色圓圈），其具有在開(kāi)放室之上的入口流和之下的出口流。該設(shè)計(jì)允許流從入口通傳遞到出口通道，而沒(méi)有溢出開(kāi)放室。多個(gè)液體或試劑入口的可用性提供對(duì)活細(xì)胞成像和在細(xì)胞生物學(xué)中的其它實(shí)驗(yàn)和化驗(yàn)特別好的系統(tǒng)。在這樣的系統(tǒng)中，研究可研究胰臟或其它器官細(xì)胞或癌細(xì)胞的培養(yǎng)，以確定它們?nèi)绾螌?duì)不同的藥物或經(jīng)由入口引入的其它刺激物做出響應(yīng)。在這個(gè)設(shè)計(jì)的特定實(shí)施例中，重力孔也提供來(lái)在實(shí)驗(yàn)被執(zhí)行之前促進(jìn)維持（例如喂養(yǎng)）細(xì)胞。板可被密封到氣動(dòng)歧管，從而允許對(duì)6個(gè)入口溶液的壓力驅(qū)動(dòng)控制。這允許實(shí)驗(yàn)，其中溶液在細(xì)胞上快速改變。由于在入口和培養(yǎng)室之間的大阻力區(qū)域，高達(dá)10 PSI的壓力驅(qū)動(dòng)流是可能的，從而導(dǎo)致在室附近的小于輸入壓力的1/1000的壓力。

圖圖示了具有4個(gè)獨(dú)立單元（行）、6個(gè)上游入口（A1-A6、B1-B6、C1-C6、D1-D6）、帶有四個(gè)培養(yǎng)室的中央成像窗口、大出口孔（橢圓形，A7、B7、C7、D7）和重力灌注孔（最后一列，A8、B8、C8、D8）的活性控制板的布局。

圖12A-C是圖示根據(jù)特定實(shí)施例的具有四個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)單元的另一示例培養(yǎng)板的圖，每一個(gè)培養(yǎng)單元具有可用于實(shí)踐在本文中描述的一個(gè)或多個(gè)方法的6個(gè)流入口、培養(yǎng)室和兩個(gè)流出口。在2010年6月首次銷(xiāo)售的這個(gè)板具有4個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)室（例如A-D），每一個(gè)培養(yǎng)室具有重力流入口（1）、四個(gè)溶液入口（2-5）、細(xì)胞入口（6）和兩個(gè)共享出口孔（7和8）。如在孔的每一行（A-D）中處理對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)室。（b）所有四個(gè)培養(yǎng)室位于單個(gè)成像窗之下以最小化高放大相物鏡的行進(jìn)距離。（c）室由在頂部和底部邊緣上的灌注障礙約束以分離室與流通道。入口孔2和3使培養(yǎng)基流到上通道中，而4和5使培養(yǎng)基流經(jīng)下通道。通過(guò)使不同成分的培養(yǎng)基同時(shí)流經(jīng)上和下通道來(lái)建立梯度。由于連續(xù)灌注，穩(wěn)定的梯度可被維持延長(zhǎng)的時(shí)間段（> 2天）。

8．應(yīng)用注解，在微流控培養(yǎng)裝置中的穩(wěn)定梯度中的細(xì)胞遷移

一般，細(xì)胞遷移通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、相鄰細(xì)胞或化學(xué)引誘劑的交互作用而被引導(dǎo)和刺激。在胚胎形成期間，細(xì)胞遷移參與范圍從原腸形成到神經(jīng)發(fā)育的幾乎所有的形態(tài)成因過(guò)程。在成人有機(jī)體中，細(xì)胞遷移有助于生理和病理疾病，并且對(duì)影響傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移的治療學(xué)的發(fā)展是重要的。最終，可通過(guò)分析對(duì)遷移調(diào)節(jié)劑（抑制劑或活化劑）的細(xì)胞響應(yīng)來(lái)理解遷移的機(jī)制。因此，用于遷移細(xì)胞的量化和可視化的技術(shù)對(duì)生命科學(xué)研究已經(jīng)變得重要。

最廣泛接受的細(xì)胞遷移化驗(yàn)是使用兩室多孔板的博伊登（Boyden）室化驗(yàn)，其中在每一個(gè)孔中的膜提供在兩個(gè)室之間的多孔界面?；瘜W(xué)引誘劑被放置在下室中，且系統(tǒng)被允許平衡，其中期望的是，梯度將在上孔和下孔之間形成。然而實(shí)際上，非常陡的梯度可沿著垂直于膜的表面的單軸形成，導(dǎo)致在上孔和下孔之間的化學(xué)引誘劑濃度中的低于預(yù)期的差異。作為結(jié)果，該方法不適合于使特定的細(xì)胞響應(yīng)與特別的梯度特性（即，斜率、濃度、時(shí)間發(fā)展等）相關(guān)且不適合于研究多梯度信號(hào)積分。此外，梯度在“靜止”細(xì)胞培養(yǎng)狀況下不是非常穩(wěn)定的，從而阻止活細(xì)胞成像。

根據(jù)特定的實(shí)施例，諸如在上面的圖中示出的細(xì)胞培養(yǎng)室或系統(tǒng)還可用于創(chuàng)建在數(shù)天的過(guò)程期間對(duì)長(zhǎng)期活細(xì)胞成像足夠穩(wěn)定的在數(shù)量上限定的擴(kuò)散梯度。根據(jù)本文中描述的特定實(shí)施例和方法的板的這樣的微流控梯度培養(yǎng)室使得在整個(gè)灌注障礙上的精度控制的化學(xué)引誘劑擴(kuò)散能夠在培養(yǎng)區(qū)中創(chuàng)建空間梯度。

根據(jù)特定的實(shí)施例，培養(yǎng)室的流入口和出口形成維持穩(wěn)定的濃度梯度分布幾天的連續(xù)流“無(wú)限源/匯點(diǎn)”。在上面的示例系統(tǒng)中的一些示例系統(tǒng)中，在梯度方向性中的改變開(kāi)啟和關(guān)閉梯度并在梯度和單個(gè)溶液暴露之間切換是可能的。

根據(jù)另外的實(shí)施例，在穩(wěn)定的化學(xué)引誘劑梯度上的長(zhǎng)期活細(xì)胞成像可用于研究惡性細(xì)胞或能夠移動(dòng)或遷移的其它細(xì)胞。在下面討論的很多示例中，根據(jù)特定實(shí)施例的血清梯度對(duì)轉(zhuǎn)移性胸癌細(xì)胞遷移距離、速度和趨化性程度的影響被詳細(xì)地表征。

血清梯度對(duì)轉(zhuǎn)移性胸癌細(xì)胞遷移距離、速度和趨化性程度的影響

在一個(gè)示例實(shí)驗(yàn)中，MDA-MB-231 (HTB-26?, ATCC?)、從轉(zhuǎn)移性胸膜溢出部位得到的人類胸癌系被維持在完全培養(yǎng)基（用1O°/ov/v胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（全EMD微孔）補(bǔ)充的杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM））中，并通過(guò)胰蛋白酶消化（TrypLE?Select, GIBCO）常規(guī)地傳代以確保對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞被胰蛋白酶化、通過(guò)離心法被收獲并在完全培養(yǎng)基中重新懸浮。10 uL的每一個(gè)細(xì)胞樣品與190 uL的guava ViaCount?試劑（EMD微孔）混合并在室溫（RT）下培養(yǎng)5分鐘。樣品數(shù)據(jù)在guava easyCyte? HT儀器上被獲取并使用guava ViaCount?軟件（EMD微孔）被分析。

圖13圖示根據(jù)特定實(shí)施例的在暴露于穩(wěn)定梯度之后的細(xì)胞遷移的一個(gè)示例。在這個(gè)特定的示例中，示出在使用上面描述的多個(gè)梯度培養(yǎng)室之一暴露于穩(wěn)定的FBS梯度之后的MDA-MB-231細(xì)胞遷移。這個(gè)示例示出來(lái)自細(xì)胞室的代表性圖像（10倍放大率），其中細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中被培養(yǎng)并暴露于沿著Y軸（垂直平面）建立的0-10% FBS梯度。頂面板包含在細(xì)胞裝載之后24小時(shí)捕獲的圖像。中間面板示出裝載后96小時(shí)的細(xì)胞；培養(yǎng)時(shí)間在完全培養(yǎng)基中分成三天，后面是24小時(shí)的血清饑餓（無(wú)FBS）。從圖像中明顯的是，細(xì)胞膨脹和移動(dòng)都在三天間隔期間出現(xiàn)。在底面板中的圖像在梯度引入之后12小時(shí)被獲取。

圖13示出在三天的過(guò)程中響應(yīng)于FBS梯度的單MDA-MB-231細(xì)胞的遷移。細(xì)胞膨脹和移動(dòng)都在頂部行和中間行之間在三天間隔期間出現(xiàn)。在底面板中的圖像在梯度引入后12小時(shí)被獲取。一般，對(duì)于暴露于FBS梯度的那些培養(yǎng)物，存在細(xì)胞沿著Y軸朝著細(xì)胞室的上部障礙的明顯移動(dòng)。相反，在沒(méi)有空間血清梯度時(shí)培養(yǎng)的控制細(xì)胞以多得多的隨機(jī)方向性質(zhì)展示較少的移動(dòng)。在中間和底面板中的框（編號(hào)為1-8）用于識(shí)別特定的細(xì)胞并展示它們?cè)?2小時(shí)時(shí)間幀內(nèi)的總移動(dòng)?？偟膩?lái)說(shuō)，暴露于FBS梯度的細(xì)胞傾向于優(yōu)先朝著較高的FBS濃度的源移動(dòng)。

圖14作為示例圖示根據(jù)特定實(shí)施例的用來(lái)更好地說(shuō)明梯度對(duì)在微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞移動(dòng)的影響的示例X/Y細(xì)胞遷移繪圖。在該示例中，該繪圖是用來(lái)圖示在微流控培養(yǎng)單元中的穩(wěn)定梯度（例如在MDA-MB-231上的FBS梯度）對(duì)細(xì)胞移動(dòng)的影響的X/Y遷移繪圖。在這個(gè)特定示例中示出的是四個(gè)繪圖：（a）0/0 FBS（無(wú)梯度），（b）10/10 FBS（無(wú)梯度），（c）10/0 FBS（底部到頂部梯度），以及（d）0/10 FBS（頂部到底部梯度）。對(duì)于這個(gè)特別的示例，每一個(gè)數(shù)據(jù)集合從來(lái)自單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室的50個(gè)代表性細(xì)胞得到，對(duì)于時(shí)間推移視頻（12小時(shí)）的最初36個(gè)圖像幀，這50個(gè)代表性細(xì)胞被跟蹤。在每一個(gè)繪圖中，黑線和紅線指定相對(duì)于Y軸分別擁有凈“向上”或“向下”移動(dòng)的細(xì)胞。

圖像J軟件用于跟蹤在各種培養(yǎng)條件下個(gè)別細(xì)胞的遷移性質(zhì)。在這些示例中的一些示例中，50個(gè)細(xì)胞被監(jiān)控總共12個(gè)小時(shí)；將結(jié)果呈現(xiàn)在圖14的X/Y繪圖中。分析示出了：（1）細(xì)胞傾向于在穩(wěn)定培養(yǎng)基中比在暴露于營(yíng)養(yǎng)物梯度時(shí)移動(dòng)少得多的程度，以及（2）當(dāng)梯度在培養(yǎng)室內(nèi)被建立時(shí)，細(xì)胞遷移明顯更受引導(dǎo)。

為了區(qū)分朝著FBS的趨化性與無(wú)方向性遷移，我們與y軸（平行于梯度）移動(dòng)分開(kāi)地分析了在x方向（垂直于梯度）上的移動(dòng)（圖6）。顯著的趨化性只由暴露于FBS梯度（10/0 FBS A-C和0/10 FBS）的細(xì)胞展示。在空間恒定的FBS中的細(xì)胞展示非常小的總移動(dòng)。

圖15作為示例圖示根據(jù)特定實(shí)施例的作為在微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置中行進(jìn)的距離的函數(shù)的示例細(xì)胞遷移。在這個(gè)示例中，示出作為所行進(jìn)的距離的函數(shù)的MDA-B-231細(xì)胞遷移。對(duì)于六個(gè)條件中的每一個(gè)條件（對(duì)于每一個(gè)條件，n = 50個(gè)代表性細(xì)胞），所遷移的平均距離（以μm為單位）被測(cè)量為總距離（a）和歐幾里得距離（b）的函數(shù)，其中后者表示從開(kāi)始到結(jié)束位置的直線。

使用從遷移繪圖計(jì)算的遷移距離，在圖15A中示出相對(duì)于梯度條件的總遷移距離和歐幾里得距離。如所示，與在穩(wěn)定環(huán)境中的細(xì)胞比較，針對(duì)梯度培養(yǎng)存在所行進(jìn)的總距離的小的增加。有趣地，在0/0（血清饑餓）和10/10（完全培養(yǎng)基）條件之間幾乎不存在差異。相反，當(dāng)凈（歐幾里得）距離在圖15B中被評(píng)估時(shí)，大差異在這兩個(gè)條件（穩(wěn)定相對(duì)于梯度）之間被找到。在這種情況下，暴露于FBS梯度的細(xì)胞比在恒定的培養(yǎng)基狀態(tài)中的那些細(xì)胞遷移得離其起源部位3倍遠(yuǎn)。這樣的發(fā)現(xiàn)暗示細(xì)胞在梯度的高FBS濃度端處主動(dòng)尋求富含營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基，且因此展示更大程度的方向性遷移。

圖16作為示例圖示根據(jù)特定實(shí)施例示出在微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置中暴露于穩(wěn)定梯度的細(xì)胞比在穩(wěn)定培養(yǎng)基環(huán)境中的細(xì)胞移動(dòng)得更快的繪圖。這個(gè)示例示出在一些情況下，暴露于梯度（例如FBS）的細(xì)胞比在穩(wěn)定培養(yǎng)基環(huán)境中的那些細(xì)胞移動(dòng)得更快。這個(gè)圖表展示在該示例中在四個(gè)培養(yǎng)條件當(dāng)中的遷移速度（μm/min）中的差異。基于所遷移的平均總距離來(lái)計(jì)算速度。

通常，細(xì)胞以稍微更高的速度在建立了FBS梯度的室中遷移，。有名地，在四個(gè)梯度培養(yǎng)物之一（10/0 FBS（Q））中的遷移細(xì)胞比其它示例展示大得多的遷移速度。從在這個(gè)實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行的觀察中，存在兩個(gè)因素，其可潛在地有助于加速的細(xì)胞遷移：（1）細(xì)胞在較低細(xì)胞密度的培養(yǎng)物中傾向于遷移得更遠(yuǎn)，以及（2）細(xì)胞群的成員傾向于比隔離的配對(duì)物遷移得更快。這后一響應(yīng)潛在地由在微環(huán)境內(nèi)的局部化細(xì)胞間通信引起，如前面在分析細(xì)胞間交互作用和遷移速率之間的關(guān)系的研究中報(bào)告的。

圖17圖示示出根據(jù)特定實(shí)施例的對(duì)梯度的暴露刺激細(xì)胞朝著高濃度匯點(diǎn)的主動(dòng)遷移的一個(gè)示例。在該示例中，對(duì)FBS梯度的暴露刺激MDAMB-231細(xì)胞朝著高濃度匯點(diǎn)的主動(dòng)遷移。遷移索引提供在X（垂直于梯度）和Y（平行于梯度）方向上的細(xì)胞的移動(dòng)（相對(duì)于它們的原點(diǎn)位置）的測(cè)量。對(duì)于六個(gè)化驗(yàn)中的每一個(gè)化驗(yàn)，兩個(gè)平面移動(dòng)的值都被顯示（每一個(gè)條表示在單個(gè)細(xì)胞室內(nèi)的50個(gè)個(gè)別跟蹤的細(xì)胞的平均值）。

示例建立

在上面描述的特定實(shí)驗(yàn)之前，在細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)的環(huán)境溫度使用CellASIC? ONIX微培養(yǎng)箱控制器、溫度校準(zhǔn)板和DirecTemp?溫度監(jiān)控軟件（EMD微孔）被校準(zhǔn)到37 ℃。細(xì)胞室使用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液來(lái)弄整齊，磷酸鹽緩沖鹽水溶液從CellASIC?板的孔1、6、7和8被吸出，且10 uL培養(yǎng)基被吸移到孔6中。該過(guò)程對(duì)微板上的全室單元重復(fù)。板被真空密封到F84歧管。通過(guò)使用CellASIC? ONIX FG軟件，培養(yǎng)基被設(shè)置成以0.25 psi從孔6灌注2分鐘。

對(duì)于細(xì)胞裝載，胰蛋白酶化的MDA-MB-231細(xì)胞以2 x 10⁶/mL的速度重新懸浮在完全培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基從孔1和6中的PTFE環(huán)吸出?？?用10 uL培養(yǎng)基代替，且孔6用10 uL的細(xì)胞懸浮液代替。板被真空密封到F84歧管并被放置在EVOS?fl倒置顯微鏡（高級(jí)顯微鏡檢查組）的臺(tái)上以監(jiān)控裝載過(guò)程。使用CellASIC? ONIX FG軟件通過(guò)以0.4 psi同時(shí)從孔1和6流動(dòng)0.3分鐘（18秒）來(lái)裝載細(xì)胞。板被放置在標(biāo)準(zhǔn)37 ^#C / 5% C0₂培養(yǎng)箱中一個(gè)小時(shí)以在自動(dòng)培養(yǎng)基灌注之前允許細(xì)胞附著。

對(duì)于這些示例實(shí)驗(yàn)，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)涉及三個(gè)不同的階段——完全培養(yǎng)基饋送（從入口孔2和4，以1 psi流動(dòng)48小時(shí)）、血清饑餓（從入口孔3和5，以1 psi流動(dòng)24小時(shí)）和暴露于0-10% FBS梯度。為了建立在培養(yǎng)室內(nèi)的梯度，300 uL完全培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基減FBS分別被裝載到入口孔2和4內(nèi)，并以1 psi同時(shí)流動(dòng)。在特定實(shí)例中，在24小時(shí)之后，梯度的定向通過(guò)切換源孔而反轉(zhuǎn)以進(jìn)行灌注。在這種情況下，完全培養(yǎng)基減FBS和完全培養(yǎng)基分別被裝載到孔3和5內(nèi)，并以1 psi同時(shí)流動(dòng)。使用CellASIC? ONIX微流控系統(tǒng)來(lái)完成在這個(gè)系統(tǒng)中的培養(yǎng)基灌注。

在10倍放大率下使用EVOS?fl倒置顯微鏡來(lái)捕獲圖像。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)的FBS梯度部分期間執(zhí)行時(shí)間推移成像；在梯度暴露時(shí)間的長(zhǎng)度內(nèi)以20分鐘間隔捕獲圖像。結(jié)合手動(dòng)跟蹤（NIH）和趨化性工具（ibid.）插件使用圖像J軟件（NIH）來(lái)分析來(lái)自MDA-MV-231細(xì)胞遷移化驗(yàn)的圖像。在每一種情況下，針對(duì)在整個(gè)連續(xù)的一系列36個(gè)圖像（在培養(yǎng)中12個(gè)小時(shí)）上的遷移性質(zhì)跟蹤50個(gè)代表性細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)展示了在高度控制的細(xì)胞遷移研究期間的實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像可用于觀察并研究在成為病理現(xiàn)象（諸如傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移）的基礎(chǔ)的機(jī)制中涉及的細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程。

9．氣動(dòng)歧管

雖然重力或被動(dòng)裝載對(duì)一些微流控細(xì)胞培養(yǎng)裝置是有效的且在一些實(shí)施例中是期望的，如在本文中和在上面引用的申請(qǐng)中所述的專用氣動(dòng)歧管可與板匹配，且氣動(dòng)壓力可施加到細(xì)胞入口區(qū)，以進(jìn)行細(xì)胞裝載并進(jìn)行在侵襲化驗(yàn)期間的培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施例，新穎的細(xì)胞裝載系統(tǒng)使用氣動(dòng)歧管和氣動(dòng)壓力來(lái)將細(xì)胞放置在微培養(yǎng)區(qū)中。在添加這個(gè)細(xì)胞裝載系統(tǒng)的情況下，可使用存在來(lái)處理標(biāo)準(zhǔn)滴定板的其它自動(dòng)化裝置來(lái)完全自動(dòng)化微流控細(xì)胞培養(yǎng)和分析。

在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及允許控制用于附著細(xì)胞的長(zhǎng)期時(shí)間推移顯微鏡檢查的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的微流控系統(tǒng)。因?yàn)槌跋到y(tǒng)生物學(xué)”的趨勢(shì)繼續(xù)，研究在個(gè)別的活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)行為以及改進(jìn)高吞吐量活細(xì)胞篩選的功能和經(jīng)濟(jì)性將變得日益重要。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例，本發(fā)明提供了允許在其它化驗(yàn)當(dāng)中的時(shí)間推移顯微鏡檢查實(shí)驗(yàn)的多重微流控流動(dòng)室。微流控室使用人工內(nèi)皮障礙來(lái)使細(xì)胞與流通道分離。裝置被格式化到標(biāo)準(zhǔn)孔板，從而允許液體和細(xì)胞樣品使用標(biāo)準(zhǔn)裝置被直接吸移到適當(dāng)?shù)娜肟趦?chǔ)器中。定制氣動(dòng)流控制器然后用于將細(xì)胞裝載到培養(yǎng)區(qū)域內(nèi)以及在不同的暴露溶液之間切換。數(shù)字軟件接口可用于允許用戶對(duì)特定的輸入（脈沖、斜面等）隨著時(shí)間的編程以在時(shí)間推移成像期間將細(xì)胞暴露于復(fù)雜功能。

在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)響應(yīng)是用于現(xiàn)象（諸如生物信號(hào)處理、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、區(qū)分和細(xì)胞分裂）的基礎(chǔ)。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及能夠以與當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)方法兼容的多重格式控制細(xì)胞微環(huán)境的系統(tǒng)。細(xì)胞響應(yīng)可使用高放大率熒光顯微鏡檢查來(lái)量化以得到具有亞細(xì)胞分辨率的動(dòng)力學(xué)信息。這個(gè)能力在細(xì)胞系統(tǒng)中有廣泛的應(yīng)用。

圖18A-C示出根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的示例歧管的示意圖的頂視圖、側(cè)視圖和平面視圖。在該示例中，右邊的八個(gè)管道線用于壓縮的空氣，且每一個(gè)管道線被配置成向微流控陣列中的細(xì)胞入口孔的列提供壓力。在圖中最左邊的線用于真空并連接到在歧管周?chē)耐獠空婵窄h(huán)?？椎拿恳涣幸话氵B接到單個(gè)壓力線，其中在成像區(qū)域之上的孔被跳過(guò)。歧管被放置在標(biāo)準(zhǔn)孔板或板的其它配置的頂部上。橡膠墊圈位于板和歧管之間，其中孔與歧管（未示出）匹配。真空線在孔之間的腔中創(chuàng)建真空，從而將板和歧管保持在一起。壓力被施加到孔以將液體驅(qū)動(dòng)到微流控通道（未示出）中。使用1 psi的典型壓力，因此真空強(qiáng)度足以維持氣密密封。在一個(gè)示例中存在到壓力控制器的9個(gè)管道線：8個(gè)線用于壓縮空氣，以及1個(gè)線用于真空（最左邊）。在特定的示例實(shí)施例中，每一列連接到單個(gè)壓力線。在細(xì)胞成像區(qū)之上的列被跳過(guò)。

在根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的系統(tǒng)中的增壓細(xì)胞裝載被發(fā)現(xiàn)在制備聚集的細(xì)胞（例如實(shí)心腫瘤、肝、肌肉等）的培養(yǎng)物中特別有效。增壓細(xì)胞裝載也允許具有細(xì)長(zhǎng)培養(yǎng)區(qū)的結(jié)構(gòu)有效地被裝載。用于細(xì)胞裝載的增壓歧管和用于灌注操作和侵襲化驗(yàn)的被動(dòng)流的使用允許本發(fā)明利用相當(dāng)簡(jiǎn)單的兩入口設(shè)計(jì)，而不需要如在其它設(shè)計(jì)中使用的附加的入口孔和/或閥。

修改的歧管

在另外的實(shí)施例中，板歧管包括用于將細(xì)胞浸在具有特定的氣體環(huán)境（例如5% CO₂）的微流控裝置中的附加“氣體管線”。其它示例包括氧和氮控制，但任何氣態(tài)混合物可被發(fā)送到細(xì)胞。氣體通過(guò)歧管流到在細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)之上的密封孔中，并且在微流控裝置中的孔使氣體能夠流到指定的微流控空氣通道中，如上所述。氣體可透過(guò)裝置層（PDMS）在暴露細(xì)胞之前允許氣體擴(kuò)散到培養(yǎng)基中。通過(guò)使氣體連續(xù)流經(jīng)微流控板，穩(wěn)定的氣體環(huán)境被維持。

這提供用于控制氣體環(huán)境以將微流控板放置在培養(yǎng)箱中的可選裝置。在這個(gè)修改的歧管中，歧管可用于獨(dú)立于周?chē)諝舛鴦?chuàng)建“微培養(yǎng)箱”。

圖19圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施例的用于操作微流控板的示例系統(tǒng)和歧管。

10．自動(dòng)化系統(tǒng)

因?yàn)榘灞辉O(shè)計(jì)成使用符合SBS的儀器來(lái)處理，各種“現(xiàn)成的”機(jī)器可用于創(chuàng)建自動(dòng)化系統(tǒng)。這個(gè)示意圖示出這如何被完成的示例。機(jī)器人臂（板處理器）將微流控板從一個(gè)臺(tái)移動(dòng)到另一臺(tái)。自動(dòng)化培養(yǎng)箱在適當(dāng)?shù)臏囟群蜌怏w環(huán)境下存儲(chǔ)板，以進(jìn)行經(jīng)由重力流的長(zhǎng)期灌注。吸移管管理器將液體（培養(yǎng)基、藥物、化驗(yàn)試劑等）分配到入口孔，并從出口孔移除液體。板閱讀器用于化驗(yàn)。細(xì)胞裝載器可選地用于在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將細(xì)胞引入微流控化驗(yàn)中。特別是，細(xì)胞裝載器一般不是“現(xiàn)成的”，并通過(guò)將氣動(dòng)壓力施加到陣列板的指定孔以引起流來(lái)操作。標(biāo)準(zhǔn)或定制計(jì)算機(jī)軟件可用來(lái)使操作完整。

基本過(guò)程包括：1）將板從培養(yǎng)箱移除，2）經(jīng)由吸移管管理器將液體從出口孔移除，3）從“板疊層”移動(dòng)培養(yǎng)基/藥物存儲(chǔ)板，4）經(jīng)由吸移管管理器將液體從培養(yǎng)基/藥物板轉(zhuǎn)移到微流控板，5）將微流控板放置在培養(yǎng)箱中，6）對(duì)每一個(gè)板進(jìn)行重復(fù)，7）在指定的時(shí)間間隔（例如24小時(shí)）之后重復(fù)。

96孔板標(biāo)準(zhǔn)允許微流控系統(tǒng)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和裝置來(lái)操作。例如，液體分配用標(biāo)準(zhǔn)吸移管機(jī)械來(lái)實(shí)現(xiàn)，且細(xì)胞培養(yǎng)和分析與現(xiàn)有的培養(yǎng)箱和板閱讀器兼容。定制建立的細(xì)胞裝載系統(tǒng)可用于使用如上所述的空氣壓力來(lái)裝載細(xì)胞。重力驅(qū)動(dòng)流培養(yǎng)配置利用在入口和出口孔之間的培養(yǎng)基水平差以及設(shè)計(jì)流體阻力來(lái)實(shí)現(xiàn)在nL/min狀況的期望流率。這提供能夠“被動(dòng)地”使培養(yǎng)基流動(dòng)長(zhǎng)時(shí)間段（例如多達(dá)4天）的顯著優(yōu)點(diǎn)，而不使用龐大的外部泵。

集成系統(tǒng)

用于細(xì)胞和其它數(shù)據(jù)的收集和分析以及用于本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫(kù)的編譯、存儲(chǔ)和訪問(wèn)的集成系統(tǒng)一般包括數(shù)字計(jì)算機(jī)，其具有包括用于序列搜索和/或分析的指令集的軟件，和可選地高吞吐量樣品控制軟件、圖像分析軟件、已收集數(shù)據(jù)解釋軟件、用于將溶液從源轉(zhuǎn)移到目的地（諸如檢測(cè)裝置）的可操作地鏈接到數(shù)字計(jì)算機(jī)的機(jī)器人控制電樞、用于將主題數(shù)據(jù)輸入到數(shù)字計(jì)算機(jī)或用來(lái)控制分析操作或由機(jī)器人控制電樞進(jìn)行的高吞吐量樣品轉(zhuǎn)移的輸入裝置（例如計(jì)算機(jī)鍵盤(pán)）?？蛇x地，集成系統(tǒng)還包括閥、濃度梯度、流體多重通道和/或用于與如所述的微室交互作用的其它微流控結(jié)構(gòu)。

使用標(biāo)準(zhǔn)操作系統(tǒng)的容易可得的計(jì)算硬件資源可被采用并根據(jù)本文中提供的教導(dǎo)而被修改，例如在本發(fā)明的集成系統(tǒng)中使用的PC（英特爾x86或兼容奔騰芯片的DOS?、OS2?、WINDOWS?、WINDOWS NT?、WINDOWS95?、WINDOWS98?、LINUX或甚至Macintosh、Sun 或PCs將足夠了）。在軟件技術(shù)中的當(dāng)前技術(shù)足以允許在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)本文中教導(dǎo)的方法。因此，在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明可包括用于執(zhí)行如在本文中教導(dǎo)的方法中的一種或多種方法的一組邏輯指令（軟件或硬件編碼的指令）。例如，用于提供數(shù)據(jù)和/或統(tǒng)計(jì)分析的軟件可由技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)編程語(yǔ)言（諸如Visual Basic、Fortran、Basic、Java等）來(lái)構(gòu)造。這樣的軟件也可利用多種統(tǒng)計(jì)編程語(yǔ)言、工具箱或庫(kù)來(lái)構(gòu)造。

圖21示出可被理解為可從介質(zhì)717和/或網(wǎng)絡(luò)端口719讀取指令的邏輯設(shè)備的信息儀器（或數(shù)字裝置）700，網(wǎng)絡(luò)端口719可以可選地連接到具有固定介質(zhì)722的服務(wù)器720。設(shè)備700可在下文中使用那些指令來(lái)指導(dǎo)服務(wù)器或客戶端邏輯，如在本領(lǐng)域中理解的，以體現(xiàn)本發(fā)明的方面?？审w現(xiàn)本發(fā)明的一種類型的邏輯設(shè)備是如在700中所示的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含CPU 707、可選的輸入裝置709和711、磁盤(pán)驅(qū)動(dòng)器715和可選的監(jiān)視器705。固定介質(zhì)717或在端口719之上的固定介質(zhì)722可用于對(duì)這樣的系統(tǒng)編程并可表示磁盤(pán)型光或磁介質(zhì)、磁帶、固態(tài)動(dòng)態(tài)或靜態(tài)存儲(chǔ)器等。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明可全部或部分地體現(xiàn)為被記錄在這個(gè)固定介質(zhì)上的軟件。通信端口719也可用于最初接收用來(lái)對(duì)這樣的系統(tǒng)編程并可表示任何類型的通信連接的指令。

各種編程方法和算法——包括遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)——可用于執(zhí)行數(shù)據(jù)收集、關(guān)聯(lián)和存儲(chǔ)功能以及其它期望功能的方面，如在本文中所述的。此外，數(shù)字或模擬系統(tǒng)（諸如數(shù)字或模擬計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）可控制多種其它功能，諸如輸入和輸出文件的顯示和/或控制。用于執(zhí)行本發(fā)明的電氣分析方法的軟件也包括在本發(fā)明的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中。

其它實(shí)施例

雖然已經(jīng)在各種特定的實(shí)施例方面描述了本發(fā)明，但意圖不是本發(fā)明被限制到這些實(shí)施例。在本發(fā)明的精神內(nèi)的修改對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將是明顯的。

理解的是，本文中描述的示例和實(shí)施例是為了例證性目的，以及根據(jù)其的各種修改或改變對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將通過(guò)本文中的教導(dǎo)來(lái)暗示，且將被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

在本文中引用的或與這個(gè)提案一起提交的所有公布物、專利和專利申請(qǐng)——包括作為信息公開(kāi)陳述的部分被提交的任何參考資料——通過(guò)引用被全部并入。