本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種t淋巴細(xì)胞、一種慢病毒、一種轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞、一種構(gòu)建體、一種用于治療癌癥的治療組合物和一種提高淋巴細(xì)胞活性的方法。

背景技術(shù)：

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，腫瘤細(xì)胞通過誘導(dǎo)免疫抑制性受體的表達(dá)，而關(guān)閉其受到免疫反應(yīng)。在免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面,激活的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctls)表達(dá)負(fù)調(diào)控的監(jiān)管機(jī)制,即在細(xì)胞表面表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，其中，一種主要的免疫檢查點(diǎn)分子——程序性細(xì)胞死亡受體1(pd1)表達(dá)在活化ctls上，其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的程序性死亡配體1(pd-l1b7-h1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細(xì)胞反應(yīng)。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達(dá)pd-l1。pd-l1與其配體pd1的結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致t淋巴細(xì)胞增生性反應(yīng)的下調(diào),細(xì)胞因子的分泌減少,和t細(xì)胞的無(wú)能或凋亡。細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla4)是另一個(gè)t細(xì)胞的關(guān)鍵負(fù)面調(diào)節(jié)因子，其可抑制t細(xì)胞活化，抑制機(jī)制是通過與表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)在相互作用實(shí)現(xiàn)。

t細(xì)胞攻擊并摧毀腫瘤的潛力一直是公認(rèn)的。過繼t細(xì)胞療法是將來自體內(nèi)的t細(xì)胞在體外活化、擴(kuò)張，隨后回輸入體內(nèi)進(jìn)行自身免疫治療的一種療法。

然而，過繼t細(xì)胞療法仍有待進(jìn)一步開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

cd19靶向性的嵌合抗原受體t細(xì)胞可有效地殺傷cd19⁺的惡性b細(xì)胞。但許多cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤患者，仍然對(duì)于cd19靶向性的嵌合抗原受體t細(xì)胞療法沒有反應(yīng)。本發(fā)明針對(duì)上述問題，提出了一種攜帶沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子和編碼cd19靶向性的嵌合抗原受體的核酸分子的構(gòu)建體和以此構(gòu)建體導(dǎo)入后形成的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，本發(fā)明提出的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞用于過繼t細(xì)胞的免疫治療，可以大大提高t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病 的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果顯著增強(qiáng)。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默；以及表達(dá)嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識(shí)別抗原cd19；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜中；胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內(nèi)區(qū)包括cd28的胞內(nèi)段以及cd3ζ鏈。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出的t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力顯著增強(qiáng)，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果大大提高。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述慢病毒攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子，所述沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一。

mlllvtslllcelphpafllipdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitgstsgsgkpgsgegstkgevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssaaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno：1)。

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgc ttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa(seqidno：2)。

ggccaggatggttcttagact(seqidno：3)。

ggatttccagtggcgagagaa(seqidno：4)。

gccuguguucucuguggacuaug(seqidno：5)。

ggugcugcuagucuggguccugg(seqidno：6)。

gacagagagaagggcagaagugc(seqidno：7)。

cagcuucuccaacacaucggaga(seqidno：8)。

ccgugucacacaacugcccaacg(seqidno：9)。

uaugccaccauugucuuuccuag(seqidno：10)。

ugcuaaacugguaccgcaugagc(seqidno：11)。

gugacagagagaagggcagaagu(seqidno：12)。

cugaggauggacacugcucuugg(seqidno：13)。

aucggagagcuucgugcuaaacu(seqidno：14)。

ggcaacggaacccagatttat(seqidno：15)。

ggaacccaaattacgtgtact(seqidno：16)。

gaacccaaattacgtgtacta(seqidno：17)。

gggagaagactatattgtaca(seqidno：18)。

gacgtttatagccgaaatgat(seqidno：19)。

gacactaatacaccaggtaga(seqidno：20)。

accucacuauccaaggacugagg(seqidno：21)。

augaguugaccuuccuagaugau(seqidno：22)。

ggggaaugaguugaccuuccuag(seqidno：23)。

cucuggauccuugcagcaguuag(seqidno：24)。

cuccucuggauccuugcagcagu(seqidno：25)。

uuugugugugaguaugcaucucc(seqidno：26)。

caccuccaguggaaaucaaguga(seqidno：27)。

cacgggacucuacaucugcaagg(seqidno：28)。

uucugacuuccuccucuggaucc(seqidno：29)。

aagucugugcggcaaccuacaug(seqidno：30)。

ggtcggtcagaatgcctatct(seqidno：31)。

gccaatgacttacgggactct(seqidno：32)。

gcagagggaattcgctcagaa(seqidno：33)。

ggaaattcgggcacatcatat(seqidno：34)。

gattaagagatgactggacta(seqidno：35)。

gagatgactggactaggtcta(seqidno：36)。

aggaaauucgggcacaucauaug(seqidno：37)。

gacugaugaaagggaugugaauu(seqidno：38)。

gccacugauuuucaaagagaucu(seqidno：39)。

agcagaguuuucccauuuucaga(seqidno：40)。

aacuuaaacaggcaugucauugc(seqidno：41)。

uucagaagauaaugacucacaug(seqidno：42)。

gccucuguauuuaagccaacaga(seqidno：43)。

ugcucaugugauuguggaguaga(seqidno：44)。

auguuuucacaucuucccuuuga(seqidno：45)。

gagagacuucacugcagccuuuc(seqidno：46)。

gattgcctctactcatcacta(seqidno：47)。

uccuaaugacaaugggucauacc(seqidno：48)。

aagacauugccugccaugcuugg(seqidno：49)。

gucauaccgcuguucugcaaauu(seqidno：50)。

cuccuguauaguuuacuuccuuu(seqidno：51)。

uaccgcuguucugcaaauuuuca(seqidno：52)。

aaaacaaaccaggcauuguuuau(seqidno：53)。

aacuagaaugcccugugaaauac(seqidno：54)。

gugacuuggugcaagcucaaugg(seqidno：55)。

auccaugggaaagaaucauguga(seqidno：56)。

uggugcaagcucaauggaacaac(seqidno：57)。

gctgctcacccttatgaacct(seqidno：58)。

aggacauggugguggacgagugc(seqidno：59)。

ugcucuuccugcacgauaucagu(seqidno：60)。

accucuacugguuccuguacauc(seqidno：61)。

cccuccaacucugcuccucuagg(seqidno：62)。

cccugaguggacagucgucuucg(seqidno：63)。

cugcuccagggaagcuucuaugg(seqidno：64)。

cgcucaagguccuguaugccacc(seqidno：65)。

gaguucaccaagcucaacauuua(seqidno：66)。

ugcugcugcucacccuuaugaac(seqidno：67)。

cccaucuccgugcucuucuuuga(seqidno：68)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：69所示的核苷酸序列。

agatctactagttctagaatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatcta ccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaaagcttggtaccctcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatc(seqidno： 69)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明實(shí)施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：70所示的核苷酸序列。

agatctactagttctagaatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaaagcttggtacc ctcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccgcatcacttgggattaatattcaagagatattaatcccaagtgatgctttttagctatcgatatc(seqidno：70)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明實(shí)施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：71所示的核苷酸序列。

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatc tacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatcctactgcgtcgacttcgaactcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatcgatagctaaaaagcatcacttgggattaatatctcttgaatattaatcccaagtgatgcggggaagatctgtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatattgcagggcgccactcccctgtccctcacagccatcttcctgccagggcgcacgcgcgctgggtgttcccgcctagtgacactgggcccgcgattccttggagcgggttgatgacgtcagcgttcgaattgtcgac(seqidno：71)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明實(shí)施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默；以及表達(dá)嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)能夠與抗原特異性結(jié)合；跨膜區(qū)；以及胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū) 包括免疫共刺激分子胞內(nèi)段，所述抗原是腫瘤抗原，所述胞外區(qū)包括抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述抗體結(jié)合所述抗原，所述抗體為單鏈抗體，所述抗原為cd19。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默和表達(dá)特異性結(jié)合cd19的嵌合抗原受體的淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷能力大大提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞還可以具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)獨(dú)立地選自ctla4、pd1、tim3、btla、lag3至少之一。上述分子具有負(fù)向調(diào)控和減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。在本發(fā)明中，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)一步加強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變和鋅指核酸酶至少之一實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)一步加強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段獨(dú)立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達(dá)和細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默的聯(lián)合具有正向調(diào)控和增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)是ctla4或pd1。根據(jù)本發(fā)明的時(shí)候例，細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)ctla4或pd1被沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默是通過shrna實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明所提出的shrna具有高效、特異性的沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的作用，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)一步提高，對(duì)腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段是4-1bb或cd28的胞內(nèi)段。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的嵌合抗原受體的免疫共刺激分子胞內(nèi)段是cd28或者4-1bb的胞內(nèi)段。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，免疫共刺激分子胞內(nèi)段是cd28或者4-1bb的胞內(nèi)段，顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞是cd3⁺t淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞或自然殺傷t細(xì)胞。在本發(fā)明中，上述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默和表達(dá)嵌合抗原受體，使得上述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫作用靶向性更強(qiáng)，該t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力進(jìn)一步提高，對(duì)腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建體包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子編碼嵌合抗原受體，其中，所述細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和所述嵌合抗原受體如前所述。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述構(gòu)建成功導(dǎo)入上述淋巴細(xì)胞并成功沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和表達(dá)嵌合抗原受體后，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大幅提高，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述構(gòu)建體還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其特征在于所述第一核酸分子與所述第二核酸分子被設(shè)置在前面所述的淋巴細(xì)胞中沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和表達(dá)所述嵌合抗原受體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，成功設(shè)置上述第一核酸分子和第二核酸分子的淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包括：第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與所述第一核酸分子可操作地連接；以及第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與所述第二核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一和第二啟動(dòng)子的引入，使得第一核酸分子和第二核酸分子分別獨(dú)立的表達(dá)，有效沉默了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和保證了嵌合抗原受體的生物學(xué)作用，使得淋巴細(xì)胞靶向作用更強(qiáng)，對(duì)腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一啟動(dòng)子和所述第二啟動(dòng)子分別獨(dú)立地選自u(píng)6，h1，cmv,ef-1,rsv啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述啟動(dòng)子具有啟動(dòng)效率高的特點(diǎn)，從而保證了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的高效沉默和嵌合抗原受體的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，對(duì)腫瘤的定向殺傷效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建體載體是非致病性病毒。非致病性病毒載體的引入大大提高了構(gòu)建體在淋巴細(xì)胞中的復(fù)制和擴(kuò)增效率，從而大大提高了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和嵌合抗原受體在淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述非致病性病毒載體選自反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺關(guān)聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的病毒的載體在病毒包裝和感染過程中，病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細(xì)胞，又可感染處于分裂期的細(xì)胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實(shí)現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被高效沉默和嵌合抗原受體在淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴 細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將前面所述的構(gòu)建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細(xì)胞中或者t淋巴細(xì)胞。所述構(gòu)建體或慢病毒成功引入上述淋巴細(xì)胞或者t淋巴細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查被沉默和特異性結(jié)合抗原cd19的嵌合抗原受體的表達(dá)，從而使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對(duì)cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述治療組合物包括：上述構(gòu)建體、慢病毒、t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和特異性結(jié)合抗原cd19的嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，從而使得所得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力大大提高，轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對(duì)cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述治療組合物還可以進(jìn)一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述癌癥包括選自b細(xì)胞淋巴瘤和b細(xì)胞白血病的至少之一。細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對(duì)b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種提高淋巴細(xì)胞活性的方法，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞攜帶嵌合抗原受體，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，所述細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)、所述淋巴細(xì)胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細(xì)胞活性包括所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌能力和所述淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，細(xì)胞因子分泌增多，對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

需要說明的是，本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)”是一種淋巴細(xì)胞表面的膜蛋白，它是一種負(fù)調(diào)控的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的配體相互作用，可以抑制抗腫瘤淋巴細(xì)胞反應(yīng)。本發(fā)明中所提到的“細(xì)胞因子分泌增多”是細(xì)胞生理功能增強(qiáng)的表現(xiàn)。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的共表達(dá)cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默人細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的慢病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的共表達(dá)cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的結(jié)果圖；以及

圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的共表達(dá)cd19抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，下面描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默；以及表達(dá)嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識(shí)別抗原cd19；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜中；胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內(nèi)區(qū)包括cd28的胞內(nèi)段以及cd3ζ鏈。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出的t淋巴細(xì)胞殺傷能力顯著增強(qiáng)，尤其對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果大大提高。

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，通過刺激免疫抑制性受體的表達(dá)而關(guān)閉免疫反應(yīng)。作為免疫負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制,激活的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctls)表達(dá)負(fù)調(diào)控的監(jiān)管機(jī)構(gòu),即細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)分子。程序性細(xì)胞死亡1受體(pd1)表達(dá)在活化ctls上，其與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的程序性死亡配體1(pd-l1b7-h1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細(xì)胞反應(yīng)。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達(dá)pd-l1。pd-l1與其配體pd1的結(jié)合，導(dǎo)致ctls增生性反應(yīng)的下調(diào),細(xì)胞因子的分泌減少,和t細(xì)胞的無(wú)能或凋亡。細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla4)是另一個(gè)t細(xì)胞的關(guān)鍵負(fù)面調(diào)節(jié)因子，其可抑制t細(xì)胞活化，其通過與表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)的相互作用而抑制t細(xì)胞的活化。因此，本發(fā)明中提出的t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)被沉默，t淋巴細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力以及細(xì)胞因子的分泌能力顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗體為單鏈抗體。單鏈抗體可去除非特異性反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性表面蛋白，同時(shí)單鏈抗體更易滲透腫瘤組織增加藥物治療濃度。本發(fā)明提出的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞表達(dá)單鏈抗體的嵌合抗原受體，大大提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對(duì)靶向腫瘤細(xì)胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述抗原為cd19。因此所述轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞針對(duì)表達(dá)抗原cd19的細(xì)胞具有定向性殺傷作用，抗原抗體的特異性結(jié)合作用更強(qiáng)，大大提高了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基 因淋巴細(xì)胞對(duì)cd19抗原表達(dá)腫瘤細(xì)胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)獨(dú)立地選自ctla4、pd1、tim3、btla、lag3至少之一。上述分子能夠與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗原特異性結(jié)合，負(fù)向調(diào)控和減弱細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，進(jìn)一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的定向殺傷作用進(jìn)一步加強(qiáng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變和鋅指核酸酶至少之一實(shí)現(xiàn)的。

小發(fā)夾rna或短發(fā)夾rna(shrna)是sirna(小干擾rna)的導(dǎo)入形式，sirna是一種小rna分子(由21～25個(gè)核苷酸組成)，由dicer(rnaaseⅲ家族中對(duì)雙鏈rna具有特異性剪切作用的酶)加工而成；sirna在rna沉默通路中起中心作用，對(duì)特定信使rna(mrna)進(jìn)行降解，為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

反義核酸包括反義rna和反義dna，反義rna是指能和mrna完全互補(bǔ)的一段小分子rna或寡聚核苷酸片段，反義dna是指能與基因dna雙鏈中的有義鏈互補(bǔ)結(jié)合的短小dna分子，反義rna和反義dna主要是通過mrna的翻譯和基因dna的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用的；反義核酸一方面通過與靶mrna結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mrna結(jié)合，另一方面其與mrna結(jié)合后激活內(nèi)源性rna酶或核酶，進(jìn)而降解mrna；反義dna與基因dna雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成dna三聚體，或與dna編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mrna鏈的延長(zhǎng)；反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mrna的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mrna由細(xì)胞核向細(xì)胞漿內(nèi)運(yùn)輸，因此，反義rna是一種有效的沉默目的基因的技術(shù)。

核酶是具有催化功能的rna分子，是生物催化劑，可降解特異的mrna序列，核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與rna自身剪切、加工過程，與一般的反義rna相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到rna酶的攻擊，更重要的是，核酶在切斷mrna后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mrna分子。

顯性負(fù)性突變是指某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變后不僅自身無(wú)功能，還能抑制或阻斷同一細(xì)胞內(nèi)的野生型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用，其主要通過和野生型蛋白形成二聚物的方式實(shí)現(xiàn)，這種突變毒性作用大，能顯著抑制或阻斷細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用。

鋅指核酸酶由一個(gè)dna識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，dna識(shí)別域是由一系列cys2-his2鋅指蛋白串聯(lián)組成(一般3～4個(gè))，每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基，鋅指蛋白形成α-β-β二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的dna結(jié)合特異性，骨架結(jié)構(gòu)保守，對(duì)決定dna結(jié)合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的dna結(jié)合特異性，從而可以針對(duì)不同的目的基因設(shè)計(jì)不同的氨基酸引入序列，實(shí)現(xiàn)不同 目的基因的特異性沉默。

綜上所述，shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變、crispr、鋅指核酸酶為特異性沉默目標(biāo)基因的有效手段，沉默基因的手段不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件選擇，如本發(fā)明實(shí)施例所采用的shrna、反義核酸、核酶、顯性負(fù)突變，或鋅指核酸酶的至少之一，實(shí)現(xiàn)目的基因的特異性沉默。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默優(yōu)選采用shrna實(shí)現(xiàn)。shrna所攜帶的sirna分子通常是一個(gè)長(zhǎng)度在10和30之間的堿基對(duì)的雙重區(qū)域。本發(fā)明實(shí)施例的pd1或ctla4sirna被設(shè)計(jì)為同源于pd1或ctla4mrna的編碼區(qū)域，通過mrna的降解來抑制基因表達(dá)。sirna關(guān)聯(lián)于被稱為誘導(dǎo)rna沉默復(fù)合物(risc)的多重蛋白復(fù)合物，在此期間正義鏈被酶裂解。被激活的risc中基于序列同源性，指引risc到對(duì)應(yīng)的mrna；相同的核酸酶切割靶向pd1或ctla4mrna，產(chǎn)生特定基因pd1或ctla4沉默，抑制特定基因pd1或ctla4的表達(dá)。sirna以shrna的形式導(dǎo)入細(xì)胞(shrna包含大約18-23的核苷酸sirna序列，后跟一個(gè)9-15長(zhǎng)度的核苷酸環(huán)和一個(gè)sirna序列的反向補(bǔ)充)，shrna的設(shè)計(jì)較好的避免了在3’utr細(xì)胞基因中的匹配點(diǎn)；確保了適當(dāng)?shù)逆溸x擇。一個(gè)單一sirna分子可被重復(fù)應(yīng)用于多靶向mrna分子的分裂。rnai(rna干擾)可通過引入合成sirna的方式被誘導(dǎo)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的shrna不斷產(chǎn)自細(xì)胞內(nèi)，因此其效果更加持久，從而延長(zhǎng)shrna周期，本發(fā)明實(shí)施例采用的shrna具有高效、特異性的沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的作用，細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的成功沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞具有顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的特性，對(duì)腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段獨(dú)立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達(dá)和細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默的聯(lián)合具有正向調(diào)控和增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)是ctla4或pd1。根據(jù)本發(fā)明的時(shí)候例，細(xì)胞細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)ctla4或pd1被沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進(jìn)一步提高，對(duì)腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

本發(fā)明中的淋巴細(xì)胞是cd3⁺淋巴細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞或自然殺傷t細(xì)胞。cd3⁺淋巴細(xì)胞是總t細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞是免疫細(xì)胞的一種，非特異性性識(shí)別靶細(xì)胞，自然殺傷t細(xì)胞是具有t細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞受體的t細(xì)胞亞群。上述淋巴細(xì)胞中免疫共刺激分子被沉默和表達(dá)嵌合抗原受體，使得上述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫作用靶向性更強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用效果更加顯著。

慢病毒或構(gòu)建體

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒或構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述慢病毒或構(gòu)建體攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子，所述沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一。其中，seqidno：3～14是人類程序性細(xì)胞死亡受體1(pd1)sirna的核苷酸序列，seqidno：15～30是人類細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原4(ctla4)sirna的核苷酸序列，seqidno：31～46是人類t細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(tim3)sirna的核苷酸序列，seqidno：47～57是人類t淋巴細(xì)胞衰減因子(btla)sirna的核苷酸序列，seqidno：58～68是人類淋巴細(xì)胞活化基因3蛋白(lag3)sirna的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明的慢病毒或構(gòu)建體導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)pd1、ctla4、tim3、btla、lag3被特異性沉默，特意向結(jié)合抗原cd19的嵌合抗原受體高效表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞抗調(diào)亡能力和增殖能力增強(qiáng)、定向殺傷能力顯著提高，從而使得基因淋巴細(xì)胞對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明地實(shí)施例，本發(fā)明提出的慢病毒或構(gòu)建體攜帶含有seqidno：69、70或71所示的核苷酸序列。其中，seqidno：69是共表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)pd-1的核酸分子(cd19-car/ipd1)，seqidno：70是共表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)ctla4的核酸分子(cd19-car/ictla4)，seqidno：71是共表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和沉默細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)pd-1和ctla4的核酸分子(cd19-car/ipd1/ictla4)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將本發(fā)明的慢病毒導(dǎo)入淋巴細(xì)胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)pd1、ctla4被特異性沉默，抗cd19的嵌合抗原受體高效表達(dá)，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞抗調(diào)亡能力和增殖能力增強(qiáng)、定向殺傷能力顯著提高，從而使得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞對(duì)cd19⁺惡性b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人是通過如下方式實(shí)現(xiàn)上述細(xì)胞嵌合抗原受體以及細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)shrna分別獨(dú)立地表達(dá)的，其中，需要說明的是，此處的表達(dá)既指蛋白的表達(dá)又指rna轉(zhuǎn)錄。

啟動(dòng)子：第一啟動(dòng)子，所述第一啟動(dòng)子與編碼嵌合抗原受體的核酸分子可操作地連接；以及第二啟動(dòng)子，所述第二啟動(dòng)子與沉默免疫檢查點(diǎn)的核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一啟動(dòng)子和所述第二啟動(dòng)子分別獨(dú)立地選自u(píng)6，h1，cmv,ef-1,rsv啟動(dòng)子，第一和第二啟動(dòng)子的引入，使得編碼嵌合抗原受體的核酸分子和沉默細(xì)胞表面免 疫檢查點(diǎn)的核酸分子分別獨(dú)立的表達(dá)，有效沉默了細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)和保證了嵌合抗原受體的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的靶向作用更強(qiáng)，對(duì)腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，也可進(jìn)一步引入第三啟動(dòng)子，第三啟動(dòng)子與沉默細(xì)胞表面的免疫檢查點(diǎn)的核酸分子可操作的連接，第三啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子所連接的沉默細(xì)胞表面的免疫檢查的核酸分子不同，第三啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子分別啟動(dòng)沉默不同免疫檢查點(diǎn)的shrna。

通過上述第一、第二啟動(dòng)子或進(jìn)一步第三啟動(dòng)子的的引入，使得免疫檢查點(diǎn)被高效沉默和嵌合抗原受體高效地表達(dá)在上述轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞膜上，從而高效抑制了免疫檢查點(diǎn)的免疫負(fù)調(diào)控和保證了嵌合抗原受體的生物學(xué)作用，從而使得淋巴細(xì)胞靶向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建體的載體是非致病性病毒載體。非致病性病毒載體的引入大大提高了構(gòu)建體在淋巴細(xì)胞中的復(fù)制和擴(kuò)增效率，使得淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述非致病性病毒載體選自反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺病毒關(guān)聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述構(gòu)建體病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細(xì)胞，又可感染處于分裂期的細(xì)胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實(shí)現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被高效沉默和抗cd19的嵌合抗原受體在淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得淋巴細(xì)胞的靶向作用進(jìn)一步增強(qiáng)，對(duì)cd19⁺腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，以構(gòu)建一個(gè)慢病毒載體為例，發(fā)明人為了構(gòu)建一個(gè)慢病毒載體，在某些病毒序列的位置，將目的核酸插入到病毒基因組中，從而產(chǎn)生復(fù)制缺陷的病毒。為了產(chǎn)生病毒體，發(fā)明人進(jìn)而構(gòu)建包裝細(xì)胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括ltr和包裝成分)。發(fā)明人將含有目的基因的重組質(zhì)粒，連同慢病毒ltr和包裝序列，一起引入包裝細(xì)胞系中。包裝序列允許重組質(zhì)粒rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被包裝到病毒顆粒中，然后被分泌到培養(yǎng)基中。進(jìn)而發(fā)明人收集包含重組慢病毒的基質(zhì)，有選擇性地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。慢載體可以感染多種細(xì)胞類型，包括可分裂細(xì)胞和不可分裂細(xì)胞。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的慢病毒是復(fù)合慢病毒，除了常見的慢病毒基因gag，pol和env，還包含有調(diào)控和結(jié)構(gòu)功能的其他基因。慢病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，慢病毒包括：人類免疫缺陷病毒hiv–1，hiv–2和猿猴免疫缺陷病毒siv。慢病毒載體通過多重衰減艾滋病毒致病基因產(chǎn)生，例如全部刪除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒載體形成生物安全型載體。重組慢病毒載體能夠感染非分裂細(xì)胞，同時(shí)可用于體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移和核酸序列表達(dá)。例如：在合適的宿主細(xì)胞中，和帶有包裝功能(gag，pol，env，rev和tat)的兩個(gè)或更多的載體一起，能夠感染非分裂細(xì)胞。重組 病毒的靶向性，是通過抗體或特定配體(靶向特定細(xì)胞類型受體)與膜蛋白的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，重組病毒的靶向性通過插入一個(gè)有效序列(包括調(diào)控區(qū)域)到病毒載體中，連同另一個(gè)編碼了特定靶細(xì)胞上的受體的配體的基因，使載體具有了特定的靶向。各種有用的慢病毒載體，以及各種方法和操作等產(chǎn)生的載體，用于改變細(xì)胞的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的慢病毒載體可有效運(yùn)送和共表達(dá)shrna(sirna的轉(zhuǎn)運(yùn)形式)，該小shrna可以有效抑制pd1或ctla4的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的腺關(guān)聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關(guān)聯(lián)病毒載體的dna構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建一個(gè)合適的腺關(guān)聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達(dá)小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4基因的表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的腺關(guān)聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關(guān)聯(lián)病毒載體的dna構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建一個(gè)合適的腺關(guān)聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達(dá)小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4基因的表達(dá)。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例的也包含微基因。微基因意味著用組合(選定的核苷酸序列和可操作的必要的相關(guān)連接序列)來指導(dǎo)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄和/或基因產(chǎn)物在體內(nèi)或體外的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用“可操作的連接”序列包含連續(xù)目的基因的表達(dá)控制序列，和作用于反式或遠(yuǎn)距離控制目的基因的表達(dá)控制序列。

另外，本發(fā)明實(shí)施例的載體還包括常規(guī)控制元素，在和質(zhì)粒載體一起的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或/和病毒載體一起的細(xì)胞感染中，這些元素允許轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)化和/或小發(fā)夾rna的表達(dá)。大量的表達(dá)控制序列(包括天然的，可誘導(dǎo)和/或特定組織的啟動(dòng)子)可能被使用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，表達(dá)shrna的啟動(dòng)子為rna聚合酶啟動(dòng)子。同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，啟動(dòng)子為選自u(píng)6,h1,poli,polii和poliii的ran聚合酶啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，啟動(dòng)子為組織特異型啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，啟動(dòng)子為選自基于所選載體的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)選擇慢病毒載體時(shí)，啟動(dòng)子為u6,h1,cmvie基因,ef-1α,泛素c,或磷酸甘油激酶(pgk)啟動(dòng)子。其他常規(guī)表達(dá)控制序列包括可選標(biāo)記或報(bào)告基因，包括編碼遺傳霉素，潮霉素，氨芐青霉素或嘌呤霉素耐藥性等的核苷酸序列。載體的其他組件包括復(fù)制起點(diǎn)。

構(gòu)建載體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，這些技術(shù)包括常規(guī)克隆技術(shù)，例如在本發(fā)明實(shí)施例中所使用的shrna、聚合酶鏈反應(yīng)和任何適當(dāng)?shù)奶峁┧璧暮塑账嵝蛄械姆椒ā?/p>

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人構(gòu)建了共表達(dá)小發(fā)夾rna(shrna)(用來抑制免疫檢查點(diǎn))以及嵌合抗原受體(car)的病毒載體。本發(fā)明實(shí)施例的運(yùn)送沉默pd1或ctla4的sirna的小發(fā)夾rna以及表達(dá)嵌合抗原受體(car)的病毒載體或質(zhì)粒是復(fù)合的，此病毒 載體或質(zhì)?？山Y(jié)合聚合物或其他材料來增加其穩(wěn)定性，或協(xié)助其靶向運(yùn)動(dòng)。

制備轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的方法

本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將前面所述的構(gòu)建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細(xì)胞中或者t淋巴細(xì)胞。引入方式可以選自電轉(zhuǎn)或病毒感染宿主細(xì)胞的方式引入。所述構(gòu)建體或慢病毒成功引入上述淋巴細(xì)胞或者t淋巴細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查被沉默和抗cd19的嵌合抗原受體的表達(dá)，從而使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

治療癌癥的治療組合物

本發(fā)明的提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述治療組合物包括：上述構(gòu)建體、慢病毒、t淋巴細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和抗cd19嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，從而使得所得轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

提供給患者的這些治療組合物,較好的應(yīng)用于生物兼容溶液或可接受的藥學(xué)運(yùn)載載體。作為準(zhǔn)備的各種治療組合物被懸浮或溶解在醫(yī)藥上或生理上可接受的載體，如生理鹽水；等滲的鹽溶液或其他精于此道的人的比較明顯的配方中。適當(dāng)?shù)妮d體在很大程度上取決于給藥途徑。其他有水和無(wú)水的等滲無(wú)菌注射液和有水和無(wú)水的無(wú)菌懸浮液，是醫(yī)藥上可接受的載體。

足夠數(shù)量的病毒載體被轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶向t細(xì)胞中，并提供足夠強(qiáng)度的轉(zhuǎn)基因，沉默pd1或ctla4和表達(dá)特有的抗cd19嵌合抗原受體。治療試劑的劑量主要取決于治療狀況,年齡，體重，病人的健康程度，從而可能造成病人的變異性。

沉默pd1或ctla4或沉默pd1和ctla4和表達(dá)特有的cd19嵌合抗原受體的這些方法是聯(lián)合治療的一部分。這些病毒載體和用于過繼免疫治療的抗腫瘤t細(xì)胞，可以被單獨(dú)或結(jié)合其他治療癌癥的方法一起執(zhí)行。在合適的條件下，一個(gè)治療方法的發(fā)明包括使用一個(gè)或多個(gè)藥物療法。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述癌癥包括選自b細(xì)胞淋巴瘤或b細(xì)胞白血病的至少之一。細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)的沉默和抗cd19的嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞中的高效表達(dá)，使得所得淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生以及對(duì)對(duì)b細(xì)胞淋巴瘤或白血病的cd19⁺腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

提高淋巴細(xì)胞活性的方法

本發(fā)明提出了一種提高淋巴細(xì)胞活性的方法，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述淋巴細(xì)胞攜 帶嵌合抗原受體，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，所述細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)、所述淋巴細(xì)胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細(xì)胞活性所述淋巴細(xì)胞活性包括所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌能力和所述淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)被沉默，細(xì)胞因子分泌增多，對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用更強(qiáng)。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例中所用到的細(xì)胞系和基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)如下所述：

細(xì)胞系

實(shí)施例中用到下述細(xì)胞系:oci-ly3細(xì)胞(cd19⁺彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(dlbcl)),jurkat細(xì)胞(cd19^-t淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞系),和k562(自然殺傷細(xì)胞的靶細(xì)胞)。以上細(xì)胞均都來自于atcc(美國(guó)細(xì)胞庫(kù))及dsmz(德國(guó)細(xì)胞庫(kù))，并且培養(yǎng)于加有10％或20％胎牛血清和2毫升的左旋谷胺酰胺的rpmi–1640培養(yǎng)基中(購(gòu)自gibco-brl,sanfrancisco,ca,usa)。

慢病毒的產(chǎn)生和人t淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

產(chǎn)生復(fù)制缺陷的慢病毒載體，并將慢病毒載體離心收集用于人t淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。下面簡(jiǎn)要介紹慢病毒載體的產(chǎn)生、收集的實(shí)驗(yàn)過程：將293t細(xì)胞鋪在底面積為150-平方厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并根據(jù)說明書，使用express-in(購(gòu)自openbiosystems/thermoscientific,waltham,ma)對(duì)293t細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。每盤細(xì)胞加入15μg的慢病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒、5μg的pvsv-g(vsv糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒)、10μg的pcmvr8.74質(zhì)粒(gag/pol/tat/rev表達(dá)質(zhì)粒)和174μl的express-in(濃度為1μg/μl)。分別于24小時(shí)和48小時(shí)收集上清，并使用超速離心機(jī)在28,000rpm(離心機(jī)轉(zhuǎn)子為beckmansw32ti，購(gòu)自beckmancoulter,brea,ca)的條件下離心2小時(shí)。最后用0.75ml的rpmi-1640培養(yǎng)基對(duì)病毒質(zhì)粒沉淀進(jìn)行重懸。

從健康志愿者供體上分離人原代t淋巴細(xì)胞。人t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并使用抗cd3和cd28的單克隆抗體包被的磁珠(購(gòu)自invitrogen,carlsbad,ca)進(jìn)行刺激激活。人t淋巴細(xì)胞激活后的18～24小時(shí)，采用自旋-接種的方法對(duì)t淋巴細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo) 過程如下所述：在24-孔板中，每孔鋪有0.5×10⁶t淋巴細(xì)胞，向每孔細(xì)胞中加入0.75ml的上述重懸的病毒上清和polybrene(濃度為8μg/ml)。細(xì)胞和病毒質(zhì)粒的混合液在臺(tái)式離心機(jī)(購(gòu)自sorvallst40；thermoscientific)中離心，離心條件是室溫，2500rpm，時(shí)間為90分鐘。人重組白細(xì)胞介素-2(il-2；購(gòu)自novartis,basel,switzerland)每隔2～3天加入t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，il-2的終濃度為100-iu/ml,在t淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中，保持細(xì)胞的密度為0.5×10⁶～1×10⁶/ml。一旦被轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞出現(xiàn)休眠，例如細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢和細(xì)胞變小，其中，細(xì)胞生長(zhǎng)速度和大小是通過multisizer3coultercounter(購(gòu)自beckmancoulter)評(píng)估的，或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細(xì)胞在某個(gè)計(jì)劃的時(shí)間點(diǎn)上，t淋巴細(xì)胞即可用來做功能分析。

本申請(qǐng)的實(shí)施例中所用的流式細(xì)胞儀為bdfacscantoii(購(gòu)自bdbiosciences)，并且流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)使用flowjoversion7.2.5軟件(購(gòu)自treestar,ashland,or)進(jìn)行分析。

測(cè)定細(xì)胞因子的分泌

在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞(細(xì)胞個(gè)數(shù)是1×10⁶/孔)與oci-ly3淋巴瘤細(xì)胞(oci-ly3細(xì)胞表達(dá)cd19和pd-l1)共培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中改變不同的效靶細(xì)胞比例。應(yīng)用特定的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試劑盒，購(gòu)自r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的產(chǎn)量。上述細(xì)胞上清液取自培養(yǎng)了24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)之后的細(xì)胞的上清，測(cè)定結(jié)果用來衡量有代表性的細(xì)胞因子(干擾素-γ)(ifnγ)的產(chǎn)量。

簡(jiǎn)要測(cè)定過程如下：酶標(biāo)板中加入100微升/孔的作為一系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的細(xì)胞因子稀釋溶液(如ifnγ)或待測(cè)細(xì)胞上清溶液，并將酶標(biāo)板在室溫下放置2小時(shí)。2小時(shí)后吸棄酶標(biāo)板中溶液并用400微升的洗液潤(rùn)洗酶標(biāo)板，潤(rùn)洗四次。潤(rùn)洗后，向酶標(biāo)板每個(gè)孔中加入200微升的酶聯(lián)抗細(xì)胞因子抗體。繼續(xù)在室溫下放置2個(gè)小時(shí)，之后向每孔中加入200微升的底物溶液。加入底物溶液后，將酶標(biāo)板在室溫下放置30分鐘，之后，向每孔中加入50微升的終止反應(yīng)液。在30分鐘內(nèi)測(cè)定酶標(biāo)板每孔的光密度。酶標(biāo)儀設(shè)置在450nm。

鉻釋放實(shí)驗(yàn)

實(shí)施例中應(yīng)用4–小時(shí)⁵¹鉻釋放法分析評(píng)估表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體t細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

具體步驟如下：目標(biāo)測(cè)試細(xì)胞用⁵¹cr在37攝氏度下標(biāo)記1小時(shí)。標(biāo)記后，用含有10％胎牛血清(fcs)的rpmi培養(yǎng)基潤(rùn)洗細(xì)胞。潤(rùn)洗后，將細(xì)胞重懸在相同的培養(yǎng)基中，重懸細(xì)胞的濃度是1×10⁵/ml。轉(zhuǎn)導(dǎo)后t細(xì)胞以不同的效靶細(xì)胞比值(e：t)加入目標(biāo)測(cè)試細(xì)胞懸浮液中，并將細(xì)胞種在96-孔中，每孔體積是200微升。將細(xì)胞培養(yǎng)在37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后，從每孔中取出30微升的上清放于計(jì)數(shù)器的96-微孔板進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。分析儀 器是頂級(jí)計(jì)數(shù)nxt微閃爍計(jì)數(shù)器(購(gòu)自packardbioscience)。所有計(jì)數(shù)孔中效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目是基于t細(xì)胞總數(shù)來計(jì)算的。被標(biāo)記的目標(biāo)測(cè)試細(xì)胞包括oci-ly3(cd19⁺,pd-l1⁺),和jurkat(cd19^–)細(xì)胞.

實(shí)施例2構(gòu)建共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的載體

本實(shí)施例中，發(fā)明人將編碼有抗人體cd19的單鏈抗體的序列、cd28胞內(nèi)段和t細(xì)胞受體組合的ζ-鏈序列克隆到lv慢病毒載體上，克隆過程中，選擇的限制性酶切是xbai和noti雙酶切,以及noti和xhoi雙酶切,通過酶切、連接、篩選和目的質(zhì)粒的擴(kuò)增，生成連接有編碼抗cd19嵌合抗原受體核苷酸序列的慢病毒質(zhì)粒(lv-cd19car)；u6啟動(dòng)子和pd1-shrna(shpd1)的序列被克隆進(jìn)上述lv-cd19car的慢病毒質(zhì)粒，生成連接有shpd1序列和編碼抗cd19嵌合抗原受體的核苷酸序列的慢病毒質(zhì)粒(lv-cd19car-shpd1)。載體示意圖如圖1所示。圖1顯示了構(gòu)建相關(guān)lv慢病毒載體的示意圖(包含u6啟動(dòng)子、編碼人體shpd1的序列和編碼抗cd19嵌合抗原受體序列)。

實(shí)施例3共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力增強(qiáng)

在本實(shí)施例中，外周血淋巴細(xì)胞取自不記名供血者。外周血淋巴細(xì)胞通過梯度離心進(jìn)行分離，梯度離心機(jī)為ficoll-hypaque。t淋巴細(xì)胞與t細(xì)胞激活因子磁珠cd3/cd28(購(gòu)自invitrogen,carlsbad,ca)在5％co2、37攝氏度下孵育培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)基是加有2mmol/l谷氨酰胺,10％高溫滅活的胎牛血清(fcs)(購(gòu)自sigma-aldrichco.)和100u/ml的青霉素/鏈霉素雙抗的rpmi培養(yǎng)基1640(購(gòu)自invitrogengibcocat.no.12633-012)。激活培養(yǎng)72小時(shí)后，用洗液潤(rùn)洗細(xì)胞，將磁珠洗去。將t細(xì)胞種在鋪有重組纖連蛋白片段(fnch-296；retronectin)細(xì)胞培養(yǎng)皿上，并用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)導(dǎo)載體分別為lv-cd19car-shpd1，lv-cd19car，lv-shpd1或空載(lv-gfp)。轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如實(shí)施例1所述。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細(xì)胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并用重組人類il-2因子(100ng/ml；購(gòu)自r&dsystems)進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增7-10天，然后進(jìn)行功能測(cè)試實(shí)驗(yàn)。發(fā)明人測(cè)量轉(zhuǎn)導(dǎo)了不同慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞對(duì)(cd19^-和cd19⁺)淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用，效靶細(xì)胞比例是10：1，測(cè)量方法采用標(biāo)準(zhǔn)4–小時(shí)⁵¹鉻釋放法，4–小時(shí)⁵¹鉻釋放法如實(shí)施例1所述。結(jié)果如圖2所示。

如圖2結(jié)果所示,共表達(dá)shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的人t細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體或shpd1的t細(xì)胞,可更為有效的殺死oci-ly3淋巴瘤細(xì)胞(cd19⁺，pdl1⁺)。單獨(dú)表達(dá)shpd1的t細(xì)胞對(duì)cd19⁺淋巴瘤細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性。表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞或共表達(dá)shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞對(duì)jurkat(cd19^-)淋巴瘤細(xì)胞 沒有顯著殺傷作用?？蛰d質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)t淋巴細(xì)胞(對(duì)照t淋巴細(xì)胞)對(duì)cd19⁺或cd19^-淋巴瘤細(xì)胞均為明顯殺傷作用。

實(shí)施例4共表達(dá)shpd1和抗cd19嵌合抗原受體的t淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞因子分泌更的特點(diǎn)

在t淋巴細(xì)胞激活因子磁珠cd3/cd28存在下，被激活的t淋巴細(xì)胞經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、體外擴(kuò)增培養(yǎng)，方法如上所述.在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞(細(xì)胞個(gè)數(shù)是1×10⁶/孔)與cd19⁺/pdl1⁺的oci-ly3淋巴瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，3天后，用酶聯(lián)免疫吸附(elisa)法評(píng)估細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞的活性，elisa實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例1所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-cd19car-shpd1的t淋巴細(xì)胞比轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-cd19car或lv-shpd1載體的t淋巴細(xì)胞分泌更多的ifnγ(p<0.05；lv-cd19car-shpd1vs.lv-cd19car)。

實(shí)施例5共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞和共表達(dá)ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力增強(qiáng)，并且具有細(xì)胞因子分泌更多的特點(diǎn)

在本實(shí)施例中，發(fā)明人還考察共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力、細(xì)胞因子分泌能力，實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)施例3和實(shí)施例4相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)論與共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞類似，即共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體或ctla4-shrna的t細(xì)胞的靶向殺傷能力增強(qiáng)，細(xì)胞因子分泌增多。

發(fā)明人還考察共表達(dá)ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力、細(xì)胞因子分泌能力，實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)施例3和實(shí)施例4相同，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)ctla4-shrna、pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞的靶向殺傷能力和細(xì)胞因子分泌能力強(qiáng)于共表達(dá)ctla4-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞或共表達(dá)pd1-shrna和抗cd19嵌合抗原受體的t細(xì)胞。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。