本申請(qǐng)要求于2014年6月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.62/006,549的優(yōu)先權(quán)。該申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于肺癌的高風(fēng)險(xiǎn)篩選、診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：肺癌是一種特征在于肺組織中不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)的惡性肺腫瘤，它是美國(guó)男性和女性的主要癌癥殺手。全球整體上，死于肺癌的人多于乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌。然而，早期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的五年存活率高于50％。患有轉(zhuǎn)移性疾病的NSCLC患者的五年存活率降至5％以下。盡管早期檢測(cè)可以挽救生命，但仍然缺乏針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的篩選測(cè)試。螺旋低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(LDCT)已用于高風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查。然而，存在與LDCT篩查相關(guān)的多個(gè)缺點(diǎn)，包括假陰性、假陽(yáng)性、輻射暴露和經(jīng)濟(jì)成本。目前，沒(méi)有可用的使用體液諸如血液和痰對(duì)肺癌的非侵入性檢測(cè)。此外，通常在CT上檢測(cè)肺結(jié)節(jié)。據(jù)報(bào)道，高達(dá)51％的50歲或以上吸煙者在CT上有肺結(jié)節(jié)。在一些情況下，難以區(qū)分惡性結(jié)節(jié)和良性結(jié)節(jié)。建議對(duì)這些未確定的結(jié)節(jié)進(jìn)行連續(xù)CT，這增加了個(gè)體的實(shí)質(zhì)性輻射暴露和經(jīng)濟(jì)成本。用于區(qū)分惡性和良性結(jié)節(jié)的血液檢測(cè)將對(duì)患者非常有益。因此，迫切需要用于肺癌檢測(cè)和用于區(qū)分肺癌與良性肺結(jié)節(jié)的血液檢測(cè)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于肺癌的高風(fēng)險(xiǎn)篩選、診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的方法和系統(tǒng)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于診斷或評(píng)估受試者是否患有肺癌(諸如NSCLS)或處于患有肺癌(諸如NSCLS)的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。該方法包括從測(cè)試受試者的血液獲得細(xì)胞群的AKAP4基因的第一表達(dá)水平；以及將第一表達(dá)水平與第一預(yù)定參考值進(jìn)行比較。第一表達(dá)水平和第一預(yù)定參考值之間的差異與肺癌的診斷或評(píng)估相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，群體細(xì)胞是有核細(xì)胞群體。例如細(xì)胞可以是低密度細(xì)胞，包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和相關(guān)細(xì)胞(即，血液含有PBMC的級(jí)分)。在該方法中，第一預(yù)定參考值可以從選自以下的對(duì)照受試者獲得：(a)患有惡性疾病(例如肺癌)的吸煙者，(b)患有非惡性疾病的吸煙者，(c)患有非惡性疾病的前吸煙者，(d)沒(méi)有疾病的健康非吸煙者，(e)患有慢性阻塞性肺病(COPD)的非吸煙者，(f)患有COPD的前吸煙者，(g)在移除實(shí)體肺腫瘤的外科手術(shù)之前患有實(shí)體肺腫瘤的受試者，(h)在手術(shù)移除實(shí)體肺腫瘤之后患有所述腫瘤的受試者，(i)在治療實(shí)體肺腫瘤之前患有實(shí)體肺腫瘤的受試者，以及(j)在治療實(shí)體肺腫瘤期間或之后患有實(shí)體肺腫瘤的受試者。對(duì)照受試者(a)-(j)可以是在暫時(shí)的較早時(shí)間點(diǎn)的相同測(cè)試受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果第一表達(dá)水平高于從沒(méi)有患有肺癌的對(duì)照受試者獲得的第一預(yù)定參考值，則測(cè)試受試者被確定為患有肺癌或處于患有肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一些實(shí)施方案中，上述方法可以進(jìn)一步包括在獲得步驟之前從測(cè)試受試者的血液中分離或富集有核細(xì)胞或低密度細(xì)胞。獲得步驟可以包括從細(xì)胞群體提取總RNA，并測(cè)量從AKAP4基因轉(zhuǎn)錄的RNA的水平。測(cè)量步驟可以通過(guò)包括PCR，諸如RT-PCR，定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)，巢式PCR或巢式qRT-PCR的方法進(jìn)行。當(dāng)進(jìn)行巢式PCR時(shí)，可以使用分別產(chǎn)生第一擴(kuò)增子和第二擴(kuò)增子的第一引物對(duì)和第二引物對(duì)。優(yōu)選地，第二擴(kuò)增子不同于第一擴(kuò)增子，并且包括或包含在第一擴(kuò)增子內(nèi)。在一個(gè)實(shí)例中，第一引物對(duì)含有SEQID：5和6的序列，第二引物對(duì)含有SEQID：7和8的序列。除了AKAP4基因之外，該方法還可以包括檢測(cè)或測(cè)量選自以下的第二基因的表達(dá)：(a)乙型肝炎病毒x相關(guān)蛋白(HBXAP或RSF1)，(b)雙特異性酪氨酸-(Y)-磷酸化調(diào)節(jié)激酶2(DYRK2)，(c)YY1轉(zhuǎn)錄因子(YY1)，(d)染色體19開(kāi)放閱讀框12，轉(zhuǎn)錄變體1(C19orf12)，(e)硫酯酶超家族成員2(THEM2)，(f)三功能結(jié)構(gòu)域(PTPRF相互作用)(TRIO)，(g)骨髓相關(guān)分化標(biāo)志物，轉(zhuǎn)錄變體4(MYADM)，(h)BAI1相關(guān)蛋白2(BAIAP2)，(i)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域蛋白(FLJ22386或ROGDI)，(j)DnaJ(Hsp40)同源物，亞家族B，成員14(DNAJB14)，(k)腦和生殖器官表達(dá)的TNFRSF1A調(diào)節(jié)劑(BRE)，(l)跨膜蛋白41A(TMEM41A)，(m)染色體9開(kāi)放閱讀框64(C9orf64)，(n)染色體20開(kāi)放閱讀框55，轉(zhuǎn)錄變體1(C20orf55或FAM110A)，(o)pecanex-樣2PCNXL2，(p)RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)，(q)HSPC142蛋白(HSPC142或C19orf62)，(r)假定蛋白BC015148(LOC93081或C13orf27)，(s)激活信號(hào)共整合子1復(fù)合體亞單位3(ASCC3)(t)溶質(zhì)載體家族1，成員5(SLC1A5)，(u)含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結(jié)構(gòu)域蛋白1(PTPLAD1)，(v)MRE11減數(shù)分裂重組11同系物A(MRE11A)，(w)假定蛋白或GTP結(jié)合蛋白10(DKFZP686A10121或GTPBP10)(y)Soares胎肝脾1NFLScDNA克隆IMAGp998K18127，(z)絲氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制劑，進(jìn)化枝I(pancpin)，成員2(SERPINI2)，(aa)cDNAFLJ44370fis，克隆TRACH3008902或CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)，(bb)含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白53(CCDC53)，(cc)泛素特異性肽酶48(USP48)，以及(dd)含鋅指和SCAN結(jié)構(gòu)域蛋白2，轉(zhuǎn)錄變體3(ZSCAN2)，如美國(guó)專利8,476,420中所描述，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。在這種情況下，該方法包括獲得第二基因的第二表達(dá)水平，并以與上述相同的方式將第二基因的第二表達(dá)水平與第二預(yù)定參考值進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)例中，如果(i)第一表達(dá)水平高于第一預(yù)定參考值和(ii)第二表達(dá)水平高于第二預(yù)定參考值，則測(cè)試受試者被確定為患有肺癌或處于患有肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。上述方法允許獲得各種診斷或評(píng)價(jià)，包括診斷肺癌，診斷肺癌階段，診斷肺癌的類型或分類，診斷或檢測(cè)肺癌的復(fù)發(fā)，診斷或檢測(cè)肺癌的消退，肺癌預(yù)后，或評(píng)估肺癌對(duì)手術(shù)或非手術(shù)治療的響應(yīng)。因此，測(cè)試受試者可以是已經(jīng)進(jìn)行實(shí)體瘤切除術(shù)或化療的受試者。在上述方法中，獲得步驟還可包括使細(xì)胞、其RNA或由其產(chǎn)生的cDNA與在嚴(yán)格條件下與AKAP4基因的RNA或cDNA或其互補(bǔ)物雜交的探針接觸。探針可以沉積在固相支持物上，例如微陣列上。或者，為了獲得上述表達(dá)水平，可以使用相應(yīng)的抗體，包括將細(xì)胞或來(lái)自其的樣品與抗體諸如抗AKAP4抗體接觸。還可以對(duì)AKAP4的RNA或cDNA進(jìn)行測(cè)序以確定樣品中的AKAP4水平。在第二方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸組，其具有能夠產(chǎn)生AKAP4基因的RNA的第一擴(kuò)增子的第一寡核苷酸對(duì)或引物對(duì)；和/或能夠使用第一擴(kuò)增子作為模板產(chǎn)生所述RNA的第二擴(kuò)增子的第二寡核苷酸對(duì)。第一寡核苷酸對(duì)可以具有SEQID：5和6的序列；第二寡核苷酸對(duì)可以具有SEQIDNO：7和8的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于下述核酸序列設(shè)計(jì)和使用其它合適的引物。還提供了含有該寡核苷酸組和用于其的包裝材料的試劑盒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒可以進(jìn)一步包含選自緩沖液、DNA聚合酶、RNAse抑制劑、延伸核苷酸、隨機(jī)引物和探針的一種或多種試劑。在下面的描述中闡述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將從說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示來(lái)自NSCLC和對(duì)照的全血細(xì)胞樣品中AKAP4表達(dá)并且在全血樣品中NSCLC和對(duì)照之間沒(méi)有顯著差異。圖2表明，基于小發(fā)現(xiàn)樣品組，130個(gè)CTA的無(wú)偏差巢式PCR篩選將AKAP4和GAGE4鑒定為NSCLC診斷的潛在候選者。圖2A表明，AKAP4證明了基于其表達(dá)對(duì)來(lái)自NSCLC和對(duì)照組的樣品的完美分離。圖2B表明，僅有1個(gè)癌癥樣品通過(guò)GAGE4的表達(dá)而被錯(cuò)誤分類。圖3說(shuō)明在兩組NSCLC患者和對(duì)照中，AKAP4用作NSCLC的循環(huán)生物標(biāo)志物。圖3A示出了來(lái)自141個(gè)NSCLC患者和35個(gè)良性肺病患者的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)的ROC曲線。圖3B說(shuō)明在第二獨(dú)立患者隊(duì)列中AKAP4被證實(shí)為NSCLC的循環(huán)生物標(biāo)志物。顯示了來(lái)自123個(gè)NSCLC患者和100個(gè)對(duì)照的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)的ROC曲線。圖3C示出了隊(duì)列1和隊(duì)列2合并組的ROC曲線。點(diǎn)表示對(duì)應(yīng)于所選擇的最佳截?cái)帱c(diǎn)的性能。圖3D說(shuō)明了NSCLC和對(duì)照中AKAP4表達(dá)水平的分布。綠色虛線表示針對(duì)平衡靈敏度(92.8％)和特異性(92.6％)優(yōu)化的截?cái)帱c(diǎn)。圖4說(shuō)明了AKAP4是用于NSCLC早期檢測(cè)的基于血液的生物標(biāo)志物。圖4A示出了來(lái)自136個(gè)I期NSCLC患者和135個(gè)對(duì)照的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)的ROC曲線。AUC為0.9795。圖4B說(shuō)明來(lái)自264個(gè)NSCLC患者和27個(gè)良性肺結(jié)節(jié)患者的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)的ROC曲線。AUC為0.9825。圖4B示出了惡性和良性肺結(jié)節(jié)之間的區(qū)別。圖5說(shuō)明AKAP4表達(dá)與NSCLC階段相關(guān)。顯示每個(gè)NSCLC階段的平均AKAP4表達(dá)±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯示了差異倍數(shù)對(duì)階段I。圖6說(shuō)明AKAP4是用于NSCLC疾病監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)的循環(huán)生物標(biāo)志物。(患者vh.603)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定在來(lái)自NSCLC患者的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)：手術(shù)前；手術(shù)后6個(gè)月；和手術(shù)后12個(gè)月。AKAP4在手術(shù)前高表達(dá)，但在手術(shù)后6個(gè)月降至截?cái)帱c(diǎn)以下，這表明患者處于緩解。AKAP4表達(dá)在術(shù)后12個(gè)月增加到截?cái)帱c(diǎn)以上，這表明該患者患有肺癌。在陽(yáng)性AKAP4結(jié)果后大約4個(gè)月，通過(guò)CT掃描檢測(cè)到第二肺癌結(jié)節(jié)。(患者vh.621)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定在來(lái)自NSCLC患者的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)：手術(shù)前；手術(shù)后9個(gè)月；和手術(shù)后24個(gè)月。AKAP4在手術(shù)前高表達(dá)。手術(shù)后9個(gè)月AKAP4表達(dá)下降至截?cái)帱c(diǎn)以下，并且在手術(shù)后24個(gè)月保持在截?cái)帱c(diǎn)以下。隨訪的CT掃描未檢測(cè)到任何肺結(jié)節(jié)。該患者目前處于緩解。(患者vh.495)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定在來(lái)自NSCLC患者的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)：手術(shù)前；手術(shù)后9個(gè)月；和手術(shù)后36個(gè)月。AKAP4在手術(shù)前高表達(dá)。在手術(shù)后9個(gè)月AKAP4表達(dá)下降至截?cái)帱c(diǎn)以下，并且在手術(shù)后36個(gè)月保持在截?cái)帱c(diǎn)以下。隨訪的CT掃描未檢測(cè)到任何肺結(jié)節(jié)。該患者目前被評(píng)估為處于緩解。(患者vh.554)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定在來(lái)自NSCLC患者的PBMC樣品中AKAP4表達(dá)：手術(shù)后6個(gè)月；手術(shù)后32個(gè)月；和手術(shù)后37個(gè)月。AKAP4表達(dá)在手術(shù)后6個(gè)月處于截?cái)帱c(diǎn)以下，這表明這個(gè)患者處于緩解。AKAP4表達(dá)在術(shù)后32個(gè)月增加高于截?cái)帱c(diǎn)，這表明復(fù)發(fā)。CT掃描和隨后的活檢證實(shí)了復(fù)發(fā)的NSCLC。AKAP4表達(dá)在放射治療后3個(gè)月降低，但保持在截?cái)帱c(diǎn)以上，表明仍然存在殘留的癌癥。該患者在放射治療10個(gè)月后被診斷為轉(zhuǎn)移性肺癌。發(fā)明詳述本發(fā)明(至少部分)基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自受試者血液的有核或低密度細(xì)胞群中AKAP4基因的表達(dá)與肺癌高度相關(guān)，甚至在疾病的非常早期和其在治療后的復(fù)發(fā)。如本文所公開(kāi)的，本發(fā)明的AKAP4基因和相關(guān)方法和試劑可用于早期檢測(cè)早期肺癌的非侵入性檢測(cè)。該檢測(cè)還可用于區(qū)分惡性肺結(jié)節(jié)與良性結(jié)節(jié)，這在CT掃描中常常見(jiàn)到。發(fā)明人對(duì)縱向樣品的研究還顯示，該檢測(cè)可用作預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志來(lái)鑒定治療和疾病復(fù)發(fā)中的應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者。生物標(biāo)志物如本文所公開(kāi)，基于其在來(lái)自肺癌患者和健康受試者的血液的細(xì)胞群中改變的表達(dá)模式，將AKAP4基因鑒定為外周血標(biāo)志物。下面列出人AKAP4的兩種同種型的核酸和多肽序列。NM_003886(SEQIDNO:1)1ccagctggcagtcaaggctgtaggagggcatggagagttgaagaaaaaagcagtatcttg61aggcagactggaagagtcatcacagcatccaaatcaacaagaaaacatcattccagggtc121ctacatgatggcgtactctgatactacaatgatgtctgatgatattgactggttacgcag181ccacaggggtgtgtgcaaggtagatctctacaacccagaaggacagcaagatcaggaccg241gaaagtgatatgctttgtcgatgtgtccaccctgaatgtagaagataaagattacaagga301tgctgctagttccagctcagaaggcaacttaaacctgggaagtctggaagaaaaagagat361tatcgtgatcaaggacactgagaagaaagaccagtctaagacagagggatctgtatgcct421tttcaaacaagctccctctgatcctgtaagtgtcctcaactggcttctcagtgatctcca481gaagtatgccttgggtttccaacatgcactgagcccctcaacctctacctgtaaacataa541agtaggagacacagagggcgaatatcacagagcatcctctgagaactgctacagtgtcta601tgccgatcaagtgaacatagattatttgatgaacagacctcaaaacctacgtctagaaat661gacagcagctaaaaacaccaacaataatcaaagtccttcagctcctccagccaaacctcc721tagcactcagagagcagtcatttcccctgatggagaatgttctatagatgacctttcctt781ctacgtcaaccgactatcttctctggtaatccagatggcccataaggaaatcaaggagaa841gttggaaggtaaaagcaaatgccttcatcattcaatctgtccatcccctgggaacaaaga901gagaatcagtccccgaactcctgcgagcaagattgcttctgaaatggcctatgaagctgt961ggaactgacagctgcagaaatgcgtggcactggagaggagtccagggaaggtggccagaa1021aagctttctatatagcgaattatccaacaagagcaaaagtggagacaaacagatgtccca1081gagagagagcaaagaatttgcagattccatcagcaaggggctcatggtttatgcaaatca1141ggtggcatctgacatgatggtctctctcatgaagaccttgaaagtgcacagctctgggaa1201gccaattccagcatctgtggtcctgaagagggtgttgctaaggcacaccaaggagattgt1261gtccgatttgattgattcttgcatgaagaacctgcataatattactggggtcctgatgac1321tgactcagactttgtctcagctgtcaagagaaatctgttcaaccagtggaaacaaaatgc1381tacagacatcatggaggccatgctgaagcgcttggtcagtgcccttataggtgaggagaa1441ggagactaagtctcagagtctgtcatatgcatctttaaaagctgggtcccatgatcccaa1501atgcaggaatcagagtcttgaattctccaccatgaaagctgaaatgaaagagagggacaa1561aggcaaaatgaaatcagacccatgcaagtcactgactagtgctgagaaagtcggtgaaca1621cattctcaaagagggcctaaccatctggaaccaaaagcaaggaaactcatgcaaggtggc1681taccaaagcatgcagcaataaagatgagaaaggagaaaagatcaatgcttccacagattc1741actggccaaggacctgattgtctctgcccttaagctgatccagtaccatctgacccagca1801gactaagggcaaagatacatgtgaagaagactgtcctggttccaccatgggctatatggc1861tcagagtactcaatatgaaaagtgtggaggtggccaaagtgccaaagcactttcagtgaa1921acaactagaatctcacagagcccctggaccatccacctgtcaaaaggagaaccaacacct1981ggactcccagaaaatggatatgtcaaacatcgttctaatgctgattcagaaactgcttaa2041tgagaaccccttcaaatgtgaggatccatgcgaaggtgagaacaagtgttctgagcccag2101ggcaagcaaagcagcttccatgtccaacagatctgacaaagcggaagaacaatgccagga2161gcatcaagaacttgactgtaccagtgggatgaagcaagcgaacgggcaatttatagataa2221actagtagaatctgtgatgaagctctgccttatcatggctaagtatagcaacgatggggc2281agcccttgctgagttggaagaacaagcagcctcggcaaataagcccaatttcaggggcac2341cagatgcattcacagtggtgcaatgccacagaactatcaagactctcttggacatgaagt2401aattgtcaataatcagtgctctacaaatagcttgcagaagcagctccaggctgtcctgca2461gtggattgcagcctcccagtttaacgtgcccatgctctacttcatgggagataaggatgg2521acaactggaaaagcttcctcaggtttcagctaaagcagcagagaaggggtacagtgtagg2581aggtcttcttcaagaggtcatgaagtttgccaaggaacggcaaccagatgaagctgtggg2641aaaggtggccaggaaacagttgctggactggctgctcgctaacctgtgagctgatccttg2701actcctcttcatcttagcccccctagcagcattccatcccagccagagcacccccaccat2761caggccagtcaactgcacaatacacaactgtatttcccaatacacttgagcagttgcctg2821tgaatgtaagaggtgtcaacaaactgggaaataaaataaaaaaaaataataataaatgtg2881tNP_003877(SEQIDNO:2)MMAYSDTTMMSDDIDWLRSHRGVCKVDLYNPEGQQDQDRKVICFVDVSTLNVEDKDYKDAASSSSEGNLNLGSLEEKEIIVIKDTEKKDQSKTEGSVCLFKQAPSDPVSVLNWLLSDLQKYALGFQHALSPSTSTCKHKVGDTEGEYHRASSENCYSVYADQVNIDYLMNRPQNLRLEMTAAKNTNNNQSPSAPPAKPPSTQRAVISPDGECSIDDLSFYVNRLSSLVIQMAHKEIKEKLEGKSKCLHHSICPSPGNKERISPRTPASKIASEMAYEAVELTAAEMRGTGEESREGGQKSFLYSELSNKSKSGDKQMSQRESKEFADSISKGLMVYANQVASDMMVSLMKTLKVHSSGKPIPASVVLKRVLLRHTKEIVSDLIDSCMKNLHNITGVLMTDSDFVSAVKRNLFNQWKQNATDIMEAMLKRLVSALIGEEKETKSQSLSYASLKAGSHDPKCRNQSLEFSTMKAEMKERDKGKMKSDPCKSLTSAEKVGEHILKEGLTIWNQKQGNSCKVATKACSNKDEKGEKINASTDSLAKDLIVSALKLIQYHLTQQTKGKDTCEEDCPGSTMGYMAQSTQYEKCGGGQSAKALSVKQLESHRAPGPSTCQKENQHLDSQKMDMSNIVLMLIQKLLNENPFKCEDPCEGENKCSEPRASKAASMSNRSDKAEEQCQEHQELDCTSGMKQANGQFIDKLVESVMKLCLIMAKYSNDGAALAELEEQAASANKPNFRGTRCIHSGAMPQNYQDSLGHEVIVNNQCSTNSLQKQLQAVLQWIAASQFNVPMLYFMGDKDGQLEKLPQVSAKAAEKGYSVGGLLQEVMKFAKERQPDEAVGKVARKQLLDWLLANLNM_139289(SEQIDNO:3)1caggggtggcagccaactgcaggtgcccaagaacttggcacttctcagttccatctaaag61gggcacatctcccttctgggtgtcacgttttcagccaaacatctaaaagaacttcatcat121caagatgtctgatgatattgactggttacgcagccacaggggtgtgtgcaaggtagatct181ctacaacccagaaggacagcaagatcaggaccggaaagtgatatgctttgtcgatgtgtc241caccctgaatgtagaagataaagattacaaggatgctgctagttccagctcagaaggcaa301cttaaacctgggaagtctggaagaaaaagagattatcgtgatcaaggacactgagaagaa361agaccagtctaagacagagggatctgtatgccttttcaaacaagctccctctgatcctgt421aagtgtcctcaactggcttctcagtgatctccagaagtatgccttgggtttccaacatgc481actgagcccctcaacctctacctgtaaacataaagtaggagacacagagggcgaatatca541cagagcatcctctgagaactgctacagtgtctatgccgatcaagtgaacatagattattt601gatgaacagacctcaaaacctacgtctagaaatgacagcagctaaaaacaccaacaataa661tcaaagtccttcagctcctccagccaaacctcctagcactcagagagcagtcatttcccc721tgatggagaatgttctatagatgacctttccttctacgtcaaccgactatcttctctggt781aatccagatggcccataaggaaatcaaggagaagttggaaggtaaaagcaaatgccttca841tcattcaatctgtccatcccctgggaacaaagagagaatcagtccccgaactcctgcgag901caagattgcttctgaaatggcctatgaagctgtggaactgacagctgcagaaatgcgtgg961cactggagaggagtccagggaaggtggccagaaaagctttctatatagcgaattatccaa1021caagagcaaaagtggagacaaacagatgtcccagagagagagcaaagaatttgcagattc1081catcagcaaggggctcatggtttatgcaaatcaggtggcatctgacatgatggtctctct1141catgaagaccttgaaagtgcacagctctgggaagccaattccagcatctgtggtcctgaa1201gagggtgttgctaaggcacaccaaggagattgtgtccgatttgattgattcttgcatgaa1261gaacctgcataatattactggggtcctgatgactgactcagactttgtctcagctgtcaa1321gagaaatctgttcaaccagtggaaacaaaatgctacagacatcatggaggccatgctgaa1381gcgcttggtcagtgcccttataggtgaggagaaggagactaagtctcagagtctgtcata1441tgcatctttaaaagctgggtcccatgatcccaaatgcaggaatcagagtcttgaattctc1501caccatgaaagctgaaatgaaagagagggacaaaggcaaaatgaaatcagacccatgcaa1561gtcactgactagtgctgagaaagtcggtgaacacattctcaaagagggcctaaccatctg1621gaaccaaaagcaaggaaactcatgcaaggtggctaccaaagcatgcagcaataaagatga1681gaaaggagaaaagatcaatgcttccacagattcactggccaaggacctgattgtctctgc1741ccttaagctgatccagtaccatctgacccagcagactaagggcaaagatacatgtgaaga1801agactgtcctggttccaccatgggctatatggctcagagtactcaatatgaaaagtgtgg1861aggtggccaaagtgccaaagcactttcagtgaaacaactagaatctcacagagcccctgg1921accatccacctgtcaaaaggagaaccaacacctggactcccagaaaatggatatgtcaaa1981catcgttctaatgctgattcagaaactgcttaatgagaaccccttcaaatgtgaggatcc2041atgcgaaggtgagaacaagtgttctgagcccagggcaagcaaagcagcttccatgtccaa2101cagatctgacaaagcggaagaacaatgccaggagcatcaagaacttgactgtaccagtgg2161gatgaagcaagcgaacgggcaatttatagataaactagtagaatctgtgatgaagctctg2221ccttatcatggctaagtatagcaacgatggggcagcccttgctgagttggaagaacaagc2281agcctcggcaaataagcccaatttcaggggcaccagatgcattcacagtggtgcaatgcc2341acagaactatcaagactctcttggacatgaagtaattgtcaataatcagtgctctacaaa2401tagcttgcagaagcagctccaggctgtcctgcagtggattgcagcctcccagtttaacgt2461gcccatgctctacttcatgggagataaggatggacaactggaaaagcttcctcaggtttc2521agctaaagcagcagagaaggggtacagtgtaggaggtcttcttcaagaggtcatgaagtt2581tgccaaggaacggcaaccagatgaagctgtgggaaaggtggccaggaaacagttgctgga2641ctggctgctcgctaacctgtgagctgatccttgactcctcttcatcttagcccccctagc2701agcattccatcccagccagagcacccccaccatcaggccagtcaactgcacaatacacaa2761ctgtatttcccaatacacttgagcagttgcctgtgaatgtaagaggtgtcaacaaactgg2821gaaataaaataaaaaaaaataataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaNP_647450(SEQIDNO:4)MSDDIDWLRSHRGVCKVDLYNPEGQQDQDRKVICFVDVSTLNVEDKDYKDAASSSSEGNLNLGSLEEKEIIVIKDTEKKDQSKTEGSVCLFKQAPSDPVSVLNWLLSDLQKYALGFQHALSPSTSTCKHKVGDTEGEYHRASSENCYSVYADQVNIDYLMNRPQNLRLEMTAAKNTNNNQSPSAPPAKPPSTQRAVISPDGECSIDDLSFYVNRLSSLVIQMAHKEIKEKLEGKSKCLHHSICPSPGNKERISPRTPASKIASEMAYEAVELTAAEMRGTGEESREGGQKSFLYSELSNKSKSGDKQMSQRESKEFADSISKGLMVYANQVASDMMVSLMKTLKVHSSGKPIPASVVLKRVLLRHTKEIVSDLIDSCMKNLHNITGVLMTDSDFVSAVKRNLFNQWKQNATDIMEAMLKRLVSALIGEEKETKSQSLSYASLKAGSHDPKCRNQSLEFSTMKAEMKERDKGKMKSDPCKSLTSAEKVGEHILKEGLTIWNQKQGNSCKVATKACSNKDEKGEKINASTDSLAKDLIVSALKLIQYHLTQQTKGKDTCEEDCPGSTMGYMAQSTQYEKCGGGQSAKALSVKQLESHRAPGPSTCQKENQHLDSQKMDMSNIVLMLIQKLLNENPFKCEDPCEGENKCSEPRASKAASMSNRSDKAEEQCQEHQELDCTSGMKQANGQFIDKLVESVMKLCLIMAKYSNDGAALAELEEQAASANKPNFRGTRCIHSGAMPQNYQDSLGHEVIVNNQCSTNSLQKQLQAVLQWIAASQFNVPMLYFMGDKDGQLEKLPQVSAKAAEKGYSVGGLLQEVMKFAKERQPDEAVGKVARKQLLDWLLANL上述發(fā)現(xiàn)是令人驚訝和出人意料的，因?yàn)橐呀?jīng)進(jìn)行努力來(lái)鑒定外周血單核細(xì)胞中的基因表達(dá)譜，其可以區(qū)分患有非小細(xì)胞肺癌的患者和患有非惡性肺疾病的患者。例如Showeetal.CancerRes.2009Dec15；69(24):9202-10和美國(guó)專利8,476,420描述了分離這兩類的29-基因標(biāo)簽(signature)。然而，AKAP4基因不在所述29個(gè)基因之列。另外，如本文所公開(kāi)的，基于來(lái)自血液的低密度細(xì)胞或含PBMC的級(jí)分中的AKAP4基因表達(dá)的測(cè)試的特異性和靈敏度優(yōu)于已知使用體液的肺癌檢測(cè)方法，體液包括血漿、痰、血清或PBMC。事實(shí)上，下面實(shí)例中所示的結(jié)果(包括ROC曲線分析的AUC)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于基于其它外周血標(biāo)志物的常規(guī)方法。此外，這里公開(kāi)的研究使用的樣本大小大于其他，這表明AKAP4基因表達(dá)在肺癌的早期檢測(cè)、惡性和良性肺結(jié)節(jié)的區(qū)分和肺癌復(fù)發(fā)檢測(cè)中的應(yīng)用。AKAP4基因表達(dá)可以單獨(dú)使用或與其它已知的肺癌標(biāo)志物組合使用。這樣的已知標(biāo)志物的實(shí)例包括在Showeetal.CancerRes.2009Dec15；69(24):9202-10和美國(guó)專利8,476,420中描述的那些，這兩篇文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。本文公開(kāi)的用于早期肺癌檢測(cè)的發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是顯著的。在所患癌癥在早期檢測(cè)并可治療的肺癌患者的5年生存率為50-70％。轉(zhuǎn)移性疾病患者的5年生存率低于5％。目前只有15％的肺癌患者在早期被診斷出。本文公開(kāi)的發(fā)明允許在非常早期檢測(cè)肺癌，從而顯著改善肺癌患者的存活并減少肺癌死亡。診斷和預(yù)后方法本文公開(kāi)的標(biāo)志物、相關(guān)試劑盒、試劑和系統(tǒng)可用于確定受試者是否患有肺癌或處于患有肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。或者，它們可用于確定受試者中此類疾病的預(yù)后。診斷方法在一個(gè)方面，本發(fā)明提供定性和定量信息以確定受試者是否患有肺癌或有肺癌傾向性?；加蟹伟┗蛞子诨加蟹伟┑氖茉囌呖梢曰趤?lái)自受試者的測(cè)試樣品中的上述基因或其表達(dá)產(chǎn)物(RNA或多肽)的表達(dá)水平、模式或圖譜來(lái)確定。換句話說(shuō)，產(chǎn)物可以用作指示病癥存在或不存在的標(biāo)志物。本發(fā)明的診斷和預(yù)后測(cè)定包括用于評(píng)估產(chǎn)物表達(dá)水平的方法。該方法和試劑盒允許檢測(cè)肺癌。例如來(lái)自血液的含PBMC的級(jí)分中AKAP4基因表達(dá)水平的相對(duì)增加表示存在該病癥。相反，較低的表達(dá)水平或缺乏表達(dá)指示缺乏該病癥。測(cè)試樣品中表達(dá)產(chǎn)物的存在、水平或不存在可通過(guò)獲得來(lái)自測(cè)試受試者的測(cè)試樣品和將測(cè)試樣品與能夠檢測(cè)核酸的化合物或試劑(例如RNA或DNA探針)接觸來(lái)評(píng)價(jià)。測(cè)試樣品包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及受試者內(nèi)存在的組織、細(xì)胞和流體。感興趣的基因的表達(dá)水平可以多種方式測(cè)量，包括測(cè)量由基因編碼的RNA。可以使用許多眾所周知的方法中的任一種從生物樣品中分離所表達(dá)的RNA樣品。例如生物樣品可以在基于胍鹽的裂解緩沖液(任選地含有額外的組分以穩(wěn)定RNA)中裂解。在一些實(shí)施方案中，裂解緩沖液可含有純化的RNA作為對(duì)照以監(jiān)測(cè)來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的RNA的回收和穩(wěn)定性。此類純化的RNA模板的例子包括購(gòu)自Promega(Madison，WI)的卡那霉素陽(yáng)性對(duì)照RNA和購(gòu)自LifeTechnologies(Rockville，MD)的7.5kb的多聚(A)尾RNA的RNA。裂解物可立即使用或在例如-80℃下冷凍儲(chǔ)存。任選地，可以使用基于二氧化硅的自動(dòng)化兼容的96孔形式(諸如RNEASY純化平臺(tái)(QIAGEN，Inc.，Valencia，CA))從細(xì)胞裂解物(或其他類型的樣品)中純化總RNA。也考慮其它RNA分離方法，例如用二氧化硅涂覆的珠或胍鹽提取。用于RNA分離和制備的其它方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)?？梢允褂么謽悠?例如血液、血清、血漿或細(xì)胞裂解物)進(jìn)行本發(fā)明的方法。任選將RNAse抑制劑加入粗樣品中。當(dāng)使用粗細(xì)胞裂解物時(shí)，應(yīng)注意，根據(jù)樣品，基因組DNA可貢獻(xiàn)靶序列(例如基因)的一個(gè)或多個(gè)拷貝。在靶序列來(lái)源于一個(gè)或多個(gè)高度表達(dá)的基因的情況下，來(lái)自基因組DNA的信號(hào)可能不顯著。但是對(duì)于以低水平表達(dá)的基因，可以通過(guò)用DNAse處理樣品，或通過(guò)使用靶向用于隨后引發(fā)cDNA或擴(kuò)增產(chǎn)物的剪接接頭的引物，來(lái)消除背景?？梢栽谠缓腕w外測(cè)定細(xì)胞中對(duì)應(yīng)于基因的RNA水平。從測(cè)試樣品分離的RNA或從其制備的cDNA可用于測(cè)序、雜交或擴(kuò)增測(cè)定，包括Southern或Northern分析、PCR分析和探針陣列。用于檢測(cè)RNA水平的示例性診斷方法包括使分離的RNA或cDNA或cRNA與可與由基因編碼的RNA雜交的核酸探針接觸。探針可以是全長(zhǎng)核酸或其部分，諸如長(zhǎng)度為至少10個(gè)核苷酸并且足以在嚴(yán)格條件下與RNA特異性雜交的寡核苷酸。在一種形式中，RNA(或從其制備的cDNA)被固定在表面上，并與探針接觸，例如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上電泳分離的RNA并從凝膠轉(zhuǎn)移RNA至膜，諸如硝酸纖維素膜。在另一種形式中，探針被固定在表面上，并且RNA(或cDNA或cRNA)與探針接觸，例如在基因芯片陣列中。技術(shù)人員可以改變用于檢測(cè)RNA(或從其制備的cDNA或cRNA)的水平的已知的RNA檢測(cè)方法。樣品中由待檢測(cè)基因編碼的RNA(或由其制備的cDNA)水平可以用核酸擴(kuò)增，例如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR(美國(guó)專利號(hào)4,683,202)、RT-PCR(BustinS.JMolEndocrinol.25:169-93,2000)、定量PCR(OngY.etal,Hematology.7:59-67,2002)、實(shí)時(shí)PCR(GinzingerD.ExpHematol.30:503-12,2002)和原位PCR(ThakerV.MethodsMolBiol.115:379-402,1999)或任何其它核酸擴(kuò)增方法來(lái)評(píng)估，隨后使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括使對(duì)照樣品與能夠檢測(cè)基因的RNA的化合物或試劑接觸，并將對(duì)照樣品中的RNA的存在與測(cè)試樣品中RNA的存在進(jìn)行比較。上述方法和標(biāo)志物可用于評(píng)估受試者形成肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。特別地，本發(fā)明可以應(yīng)用于已經(jīng)具有某些風(fēng)險(xiǎn)的高風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列中的那些人，以便獲得針對(duì)早期檢測(cè)的關(guān)鍵信息。與肺癌相關(guān)的基因產(chǎn)物水平的變化可以在受試者的細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表型或致瘤性表型形成之前或其早期階段檢測(cè)到。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選處于形成肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者的方法，包括評(píng)估在血液的含有PBMC級(jí)分中的AKAP4基因表達(dá)水平，以及任選的在從受試者獲得的生物樣品中上述其它標(biāo)志物中一種或多種的水平。因此，與對(duì)照樣品中相應(yīng)基因產(chǎn)物的水平相比，生物樣品中的基因產(chǎn)物或基因產(chǎn)物組合的水平的差異或改變指示了受試者處于形成肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。用于這種篩選的生物樣品可以包括來(lái)自受試者血液的細(xì)胞群體，細(xì)胞群體是正常的或懷疑是癌前期的。具有與肺癌相關(guān)的一種或多種基因產(chǎn)物水平變化的受試者是進(jìn)一步監(jiān)測(cè)和測(cè)試的候選者。這樣的進(jìn)一步測(cè)試可包括組織樣品的組織學(xué)檢查、CT或本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的其他技術(shù)?！霸\斷”或“評(píng)估”是指診斷肺癌，診斷肺癌階段，診斷肺癌的類型或分類，診斷或檢測(cè)肺癌的復(fù)發(fā)，診斷或檢測(cè)肺癌的消退，肺癌預(yù)后，或評(píng)估肺癌對(duì)手術(shù)或非手術(shù)治療的響應(yīng)。通常，疾病或病癥的診斷是基于對(duì)指示該疾病的一種或多種因素和/或癥狀的評(píng)估。也就是說(shuō)，可以基于指示疾病或病癥存在或不存在的因素的存在、不存在或量來(lái)進(jìn)行診斷。被認(rèn)為指示特定疾病的診斷的每個(gè)因素或癥狀不需要僅與特定疾病相關(guān)；即可以存在可以從診斷因素或癥狀推斷的差異診斷。同樣，可能存在這種情況，即指示特定疾病的因素或癥狀存在于不具有該特定疾病的個(gè)體中。診斷方法可以獨(dú)立地使用，或與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已知用于特定疾病或病癥例如肺癌的其它診斷和/或分期方法組合使用。預(yù)后方法上述診斷方法可以鑒定患有肺癌或具有發(fā)展成肺癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者。此外，生物樣品(例如血液的含PBMC的級(jí)分)中上述基因(或其子集)的表達(dá)水平和/或趨勢(shì)的變化可以提供其恢復(fù)或缺乏的早期指示。例如AKAP4基因的進(jìn)一步增加(或下降)或持續(xù)改變的基因表達(dá)水平指示不良預(yù)后，即缺乏改善或健康下降。因此，這些基因允許評(píng)估癌癥的治療后恢復(fù)。該選擇的基因組或其子集的分析指示了病況的結(jié)果。本文所述的預(yù)后測(cè)定可用于確定受試者是否適合施用試劑(例如激動(dòng)劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其它藥物候選物)治療肺癌。例如，這樣的測(cè)定可以用于確定受試者是否可以施用化療劑。因此，本發(fā)明還提供了監(jiān)測(cè)受試者中肺癌的治療的方法。為此目的，可以在經(jīng)歷治療之前、期間或之后，測(cè)定來(lái)自受試者的測(cè)試樣品的本文公開(kāi)的基因(例如AKAP4)的基因表達(dá)水平。然后評(píng)估與基線水平相比的水平變化的幅度。治療后變化幅度的降低表明受試者可以通過(guò)相同的治療進(jìn)一步治療。例如一種或多種上調(diào)基因(例如AKAP4)的表達(dá)水平的相對(duì)降低指示從該病癥中恢復(fù)。相反，一種或多種上調(diào)基因的進(jìn)一步增加或持續(xù)的高表達(dá)水平表明缺乏改善或健康下降。實(shí)施上述測(cè)定所獲得的信息可用于影響個(gè)體受試者的健康狀況的疾病和其他有害病況的預(yù)后、鑒定其進(jìn)展和臨床管理。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，前述診斷測(cè)定提供了用于肺癌的預(yù)后、鑒定其進(jìn)展和管理的信息。該信息更具體地輔助臨床醫(yī)生設(shè)計(jì)化療或其它治療方案以從受折磨的受試者(人)的身體中消除這種病況。本文使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”是指預(yù)測(cè)臨床病況或疾病的可能的過(guò)程和結(jié)果，例如癌癥歸因的死亡或進(jìn)展的可能性，包括致瘤性疾病(諸如肺癌)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和耐藥性。預(yù)后通常通過(guò)評(píng)價(jià)疾病的指示疾病有利或不利過(guò)程或結(jié)果的因素或癥狀來(lái)完成。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)測(cè)”是指患者對(duì)藥物或藥物組有利地或不利地響應(yīng)的可能性，以及這些響應(yīng)的程度，或者患者在去除原發(fā)性腫瘤的手術(shù)后將存活和/或化療一段時(shí)間而沒(méi)有癌癥復(fù)發(fā)的可能性。本發(fā)明的預(yù)測(cè)方法可以臨床上用于通過(guò)為任何特定患者選擇最合適的治療方式來(lái)作出治療決定。本文所述的預(yù)測(cè)方法是預(yù)測(cè)患者是否可能對(duì)治療方案(諸如外科手術(shù)干預(yù)、使用給定藥物或藥物組合的化療和/或放射治療)有利地響應(yīng)、或在手術(shù)之后和/或化療或終止化療或其他治療方式后患者是否可能長(zhǎng)期存活的有用工具。本文所用的短語(yǔ)“確定預(yù)后”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)患者中病況的進(jìn)程或結(jié)果的方法。術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”不是指以100％準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)病況的進(jìn)程或結(jié)果的能力，相反，技術(shù)人員將理解術(shù)語(yǔ)“預(yù)后”是指將發(fā)生某一進(jìn)程或結(jié)果的概率增加；即，當(dāng)與沒(méi)有表現(xiàn)出給定病況的那些個(gè)體相比，呈現(xiàn)給定病況的患者更可能發(fā)生進(jìn)程(course)或結(jié)果(outcome)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“有利的預(yù)后”和“陽(yáng)性預(yù)后”或“不利的預(yù)后”和“陰性預(yù)后”是用于預(yù)測(cè)病況或疾病的可能過(guò)程和/或可能的結(jié)果的相對(duì)術(shù)語(yǔ)。有利的或積極的預(yù)后比不利的或消極的預(yù)后預(yù)測(cè)了病況更好的結(jié)果。在一般意義上，“有利的預(yù)后”是比可能與特定病況相關(guān)聯(lián)的許多其它可能預(yù)后相對(duì)更好的結(jié)果，而不利的預(yù)后預(yù)測(cè)了比可與特定病況相關(guān)聯(lián)的許多其它可能預(yù)后相對(duì)更差的結(jié)果。有利的或積極的預(yù)后的典型實(shí)例包括比平均治愈率更好、轉(zhuǎn)移傾向更低、預(yù)期壽命更長(zhǎng)、癌性過(guò)程與良性過(guò)程的區(qū)分等。例如，陽(yáng)性預(yù)后是這樣的預(yù)后，其中患者在治療后具有50％的特定癌癥治愈概率，而患有相同癌癥的普通患者僅有25％的治愈概率。檢測(cè)外周血中的AKAP4AKAP4是A激酶錨蛋白的成員，其結(jié)合蛋白激酶A(PKA)調(diào)節(jié)亞單位并且起到將PKA錨定到特定細(xì)胞位置的作用。AKAP4是位于X染色體上的已知的癌/睪丸基因，并且已經(jīng)顯示在多種不同的癌癥中(AgarwalS,etal.JournaloftheInternationalGynecologicalCancerSociety2013；23(4):650-8；AgarwalS,etal.Oncoimmunology2013；2(5):e24270；和Chiriva-InternatiM,etal.Chest2014)以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)(Chiriva-InternatiM,etal.Chest2014)上異常表達(dá)。它已經(jīng)被鑒定為腫瘤抗原，并且作為宮頸癌和卵巢癌(AgarwalS,etal.JournaloftheInternationalGynecologicalCancerSociety2013；23(4):650-8；AgarwalS,etal.Oncoimmunology2013；2(5):e24270)，多發(fā)性骨髓瘤(MirandolaL,etal.Cancer2011；11:394)、乳腺癌(SainiS,etal.PLoSOne2013；8(2):e57095)、前列腺癌(Chiriva-InternatiM,etal.Prostate2012；72(1):12-23)的潛在治療靶標(biāo)，并且對(duì)于NSCLC是重要的(Chiriva-InternatiM,etal.Chest2014)。由于AKAP4的表達(dá)通常限于睪丸(HofmannO,etal.ProcNatlAcadSciUSA2008；105(51):20422-7)，無(wú)癌對(duì)照中的背景表達(dá)基本上是陰性的。雖然在PBMC樣品中檢測(cè)到該信息提高了與CTC相關(guān)的可能性表達(dá)，但是CTC數(shù)，特別是在我們的早期樣品中的CTC數(shù)預(yù)計(jì)相當(dāng)?shù)?。AKAP4信號(hào)的另一個(gè)潛在來(lái)源是腫瘤衍生的外來(lái)體，其被大量釋放并被腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(包括包含在PBMC級(jí)分中的巨噬細(xì)胞)吞噬(IeroM,etal.CellDeathDiffer2007；15(l):80-88；YangC,etal.ClinicalandDevelopmentalImmunology2011；2011:11；BurkeM,etal.JournalofProteomeResearch2013；13(2):836-43；和ClaytonA,etal.CancerResearch2007；67(15):7458-66)。由于肺中存在腫瘤而在PBMC級(jí)分中的特異性免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)低水平表達(dá)這一第三種選項(xiàng)不能被排除，但似乎不太可能。上述方法包括檢測(cè)血液的含PBMC級(jí)分中AKAP4基因的表達(dá)。如本文所公開(kāi)的，人AKAP4基因通常不在外周血細(xì)胞中表達(dá)。即使在癌癥患者中，外周血中AKAP4基因表達(dá)的水平也極低。為了檢測(cè)或評(píng)估AKAP4基因表達(dá)水平，優(yōu)選在測(cè)定前從血液富集或分離包括單核細(xì)胞的低密度細(xì)胞群體以獲得血液的含有PBMC的級(jí)分。實(shí)際上，如以下實(shí)施例所示，當(dāng)使用全血時(shí)，AKAP4表達(dá)不允許將肺癌與對(duì)照區(qū)分開(kāi)。如本文所使用的，“低密度細(xì)胞”是指來(lái)自血液的細(xì)胞，其密度低于粒細(xì)胞或紅細(xì)胞的密度且高于血漿，使得在Ficoll密度梯度分離(諸如下述的BDCPTTM細(xì)胞制備管)中，它們?cè)诹＜?xì)胞或紅細(xì)胞層和Ficoll(或密度梯度液體)層上方和血漿層下方的層中。換句話說(shuō)，低密度細(xì)胞與PBMC共遷移并包括PBMC。低密度細(xì)胞的實(shí)例包括使用從血液中分離PBMC的方法與PBMC共純化的PBMC的單核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)和其它細(xì)胞。因此，低密度細(xì)胞群也稱為血液的含有PBMC的級(jí)分。如本文所使用的，“單核細(xì)胞”是指存在于外周血中并具有單圓核的細(xì)胞。這些細(xì)胞可以下面實(shí)施例部分所述的方式從全血中提取。例如，它們可以使用ficoll(親水多糖)分離或富集，ficoll將血液分離成頂層血漿，然后是含有PBMC的級(jí)分層以及多形核細(xì)胞(諸如嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)和紅細(xì)胞的底部級(jí)分。含有低密度細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分可以使用用于分離或富集PBMC的幾種方法獲得。下面提供了使用BDCPTTM細(xì)胞制備管的用于獲得這種含PBMC的細(xì)胞級(jí)分的示例性操作方案：1.將6-8ml血液收集在CPT真空采血管中或作為用于FicollHypagque梯度的抗凝血液樣品，并如下進(jìn)行2.在室溫(18-25℃)下在水平轉(zhuǎn)子(水平轉(zhuǎn)頭)中以3130RPM離心樣品30分鐘-在SorvalCentrifugeinTissueCultureRm上-BrakeOFF-Flatbelow)。3.離心后，單核細(xì)胞和血小板將在正好在血漿層(頂層)下面的發(fā)白層(第二層)中。吸出血漿頂層至一些漂白劑，而不干擾單核細(xì)胞層。4.用1ml或5ml移液管收集單核細(xì)胞層，并緩慢推入新管15ml錐形管中。5.倒PBS以填充15ml藍(lán)色管并倒置管。(這是減少PBMC層中存在的血小板數(shù)量的第一洗滌步驟)。6.在室溫下以1335RPM離心15分鐘-在SorvalCentrifugeinTissueCultureRm上)(BRAKEON)。7.盡可能多地吸出上清液而不干擾沉淀-留下約1ml上清液與沉淀用于重懸浮。用手指輕敲試管，將沉淀重懸于1ml上清液中。8.加入PBS以使體積再次在15ml管中增加。通過(guò)倒置管混合。(這是減少PBMC層中存在的血小板數(shù)量的第二洗滌步驟)。9.在室溫下以1335RPM離心15分鐘-在SorvalCentrifugeinTissueCultureRm上)(BRAKEON)。10.吸出所有上清液而不干擾沉淀。丟棄上清液至一些漂白劑。將含有沉淀的管倒置，并在室溫下靜置2分鐘以排出所有上清液。一旦獲得含有PBMC的細(xì)胞級(jí)分，可以使用PCR測(cè)量AKAP4基因表達(dá)。由于外周血中AKAP4基因表達(dá)水平極低，因此常規(guī)PCR的靈敏度可能不足以檢測(cè)它。因此，應(yīng)使用更靈敏的方法。例如，可以使用具有兩輪或更多輪PCR的方法，例如巢式PCR。如下文實(shí)施例中所示，定量巢式RT-PCR成功地用于測(cè)定血液(或PBMC)中AKAP4的表達(dá)，并且顯示生物標(biāo)志物能夠檢測(cè)早期肺癌和復(fù)發(fā)，并且區(qū)分惡性和良性肺結(jié)節(jié)。樣品中AKAP4的存在和/或表達(dá)水平/量也可以通過(guò)多種方法分析，其中許多是本領(lǐng)域已知的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，包括但不限于免疫組織化學(xué)(“IHC”)，蛋白質(zhì)印跡分析，免疫沉淀，分子結(jié)合測(cè)定，ELISA，ELIFA，熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(“FACS”)，MassARRAY，蛋白質(zhì)組學(xué)，基于定量血液的測(cè)定(例如血清ELISA)，生物化學(xué)酶活性測(cè)定，原位雜交，Southern分析，Northern分析，全基因組測(cè)序，包括定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)(“qRT-PCR”)的PCR和其他擴(kuò)增類型檢測(cè)方法(諸如例如分支DNA，SISBA，TMA等)，Taqman探針，RNA-Seq，F(xiàn)ISH，微陣列分析，基因表達(dá)譜分析和/或基因表達(dá)的連續(xù)分析(“SAGE”)，以及可以通過(guò)蛋白質(zhì)、基因和/或組織陣列分析進(jìn)行的多種測(cè)定中的任一種。用于評(píng)價(jià)基因狀態(tài)和基因產(chǎn)物的典型操作方案見(jiàn)于例如Ausubel等編輯，1995，CurrentProtocolsInMolecularBiology，Units2(NorthernBlotting)，4(SouthernBlotting)，15(Immunoblotting)和18(PCR分析)。也可以使用多重免疫測(cè)定，諸如可從RulesBasedMedicing或MesoScaleDiscovery(“MSD”)獲得的那些。在一些實(shí)施方案中，使用包括以下的方法測(cè)定AKAP4的存在和/或表達(dá)水平/量：(a)對(duì)樣品(諸如受試者癌癥樣品)進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，PCR(諸如rtPCR)，Taqman探針，RNA-seq，微陣列分析，SAGE，MassARRAY技術(shù)或FISH；和(b)測(cè)定樣品中生物標(biāo)志物的存在和/或表達(dá)水平/量。在一些實(shí)施方案中，微陣列方法包括使用具有一種或多種核酸分子的微陣列芯片，所述核酸分子可以在嚴(yán)格條件下與編碼上述基因的核酸分子雜交，或者具有一種或多種多肽(諸如肽或抗體)的微陣列芯片，所述多肽可以結(jié)合由上述基因編碼的一種或多種蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR方法是qRT-PCR。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR方法是多重PCR。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)微陣列測(cè)量基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)qRT-PCR測(cè)量基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)多重PCR測(cè)量表達(dá)。臨床應(yīng)用需要對(duì)該生物標(biāo)志物的RNA分子的拷貝的精確定量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，數(shù)字PCR可用于本發(fā)明以定量該生物標(biāo)志物的RNA拷貝。目前有許多數(shù)字PCR平臺(tái)，包括可從Fluidigm，LifeTechnologies，Bio-Rad和RainDance獲得的那些平臺(tái)。在一個(gè)實(shí)例中，因?yàn)槠涿看芜\(yùn)行的分區(qū)數(shù)、多重能力和成本，可以使用Bio-RadddPCR系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字PCR測(cè)定的開(kāi)發(fā)。該系統(tǒng)每次運(yùn)行有超過(guò)130萬(wàn)個(gè)分區(qū)，分別超過(guò)Fluidigm和LifeTechnologies系統(tǒng)的36,960和3,072個(gè)分區(qū)。雖然它具有的分區(qū)比RainDance系統(tǒng)(其具有高達(dá)8000萬(wàn)個(gè)分區(qū))少，其RNA拷貝的準(zhǔn)確度因?yàn)锳KAP4生物標(biāo)志物的豐度而不會(huì)顯著不同，但每次運(yùn)行成本比RainDance系統(tǒng)低70-90％?？梢允褂帽疚墓_(kāi)的來(lái)自肺癌患者和健康對(duì)照的血液RNA樣品。為此，可以通過(guò)使用例如EvaGreen和基于探針的數(shù)字PCR系統(tǒng)來(lái)優(yōu)化用于數(shù)字PCR的RNA的量?？梢允褂脭?shù)字PCR并分析(1)所有NSCLC相對(duì)于健康對(duì)照；(2)I期NSCLC相對(duì)于健康對(duì)照；和(3)所有NSCLC相對(duì)于良性結(jié)節(jié)的ROC曲線，來(lái)確定AKAP4生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。之后，可以將數(shù)字PCR結(jié)果與定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)行比較，并確定該生物標(biāo)志物的參考截?cái)嘀涤糜跇悠贩治?。相同的策略也可以用于縱向樣本中以準(zhǔn)確地檢測(cè)疾病復(fù)發(fā)。AKAP4生物標(biāo)志物的數(shù)字PCR也可用于其他肺癌患者和健康對(duì)照中。例如，可以從300個(gè)NSCLC肺癌患者和300個(gè)健康對(duì)照中收集血液樣品。在300個(gè)健康對(duì)照中，至少100個(gè)是通過(guò)連續(xù)CT或活檢確認(rèn)的具有良性肺結(jié)節(jié)的個(gè)體。還從經(jīng)歷治療、處于緩解中和定期隨訪的肺癌患者收集縱向血液樣品。分離來(lái)自這些樣品的RNA，然后進(jìn)行數(shù)字PCR以確定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，用于早期檢測(cè)肺癌和復(fù)發(fā)；并區(qū)分惡性和良性結(jié)節(jié)。盡管優(yōu)選基于PCR的方法，但是免疫細(xì)胞化學(xué)方法也適合于檢測(cè)用于本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中的基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。使用對(duì)每種標(biāo)志物特異的抗體或抗血清，優(yōu)選單克隆抗體或其他蛋白質(zhì)結(jié)合配體來(lái)檢測(cè)表達(dá)。可以通過(guò)抗體本身的直接標(biāo)記，例如用放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，半抗原標(biāo)記(諸如生物素)或酶(諸如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)來(lái)檢測(cè)抗體?；蛘?，未標(biāo)記的一抗與標(biāo)記的二抗一起使用，二抗包括對(duì)一抗特異的抗血清、多克隆抗血清或單克隆抗體。用于免疫組織化學(xué)分析的操作方案和試劑盒是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可商購(gòu)獲得?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種方法，包括例如ELISA測(cè)定，在患有肺癌的患者中檢測(cè)抗AKAP4抗體。在一個(gè)實(shí)例中，將包被緩沖液(15mmol/LNa2CO3，35mmol/LNaHCO3，pH9.4)中濃度為4μg/ml的重組AKAP4純化蛋白在96孔板(Nunc，Roskilde,Denmark)中4℃包被過(guò)夜。在室溫下用3％非脫脂乳封閉非特異性位點(diǎn)1小時(shí)，并在室溫下在封閉溶液中與肺癌患者或健康正常血清孵育2小時(shí)。用含有0.5％Tween20的PBS(PBST)洗滌板，并與偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的抗人IgG(JacksonImmunoresearchLaboratories，WestGrove，PA)在室溫下孵育1小時(shí)。通過(guò)使用鄰苯二胺二鹽酸鹽作為底物，在492nm處用比色法觀察吸光度。所有肺癌患者和健康供體樣品一式兩份進(jìn)行測(cè)試，平均值用于分析。從三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算測(cè)定間和測(cè)定內(nèi)的變異系數(shù)。適合于檢測(cè)基因表達(dá)水平的其它方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專利7,081,340。這樣的基因表達(dá)檢測(cè)/基因表達(dá)譜分析的方法包括基于多核苷酸的雜交分析的方法、基于多核苷酸測(cè)序的方法和基于蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。本領(lǐng)域已知的用于定量樣品中mRNA表達(dá)的最常用的方法包括RNA印跡、原位雜交和RNAse保護(hù)測(cè)定?；蛘?，可以使用可以識(shí)別特定雙鏈體的抗體，包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。用于基于測(cè)序的基因表達(dá)分析的代表性方法包括基因表達(dá)的連續(xù)分析(SAGE)，通過(guò)大規(guī)模平行標(biāo)簽測(cè)序(MPSS)的基因表達(dá)分析和下一代測(cè)序。陣列本發(fā)明還提供了生物芯片或陣列。生物芯片/陣列可以包含具有附著的探針或多個(gè)探針的固相或半固相基材，所述探針或多個(gè)探針能夠在嚴(yán)格雜交條件下與上述公開(kāi)的基因的靶序列(例如mRNA或cDNA序列)雜交。探針可以在空間限定的地址處附接在基材上?？梢允褂妹總€(gè)靶序列多于一個(gè)探針，其中重疊探針或針對(duì)特定靶序列的不同區(qū)段的探針。探針可以能夠與本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的與單一病癥相關(guān)的靶序列雜交。探針可以首先合成，隨后連接到生物芯片上，或者可以直接合成在生物芯片上。另外，還包括用于參考對(duì)照/標(biāo)準(zhǔn)化基因的探針。本文所用的用于指核酸(例如探針)和固相支持物時(shí)的附著或固定的可以意指探針和固相支持物之間的結(jié)合足以在結(jié)合、洗滌、分析和去除的條件下是穩(wěn)定的。結(jié)合可以是共價(jià)或非共價(jià)的。共價(jià)鍵可以直接在探針和固相支持物之間形成，或者可以通過(guò)交聯(lián)劑或通過(guò)在固相支持物或探針或兩個(gè)分子上包含特異性反應(yīng)基團(tuán)而形成。非共價(jià)結(jié)合可以是靜電、親水和疏水相互作用中的一種或多種。包括在非共價(jià)結(jié)合中的是分子諸如鏈霉親和素與載體的共價(jià)連接以及生物素化探針與鏈霉親和素的非共價(jià)結(jié)合。固定化還可以涉及共價(jià)和非共價(jià)相互作用的組合。固相基材可以是這樣的材料，其可以經(jīng)修飾以含有適合于探針的附著或締合的離散的單獨(dú)位點(diǎn)，并且適合于至少一種檢測(cè)方法。這種基材的實(shí)例包括玻璃和改性或功能化玻璃，塑料(包括丙烯酸類、聚苯乙烯以及苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯，TeflonJ等)，多糖，尼龍或硝酸纖維素，樹(shù)脂，二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)，碳，金屬，無(wú)機(jī)玻璃和塑料?；目梢栽试S光學(xué)檢測(cè)而沒(méi)有明顯的熒光?；目梢允瞧矫娴模且部梢允褂闷渌鼧?gòu)造的基材。例如探針可以放置在管的內(nèi)表面上，用于流通樣品分析以使樣品體積最小化。類似地，基材可以是柔性的，諸如柔性泡沫，包括由特定塑料制成的閉孔泡沫。陣列/生物芯片和探針可以用化學(xué)官能團(tuán)衍生化，用于隨后的兩者的附著(或結(jié)合)。例如生物芯片可以用以下化學(xué)官能團(tuán)衍生化，包括但不限于氨基、羧基、氧代基團(tuán)或硫醇基團(tuán)。使用這些官能團(tuán)，探針可以使用探針上的官能團(tuán)直接或使用連接體間接附接。探針可以通過(guò)5'末端、3'末端或通過(guò)內(nèi)部核苷酸附接到固相支持物(基材)。探針也可以非共價(jià)地附接到固相支持物(基材)上。例如，可以制備生物素化的寡核苷酸，其可以結(jié)合共價(jià)地包被有鏈霉親和素的表面，從而形成附著。或者，可以使用諸如光聚合和光刻的技術(shù)在表面上合成探針。用于將核酸連接到支持物基材的方法的詳細(xì)討論可以在例如美國(guó)專利號(hào)5837832、6087112、5215882、5707807、5807522、5958342、5994076、6004755、6048695、6060240、6090556和6040138中找到。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物(例如AKAP4基因的轉(zhuǎn)錄物)表示在核酸陣列中。在這樣的實(shí)施方案中，一組結(jié)合位點(diǎn)可以包括具有與表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的不同序列區(qū)段互補(bǔ)的不同核酸的探針。此類核酸的實(shí)例可以具有15至200個(gè)堿基、20至100個(gè)堿基、25至50個(gè)堿基、40至60個(gè)堿基的長(zhǎng)度。除了與其靶序列互補(bǔ)的序列之外，每個(gè)探針序列還可以包括一個(gè)或多個(gè)接頭序列。接頭序列是與其靶序列互補(bǔ)的序列和支持物表面之間的序列。例如本發(fā)明的核酸陣列可以具有特異性針對(duì)每個(gè)靶微RNA基因的一個(gè)探針。然而，如果需要，核酸陣列可以含有特異性針對(duì)某些表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的至少2、5、10、100、200、300、400、500個(gè)或更多個(gè)探針。在一些實(shí)施方案中，可以使用與AKAP4核酸序列互補(bǔ)的標(biāo)記探針來(lái)拉下(pulldown)AKAP4RNA或相應(yīng)的RT-PCR產(chǎn)物，以鑒定AKAP4靶序列。通常，捕獲靶核酸的方法如下：(1)從生物樣品獲得核酸；(2)通過(guò)使核酸與互補(bǔ)DNA和/或RNA探針(即誘餌)雜交來(lái)選擇性捕獲靶向核酸；(3)首先洗掉未與雜交探針結(jié)合的核酸，而在適當(dāng)?shù)臈l件下洗脫與雜交探針結(jié)合的靶向核酸；和(4)捕獲的靶向核酸用于下游應(yīng)用。這種捕獲的AKAP4核酸靶序列可以使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)工具，諸如例如PCR、Taqman測(cè)定、RNA分子的直接測(cè)序或RNA-seq(下一代測(cè)序)來(lái)定量。示例性操作程序可以在例如由AgilentTechnologies，Inc.銷(xiāo)售的SureSelectTargetEnrichmentSystemTM和US20100029498中找到，其內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。試劑盒本發(fā)明還包括試劑盒和診斷系統(tǒng)，其含有用于進(jìn)行上述方法的試劑，包括用于核酸擴(kuò)增、拷貝、引物延伸、檢測(cè)、鑒定和/或定量的方法。為此，本文公開(kāi)的方法的一種或多種反應(yīng)成分可以用于檢測(cè)靶核酸的試劑盒的形式提供。在這樣的試劑盒中，在一個(gè)或多個(gè)容器中或者在基材上(例如通過(guò)靜電相互作用或共價(jià)鍵合)提供適量的一種或多種反應(yīng)成分。本文所述的試劑盒包括一種或多種上述引物。該試劑盒可以包括一個(gè)或多個(gè)含有本發(fā)明的一種或多種引物的容器。試劑盒可以在單個(gè)容器中包含單一引物，含有相同引物的多個(gè)容器，含有兩種或更多種本發(fā)明的不同引物的單個(gè)容器，或含有不同引物或含有兩種或更多種引物的混合物的多個(gè)容器。本發(fā)明的試劑盒包括引物和容器的任何組合和排列。試劑盒還可以含有用于實(shí)施上述方法的另外的材料。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的試劑、材料中的一些或全部。因此，試劑盒可以包含用于使用本發(fā)明的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)的一些或全部試劑。試劑盒的一些或所有成分可以在與含有本發(fā)明的引物的容器分開(kāi)的容器中提供。試劑盒的另外成分的實(shí)例包括但不限于一種或多種不同的聚合酶，特異于對(duì)照核酸或靶核酸的一種或多種引物，特異于對(duì)照核酸或靶核酸的一種或多種探針，用于聚合反應(yīng)的緩沖液(以1X或濃縮形式)，以及用于檢測(cè)聚合產(chǎn)物的一種或多種染料或熒光分子。試劑盒還可以包括以下成分中的一種或多種：支持物，終止、修飾或消化試劑，滲透調(diào)節(jié)劑(osmolyte)，以及用于檢測(cè)探針的設(shè)備。在擴(kuò)增和/或檢測(cè)方法中使用的反應(yīng)成分可以多種形式提供。例如，成分(例如酶、核苷三磷酸、探針和/或引物)可以懸浮在水溶液中或作為冷凍干燥或凍干粉末，丸?；蛑?。在后一種情況下，當(dāng)重構(gòu)時(shí)，成分形成用于測(cè)定的成分的完全混合物。試劑盒或系統(tǒng)可含有足以用于至少一種測(cè)定的量的本文所述成分的任何組合，并且還可包括以有形形式記錄的用于使用成分的說(shuō)明書(shū)。在一些應(yīng)用中，可以在單獨(dú)的、通常一次性的管或等同容器中以預(yù)先測(cè)量的單次使用量提供一種或多種反應(yīng)成分。通過(guò)這樣的安排，可以將待測(cè)試靶核酸存在的樣品加入到各個(gè)管中并直接進(jìn)行擴(kuò)增。試劑盒中提供的成分的量可以是任何適當(dāng)?shù)牧?，并且可以取決于產(chǎn)品所針對(duì)的目標(biāo)市場(chǎng)。確定適當(dāng)?shù)牧康囊话阒笇?dǎo)原則可參見(jiàn)例如JosephSambrookandDavidW.Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001；和FrederickM.Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,2003。本發(fā)明的試劑盒可以包含任何數(shù)量的可用于實(shí)施本發(fā)明方法的另外的試劑或物質(zhì)。這樣的物質(zhì)包括但不限于：用于分離細(xì)胞的試劑(包括緩沖液)，用于裂解細(xì)胞的試劑，抑制不想要的核酸酶的二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑或其它試劑，用于確保引物、聚合酶和其他反應(yīng)成分正常運(yùn)行的對(duì)照DNA/RNA，RNA分離試劑(包括緩沖液)，擴(kuò)增反應(yīng)試劑(包括緩沖液)和洗滌溶液。本發(fā)明的試劑盒可以在任何溫度下提供。例如，為了儲(chǔ)存含有蛋白質(zhì)成分或其復(fù)合物的液體的試劑盒，優(yōu)選將其提供并保持在低于0℃，優(yōu)選-20℃或低于-20℃，或者在冷凍狀態(tài)下。其中供應(yīng)成分的容器可以是能夠保持所供應(yīng)形式的任何常規(guī)容器，例如微量離心管，安瓿，瓶或整體測(cè)試裝置，諸如流體裝置，盒，側(cè)向流(lateralflow)或其它類似裝置。試劑盒可以包括用于擴(kuò)增或檢測(cè)靶核酸的標(biāo)記的或未標(biāo)記的核酸探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以進(jìn)一步包括在本文所述的任何方法中使用所述成分的說(shuō)明書(shū)，例如使用沒(méi)有進(jìn)行核酸提取和/或純化的粗基質(zhì)的方法。試劑盒或系統(tǒng)還可以包括用于保持容器或容器組合的包裝材料。用于這樣的試劑盒和系統(tǒng)的典型包裝材料包括將反應(yīng)成分或檢測(cè)探針保持在各種配置(例如小瓶、微量滴定板孔、微陣列等)中的任一種中的固相基質(zhì)(例如玻璃、塑料、紙、箔、微粒等)。除了含有試劑盒成分之外，系統(tǒng)還可以包括用于進(jìn)行測(cè)定的儀器，例如用于檢測(cè)來(lái)自標(biāo)記的探針的信號(hào)的光度計(jì)和/或用于分離與捕獲探針雜交的核酸的磁性裝置。試劑盒或系統(tǒng)任選提供有用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒或系統(tǒng)的使用的說(shuō)明書(shū)，諸如書(shū)面指導(dǎo)或錄像演示。在另一方面，本發(fā)明提供了本文的任何組合物或試劑盒在實(shí)施本文的任何方法或測(cè)定中的用途，和/或使用任何設(shè)備或試劑盒來(lái)實(shí)施本文的任何測(cè)定或方法的用途。任選地，本發(fā)明的試劑盒或系統(tǒng)還包括加速數(shù)據(jù)的產(chǎn)生、分析和/或儲(chǔ)存以及促進(jìn)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的訪問(wèn)的軟件。所述軟件包括可以在數(shù)據(jù)的收集、存儲(chǔ)和/或分析中使用的邏輯指令、指令集或適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)程序?？梢允褂锰峁┑能浖M(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和關(guān)系分析。所有上述方法、試劑和系統(tǒng)提供了多種診斷工具，其允許對(duì)受試者的疾病狀態(tài)進(jìn)行基于血液的非侵入性評(píng)估。在診斷測(cè)試中使用這些方法、試劑和系統(tǒng)，其可以與其他篩選測(cè)試諸如胸部X射線或CT掃描結(jié)合，提高了診斷準(zhǔn)確度和/或指導(dǎo)額外測(cè)試。在其它方面，本文所述的本發(fā)明允許對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)后、監(jiān)測(cè)對(duì)特定治療的響應(yīng)和對(duì)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的定期評(píng)估。本文所述的發(fā)明還允許評(píng)估存在于手術(shù)前和治療后樣品中的診斷標(biāo)記的變化，并鑒定反映腫瘤存在的基因表達(dá)譜或特征，并且可用于評(píng)估復(fù)發(fā)的概率。在以下實(shí)施例中鑒定的手術(shù)前或手術(shù)后肺癌的結(jié)果支持了腫瘤對(duì)患者PBMC中基因表達(dá)的類似的可檢測(cè)的影響。本發(fā)明的方法相對(duì)于現(xiàn)有方法的顯著優(yōu)點(diǎn)是它們能夠從微創(chuàng)手術(shù)，即通過(guò)取血樣而不分離癌細(xì)胞來(lái)表征疾病狀態(tài)。相比之下，目前從基因表達(dá)譜分類癌癥腫瘤的實(shí)踐取決于組織樣品，通常是來(lái)自腫瘤的樣品。在非常小的腫瘤的情況下，活檢是有問(wèn)題的并且顯然如果已知沒(méi)有腫瘤或沒(méi)有看見(jiàn)腫瘤，則不可能獲得來(lái)自其的樣品。不需要腫瘤的純化或分離，如在分析腫瘤樣品時(shí)即是如此。血液樣品具有另外的優(yōu)點(diǎn)，即，該材料易于制備且經(jīng)穩(wěn)定以用于隨后的分析，這在分析信使RNA時(shí)是重要的。附加定義“核酸”是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA或cRNA)或DNA或RNA類似物。DNA或RNA類似物可以從核苷酸類似物合成。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈DNA。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“靶核酸”或“靶序列”是指含有靶核酸序列的核酸。靶核酸可以是單鏈或雙鏈的，并且通常是DNA、RNA、DNA或RNA的衍生物，或其組合?！鞍泻怂嵝蛄小薄ⅰ鞍行蛄小被颉鞍袇^(qū)域”是指包含單鏈核酸的全部或部分序列的特定序列。靶序列可以在核酸模板內(nèi)，核酸模板可以是任何形式的單鏈或雙鏈核酸。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”及其變體包括用于產(chǎn)生多核苷酸的至少某些部分的多個(gè)拷貝或互補(bǔ)序列的任何方法，所述多核苷酸通常稱為“模板”。模板多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。模板可以是純化或分離的核酸，或可以是非純化或非分離的。給定模板的擴(kuò)增可以導(dǎo)致產(chǎn)生多核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物群，統(tǒng)稱為“擴(kuò)增子”。擴(kuò)增子的多核苷酸可以是單鏈或雙鏈，或兩者的混合物。通常，模板將包括靶序列，并且所得擴(kuò)增子將包括具有與靶序列基本上相同或基本互補(bǔ)的序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，特定擴(kuò)增子的多核苷酸彼此基本上相同或基本互補(bǔ)；或者，在一些實(shí)施方案中，給定擴(kuò)增子內(nèi)的多核苷酸可以具有彼此不同的核苷酸序列。擴(kuò)增可以以線性或指數(shù)方式進(jìn)行，并且可以包括給定模板的重復(fù)和連續(xù)復(fù)制以形成兩種或更多種擴(kuò)增產(chǎn)物。一些典型的擴(kuò)增反應(yīng)包括連續(xù)和重復(fù)循環(huán)的基于模板的核酸合成，導(dǎo)致形成多個(gè)子多核苷酸，其含有模板的核苷酸序列的至少一部分并且與模板具有至少一定程度的核苷酸序列同一性(或互補(bǔ)性)。在一些實(shí)施方案中，可稱為擴(kuò)增“循環(huán)”的核酸合成的每個(gè)實(shí)例包括產(chǎn)生游離3'末端(例如通過(guò)使dsDNA的一條鏈形成切口)，從而產(chǎn)生引物和引物延伸步驟；任選地，還可以包括另外的變性步驟，其中模板部分或完全變性。在一些實(shí)施方案中，一輪擴(kuò)增包括單個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的給定次數(shù)的重復(fù)。例如一輪擴(kuò)增可以包括特定循環(huán)的5、10、15、20、25、30、35、40、50次或更多次重復(fù)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括其中使特定多核苷酸模板經(jīng)受兩個(gè)連續(xù)的核酸合成循環(huán)的任何反應(yīng)。合成可以包括模板依賴性核酸合成。本發(fā)明的擴(kuò)增包括等溫?cái)U(kuò)增。術(shù)語(yǔ)“等溫”是指在基本上恒定的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，即不改變發(fā)生核酸聚合反應(yīng)的反應(yīng)溫度。等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的等溫溫度取決于反應(yīng)中使用的鏈置換核酸聚合酶。通常，等溫溫度低于主要反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈溫度(Tm；混合物中一半潛在雙鏈分子處于單鏈、變性狀態(tài)的溫度)，即通常為90℃或更低，通常在約20℃至75℃之間，優(yōu)選在約30℃至60℃之間，或更優(yōu)選在約37℃。術(shù)語(yǔ)“引物”或“引物寡核苷酸”是指這樣的核酸或寡核苷酸，其能夠與模板核酸雜交并充當(dāng)根據(jù)模板核酸的組成摻入用于核酸合成的延伸核苷酸的起始點(diǎn)?！把由旌塑账帷笔侵改軌蛟跀U(kuò)增期間摻入延伸產(chǎn)物的任何核苷酸(例如dNTP)，即DNA、RNA或如果DNA或RNA可以包括標(biāo)記的衍生物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指短的多核苷酸，通常小于或等于300個(gè)核苷酸長(zhǎng)(例如長(zhǎng)度在5和150個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)，優(yōu)選在10至100個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在15至50個(gè)核苷酸的范圍內(nèi))。然而，如本文所使用的，該術(shù)語(yǔ)也意圖包括更長(zhǎng)或更短的多核苷酸鏈?！肮押塑账帷笨膳c其它多核苷酸雜交，因此用作多核苷酸檢測(cè)的探針或用于多核苷酸鏈延伸的引物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“探針”是指能夠通過(guò)一種或多種類型的化學(xué)鍵(通常通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)，通常通過(guò)氫鍵形成)與互補(bǔ)序列的靶核酸結(jié)合的寡核苷酸。探針可以結(jié)合與探針序列缺乏完全互補(bǔ)性的靶序列，這取決于雜交條件的嚴(yán)格性?？纱嬖谌魏螖?shù)目的堿基對(duì)錯(cuò)配，其將干擾靶序列與本文所述的單鏈核酸之間的雜交。然而，如果突變的數(shù)目如此之大，使得即使在最不嚴(yán)格的雜交條件下也不會(huì)發(fā)生雜交，則該序列不是互補(bǔ)的靶序列。探針可以是單鏈或部分單鏈和部分雙鏈。探針的鏈性由靶序列的結(jié)構(gòu)、組成和性質(zhì)決定。探針可以直接標(biāo)記或用標(biāo)記間接標(biāo)記，例如用生物素標(biāo)記，鏈霉親和素復(fù)合物隨后可以結(jié)合?！皹?biāo)記”或“報(bào)道分子”是用于標(biāo)記核酸(包括單個(gè)核苷酸)、多核苷酸、寡核苷酸或蛋白質(zhì)配體(例如氨基酸或抗體)的化學(xué)或生物化學(xué)部分。實(shí)例包括熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、猝滅劑、放射性核苷酸、酶、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒和本領(lǐng)域已知的其它部分。標(biāo)記或報(bào)道分子能夠產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)并且可以共價(jià)或非共價(jià)連接到寡核苷酸或核苷酸(例如非天然核苷酸)或配體。在指核酸時(shí)，本文使用的“互補(bǔ)”是可以表示核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對(duì)。完全互補(bǔ)可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的100％互補(bǔ)堿基配對(duì)?！半s交”或“退火”是指完全或部分互補(bǔ)的核酸鏈在特定雜交條件(例如嚴(yán)格雜交條件)下以平行或優(yōu)選反向平行取向集合在一起以形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)或區(qū)域(有時(shí)稱為“雜交體”)的能力，其中兩條構(gòu)成鏈通過(guò)氫鍵連接。雖然氫鍵通常在腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤(C和G)之間形成，但是可以形成其他堿基對(duì)(例如Adams等人，TheBiochemistryoftheNucleicAcids,11thed.,1992)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”是指探針或寡聚物與其預(yù)期的靶核酸序列特異性雜交而不與另一序列雜交的條件。嚴(yán)格條件可以根據(jù)熟知的因素例如GC含量和序列長(zhǎng)度而變化，并且可以使用分子生物學(xué)中的普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Sambrook，J.etal.，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2nded.，Ch.11，pp.11.47-11.57，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY))憑借經(jīng)驗(yàn)預(yù)測(cè)或確定?！皣?yán)格條件”或“高嚴(yán)格條件”通常：(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，在50℃；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲酰胺，例如含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH6.5)的50％(v/v)甲酰胺與750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉，在42℃；或(3)在42℃下使用50％甲酰胺，5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5×Denhardt's溶液，超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2xSSC和在55℃下50％甲酰胺中洗滌，隨后是在55℃下由含有EDTA的0.1×SSC組成的高嚴(yán)格性洗滌。“中等嚴(yán)格條件”可以常規(guī)鑒定，包括使用不如上述那么嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的實(shí)例是在37℃下在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA的溶液中孵育過(guò)夜，隨后在約36-50℃下在1×SSC中洗滌濾器。通過(guò)使用制造商的說(shuō)明書(shū)(參見(jiàn)例如Illumina系統(tǒng)說(shuō)明書(shū))，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等，以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指具有基因組的任何生物體，優(yōu)選是活的動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，其已經(jīng)是診斷、治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象。受試者的實(shí)例可以是人、家畜動(dòng)物(肉牛和奶牛、羊、家禽，豬等)或伴侶動(dòng)物(狗、貓、馬等)。本文所使用的“樣品”是指含有從生物體或從生物體(例如患者)的成分(例如血液)獲得的上述低密度或單核細(xì)胞和/或癌細(xì)胞的任何生物流體或組織。樣品可以是任何生物組織、細(xì)胞或流體。樣品可以是“臨床樣品”，其是來(lái)自受試者(諸如人類患者或獸醫(yī)受試者)的樣品。用于本發(fā)明的最合適的樣品包括外周血，更具體地來(lái)自外周血的低密度或單核細(xì)胞。其他有用的生物樣品包括但不限于來(lái)自患有癌癥的患者的全血，唾液，尿液，滑液，骨髓，腦脊液，陰道粘液，宮頸粘液，鼻分泌物，痰液，精液，羊水，支氣管肺泡灌洗液和其他細(xì)胞滲出液。這樣的樣品可以進(jìn)一步用鹽水、緩沖液或生理學(xué)上可接受的稀釋劑稀釋?；蛘撸@些樣品通過(guò)常規(guī)方法濃縮。生物樣品還可包括組織切片，例如用于組織學(xué)目的的冷凍切片。生物樣品也可以稱為“患者樣品”。生物樣品還可以包括基本純化或分離的蛋白質(zhì)、膜制劑或細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指或描述哺乳動(dòng)物中通常特征在于不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長(zhǎng)的生理狀況。更具體地，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指任何肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，肺癌是NSCLC。在更具體的實(shí)施方案中，肺癌是肺腺癌(AC或LAC)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，肺癌是肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC或LSCC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肺癌是I期或II期NSCLC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肺癌是早期和晚期階段和各種類型的NSCLC的混合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”是指所有致瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，無(wú)論是惡性的還是良性的，以及所有癌前和癌性細(xì)胞和組織。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“接觸”及其變體當(dāng)用于指任何成分組時(shí)，包括任何將待接觸的成分混合到相同混合物中(例如加入到相同的隔室或溶液中)的方法，并且不一定需要所述成分之間的實(shí)際物理接觸。所述成分可以以任何順序或任何組合(或亞組合)接觸，并且可包括隨后從混合物中除去所述成分中的一個(gè)或一些，任選地在加入其它所述成分之前的情況。例如“使A與B和C接觸”包括任何和所有以下情況：(i)A與C混合，然后將B加入到混合物中；(ii)A和B混合成混合物；從混合物中除去B，然后將C加入到混合物中；以及(iii)將A加入B和C的混合物。例如“使模板與反應(yīng)混合物接觸”包括以下情況的任意一種或所有：(i)使模板與反應(yīng)混合物的第一成分接觸以產(chǎn)生混合物；然后將反應(yīng)混合物的其它成分以任何順序或組合加入到混合物中；和(ii)在與模板混合之前反應(yīng)混合物完全形成。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“混合物”是指散布且不以任何特定順序散布的元素的組合?；旌衔锸钱愘|(zhì)的并且在空間上不可分離成其不同的成分。元素混合物的實(shí)例包括溶解在相同水溶液中的許多不同元素，或隨機(jī)地或以不特定順序附接于固相載體的多種不同元素，其中不同元素在空間上沒(méi)有不同。換句話說(shuō)，混合物是不可尋址的。具體而言，如本領(lǐng)域通常已知的和下文所述的表面結(jié)合寡核苷酸陣列不是表面結(jié)合寡核苷酸的混合物，因?yàn)楸砻娼Y(jié)合寡核苷酸的種類在空間上獨(dú)特的并且陣列是可尋址的。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“參考值”是指當(dāng)與測(cè)定結(jié)果比較時(shí)與特定結(jié)果統(tǒng)計(jì)上相關(guān)的值。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，參考值從將RNA表達(dá)與已知臨床結(jié)果進(jìn)行比較的研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)確定。參考值可以是閾值分?jǐn)?shù)值或截?cái)喾謹(jǐn)?shù)值。通常，參考值將是這樣的閾值，高于(或低于)該閾值則一種結(jié)果是更可能的，而低于該閾值，則替代結(jié)果是更可能的。在一個(gè)實(shí)施方案中，參考水平可以是以來(lái)自從健康(無(wú)疾病)受試者的對(duì)照群體所采樣品的表達(dá)水平的平均值表示的一種或多種基因表達(dá)(例如以mRNA的形式)水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，參考水平可以是在不同時(shí)間(例如在本發(fā)明的測(cè)定之前)的同一受試者中的水平，諸如在受試者形成疾病之前或在開(kāi)始治療之前測(cè)定的水平。通常，樣品通過(guò)共同因子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如含細(xì)胞的樣品通過(guò)蛋白質(zhì)含量或細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。核酸樣品也可以相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照核酸進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如本文所使用的“對(duì)照”或“對(duì)照受試者”是指參考水平的來(lái)源(例如參考基因表達(dá)譜)以及在下文實(shí)施例中鑒定的對(duì)照受試者的特定組。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照受試者可以是患有肺癌的對(duì)照，諸如作為患有惡性疾病的正在吸煙的人或前吸煙者的受試者，在用于去除實(shí)體肺腫瘤手術(shù)之前患有實(shí)體肺腫瘤的受試者；在手術(shù)切除所述腫瘤后患有實(shí)體肺腫瘤的受試者；在治療之前患有實(shí)體肺腫瘤的受試者；和在治療期間或之后患有實(shí)體肺腫瘤的受試者。在其他實(shí)施方案中，用于本文所述的組合物和方法的目的的對(duì)照包括任何下述類別的沒(méi)有肺癌的參考人類受試者。這樣的非健康對(duì)照(NHC)包括患有非惡性疾病的吸煙者，患有非惡性疾病的前吸煙者(包括患有肺結(jié)節(jié)的患者)，患有慢性阻塞性肺病(COPD)的非吸煙者，患有COPD的前吸煙者。在其它實(shí)施方案中，對(duì)照受試者是沒(méi)有疾病的健康非吸煙者或沒(méi)有疾病的健康吸煙者。在其他實(shí)施方案中，對(duì)照或參考是相同的受試者，其中在手術(shù)之前或在另一較早的時(shí)間點(diǎn)評(píng)估基因或基因譜，以能夠評(píng)估手術(shù)或治療功效或疾病的預(yù)后或進(jìn)展。特定分類的對(duì)照的選擇取決于醫(yī)師將診斷/監(jiān)測(cè)方法和組合物所用于的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性選擇所選的對(duì)照組(非健康對(duì)照)，以盡可能接近地與惡性疾病患者匹配。匹配包括吸煙狀況和吸煙相關(guān)疾病諸如COPD。兩種分類的所有受試者在呈現(xiàn)疾病癥狀時(shí)可以是現(xiàn)有或前吸煙者。本文公開(kāi)的最有信息性的基因可以將患有惡性疾病的吸煙者與患有非惡性疾病的吸煙者區(qū)分開(kāi)。術(shù)語(yǔ)“確定”、“測(cè)量”、“評(píng)估”和“測(cè)定”可互換使用，包括定量和定性測(cè)量，并且包括確定特征、性狀或性質(zhì)是否存在。評(píng)估可以是相對(duì)的或絕對(duì)的。評(píng)估靶的存在包括確定存在的靶的量，以及確定其是否存在。如本文所公開(kāi)的，一種或多種基因的表達(dá)水平的差異指示疾病或其階段。短語(yǔ)“水平的差異”是指與對(duì)照或參考水平相比，樣品中特定標(biāo)志物(諸如核酸)的量的差異。例如，與參考水平相比，特定生物標(biāo)志物(例如AKAP4)的量可以以升高的量或以降低的量存在于患有致瘤性疾病的患者的樣品中。在一個(gè)實(shí)施方案中，“水平的差異”可以是樣品中存在的特定生物標(biāo)志物的量與對(duì)照物(例如參考值)之間的差異為至少約1％，2％，3％5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，75％，80％，100％，150％，200％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，“水平的差異”可以是樣品中存在的生物標(biāo)志物的量與對(duì)照相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。例如，如果生物標(biāo)志物的測(cè)量水平落在任何對(duì)照或參考組的平均值的約1.0標(biāo)準(zhǔn)偏差，約1.5標(biāo)準(zhǔn)偏差，約2.0標(biāo)準(zhǔn)偏差或約2.5標(biāo)準(zhǔn)偏差之外，則差異可以是統(tǒng)計(jì)上顯著的。關(guān)于mRNA測(cè)量，可以從實(shí)時(shí)PCR測(cè)量水平作為Ct值，其可以標(biāo)準(zhǔn)化為ACt值，如下文實(shí)施例中所述。如本文所公開(kāi)的，提供了多個(gè)數(shù)值范圍。應(yīng)當(dāng)理解，還具體公開(kāi)了在該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值，至下限單位的十分之一，除非上下文另有明確說(shuō)明。本發(fā)明包括在所述范圍內(nèi)的任何所述值或中間值與在該所述范圍內(nèi)的任何其它所述值或中間值之間的每個(gè)較小范圍。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括或排除在該范圍內(nèi)，并且其中任一、沒(méi)有一個(gè)或兩個(gè)端值都包括在較小范圍內(nèi)的每個(gè)范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)，并且在所描述的范圍內(nèi)任意特別排除端值。當(dāng)所描述的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)端值時(shí)，排除這些所包括的端值中的一個(gè)或兩個(gè)的范圍也包括在本發(fā)明中。術(shù)語(yǔ)“約”通常是指所指示數(shù)目的正或負(fù)10％。例如“約10％”可以指示9％至11％的范圍，“約1”可以指0.9-1.1?！凹s”的其它含義可從上下文顯而易見(jiàn)，例如四舍五入，因此，例如“約1”也可意指0.5至1.4。實(shí)施例實(shí)施例1在該實(shí)施例中，描述了用于進(jìn)行實(shí)施例2和3中的測(cè)定的材料和方法。PBMC收集使用BDVacutainerCPT管根據(jù)制造商的說(shuō)明以上述方式用于PBMC級(jí)分(PBMC和相關(guān)細(xì)胞)收集?？俁NA分離使用TRI試劑(T9424Sigma-Aldrich)根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)從正常和肺癌PBMC沉淀中提取RNA。簡(jiǎn)言之，將1mlTRI試劑加入到沉淀中并在室溫下孵育15分鐘。加入1μl線性丙烯酰胺并在室溫下進(jìn)一步孵育5分鐘。然后加入100μl的1-溴-3-氯丙烷，渦旋30秒，在室溫下孵育10分鐘，然后在4℃下以12000g離心15分鐘。收集水相并加入1μl的RNasin(N2115Promega)和500μl異丙醇。在室溫下孵育10分鐘后，將樣品在4℃下以12000g離心10分鐘。RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗滌兩次。將沉淀空氣干燥，并懸浮在50μl無(wú)RNAse的水中，并儲(chǔ)存在-80℃。使用NanoDrop評(píng)估RNA濃度和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用HighCapacitycDNAReverseTranscription試劑盒(AppliedBiosystems，P/N4374966)從總RNA合成cDNA。簡(jiǎn)言之，將250ng總RNA用作總體積為20μl中的模板，20μl包含2μl10XRT緩沖液、0.8μl100mMdNTP混合物、2μl10XRT隨機(jī)引物、1μlMultiscribeReverseTranscriptase和1μlRNAse抑制劑。將反應(yīng)在25℃下孵育10分鐘，在37℃下孵育2小時(shí)，在85℃下孵育5分鐘。將cDNA樣品儲(chǔ)存在-20℃。定量實(shí)時(shí)PCR包括在研究中的每個(gè)基因的參考序列和基因組序列獲自UCSCGenomeBioinformatics網(wǎng)站。使用PrimerExpress(AppliedBiosystems)設(shè)計(jì)RT-PCR引物。手動(dòng)設(shè)計(jì)基因特異性引物。巢式PCR用于確定基因表達(dá)。PCR用于第一輪擴(kuò)增以選擇性擴(kuò)增基因。在含有5μl的cDNA、10μl10X緩沖液、1μl10mMdNTP、3μl基因特異性引物混合物(20μM)、5單位Taq聚合酶的50μl反應(yīng)物中進(jìn)行PCR，并在熱循環(huán)儀上擴(kuò)增：94℃持續(xù)2分鐘，隨后是94℃持續(xù)30秒、60℃持續(xù)1分鐘和72℃持續(xù)15秒的40個(gè)循環(huán)，然后1個(gè)循環(huán)的72℃持續(xù)10分鐘，結(jié)束于4℃。用于AKAP4的第一輪擴(kuò)增的PCR引物是：5'TCCTACATGATGGCGTACTCTG和5'AAGTTGCCTTCTGAGCTGGAAC(分別為SEQIDNO：5和6)。使用5μl第一輪PCR產(chǎn)物、12.5μlSYBRSelectMasterMix(AppliedBiosystems)、0.25μl引物混合物(2μM終濃度)和7.25μl水的25μl反應(yīng)體積中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)以檢測(cè)基因的表達(dá)，一式兩份。核糖體5S基因是管家基因并用于標(biāo)準(zhǔn)化。用于AKAP4的實(shí)時(shí)PCR引物是：5'GGGTGTGTGCAAGGTAGATCTCT(SEQIDNO：7)和5'CACATCGACAAAGCATATCACTTTC(SEQIDNO：8)。5S的實(shí)時(shí)PCR引物是：5'GCCATACCACCCTGAACG(SEQIDNO：9)和5'AGCCTACAGCACCCGGTATT(SEQIDNO：10)。作為污染的陰性對(duì)照，還測(cè)定沒(méi)有任何模板的孔。所有反應(yīng)在7500FastRealTimePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystem)上進(jìn)行。使用ΔΔ閾值循環(huán)(Ct)方法計(jì)算每個(gè)基因和樣品兩次重復(fù)的平均值，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)相對(duì)于內(nèi)源參考對(duì)照基因5S標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)施例2在該實(shí)施例中，進(jìn)行測(cè)定以鑒定和驗(yàn)證用于肺癌診斷的生物標(biāo)志物。簡(jiǎn)言之，含有PBMC和相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞群以上述方式從患有NSCLC(晚期或早期)的患者和各種對(duì)照受試者獲得。然后，進(jìn)行測(cè)定以篩選在肺癌患者的細(xì)胞群中表達(dá)但在正常吸煙對(duì)照的細(xì)胞群中不表達(dá)或低水平表達(dá)的120個(gè)基因。發(fā)現(xiàn)AKAP4基因能夠區(qū)分患有肺癌的患者和健康對(duì)照。然后，使用定量RT-PCR來(lái)確定264個(gè)NSCLC肺癌患者和135個(gè)年齡、性別和吸煙史匹配的健康對(duì)照中的AKAP4基因表達(dá)。為此，使用接受者工作特征(ROC)曲線，并計(jì)算接受者工作特征曲線下面積(AUC)和其95％置信區(qū)間。在本領(lǐng)域中已知，AUC可以解釋為隨機(jī)選擇的異常受試者的診斷測(cè)試的結(jié)果會(huì)大于來(lái)自隨機(jī)選擇的正常受試者的相同診斷測(cè)試的結(jié)果的概率。AUC越大，診斷測(cè)試的總體性能越好。發(fā)現(xiàn)當(dāng)所有肺癌與健康對(duì)照比較時(shí)，ROC曲線的AUC為97.14％。在這些肺癌病例中，133例是I期NSCLC肺癌。結(jié)果表明，在所檢查的細(xì)胞群體中該AKAP4生物標(biāo)志物可以區(qū)分肺癌和吸煙對(duì)照。此外，當(dāng)將這些I期NSCLC與健康對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)，ROC曲線的AUC為97.9％。在健康對(duì)照中，有24個(gè)患有良性肺結(jié)節(jié)的患者，這已經(jīng)通過(guò)活檢確認(rèn)。結(jié)果表明，AKAP4可以允許檢測(cè)早期NSCLC。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)所有NSCLC肺癌與良性結(jié)節(jié)比較時(shí)，ROC曲線的AUC為98.45％。這些結(jié)果表明，該生物標(biāo)志物可用于區(qū)分肺癌和良性結(jié)節(jié)。使用上述RT-PCR進(jìn)行另外的測(cè)定以檢查AKAP4表達(dá)的組織分布。AKAP4在肺癌細(xì)胞中表達(dá)，諸如例如A549、HCC827、H1975、H23和H520，但不在正常肺組織表達(dá)。AKAP4在正常腎上腺和胎盤(pán)中表達(dá)。這些結(jié)果表明，從含NSCLCPBMC的細(xì)胞級(jí)分中檢測(cè)到的AKAP4可能來(lái)自循環(huán)的NSCLC癌細(xì)胞。還檢查了來(lái)自NSCLC患者和對(duì)照的全血細(xì)胞樣品中的AKAP4表達(dá)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用全血樣品時(shí)，NSCLC患者和對(duì)照之間沒(méi)有顯著差異。參見(jiàn)圖1。這些結(jié)果表明，全血樣品不允許使用常規(guī)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)AKAP4表達(dá)以將NSCLC與對(duì)照區(qū)分開(kāi)，這可能是由于循環(huán)癌細(xì)胞在全血中極低的相對(duì)數(shù)量，這些循環(huán)癌細(xì)胞包括豐度高的細(xì)胞類型，嗜中性粒細(xì)胞沒(méi)有包括在其中。也就是說(shuō)，非常少量的肺癌細(xì)胞可能在非常早期的階段在外周血中循環(huán)。這些細(xì)胞被與PBMC共純化并富集，并且因此可以通過(guò)經(jīng)由高度靈敏的巢式PCR檢查AKAP4表達(dá)來(lái)檢測(cè)。實(shí)施例3在該實(shí)施例中，在四個(gè)肺癌患者的縱向研究中，在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)含有PBMC的細(xì)胞級(jí)分中的AKAP4表達(dá)，如下表所示，目的是測(cè)定該循環(huán)生物標(biāo)志物是否可用于檢測(cè)肺癌復(fù)發(fā)。時(shí)間點(diǎn)1時(shí)間點(diǎn)3時(shí)間點(diǎn)3患者#1手術(shù)前手術(shù)后6個(gè)月手術(shù)后12個(gè)月患者#2手術(shù)前手術(shù)后9個(gè)月手術(shù)后24個(gè)月患者#3手術(shù)前手術(shù)后9個(gè)月手術(shù)后36個(gè)月患者#4手術(shù)后6個(gè)月手術(shù)后32個(gè)月手術(shù)后37個(gè)月更具體地，在患者#1中，AKAP4在手術(shù)前高表達(dá)，并且該患者基于AKAP4表達(dá)被正確地分類為肺癌。手術(shù)后6個(gè)月AKAP4表達(dá)降低至截?cái)嘀狄韵?，但隨后在手術(shù)后12個(gè)月增加至截?cái)嘀狄陨稀KAP4表達(dá)的這種反彈表明該患者在手術(shù)后12個(gè)月有肺癌復(fù)發(fā)。事實(shí)上，4個(gè)月20天后，發(fā)現(xiàn)該患者表現(xiàn)出肺癌的臨床復(fù)發(fā)。這些結(jié)果表明，含有PBMC的級(jí)分樣品中的AKAP4表達(dá)可用于早期檢測(cè)復(fù)發(fā)和疾病監(jiān)測(cè)。在患者#2中，發(fā)現(xiàn)AKAP4在手術(shù)前也高表達(dá)，并且該患者基于AKAP4表達(dá)被正確地分類為肺癌。與在患者#1中一樣，在患者#2中的AKAP4表達(dá)手術(shù)后9個(gè)月也降至截?cái)嘀狄韵?。然而，患?2的AKAP4表達(dá)在手術(shù)后24個(gè)月保持在截?cái)嘀狄韵隆⒁?jiàn)圖4。而且，該患者的肺癌沒(méi)有復(fù)發(fā)。這些結(jié)果表明，PBMC級(jí)分樣品中的AKAP4表達(dá)可用于疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后。在患者#3中也發(fā)現(xiàn)了相似的AKAP4表達(dá)模式和肺癌結(jié)果。該患者的含有PBMC的級(jí)分中的AKAP4在手術(shù)前高表達(dá)，并且該患者基于AKAP4表達(dá)被正確地分類為肺癌。手術(shù)后9個(gè)月AKAP4表達(dá)降至截?cái)嘀狄韵?，并且在手術(shù)后24個(gè)月保持低于截?cái)嘀?。像患?2一樣，患者#3也沒(méi)有復(fù)發(fā)。這些結(jié)果再次表明，在含有PBMC的級(jí)分樣品中的AKAP4表達(dá)可以用于疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：在手術(shù)后6個(gè)月、手術(shù)后32個(gè)月和手術(shù)后37個(gè)月，從肺癌患者#4收集含有PBMC的級(jí)分樣品。發(fā)現(xiàn)手術(shù)后6個(gè)月AKAP4表達(dá)低于截?cái)嘀怠Ｈ缓?，在手術(shù)后32個(gè)月AKAP4表達(dá)增加到截?cái)嘀狄陨?，表明該患者有肺癌。事?shí)上，2個(gè)月后，這個(gè)病人表現(xiàn)出肺癌的臨床復(fù)發(fā)。該患者然后接受放射治療，放射治療后CT掃描顯示肺癌結(jié)節(jié)消失。放療后3個(gè)月AKAP4表達(dá)下降，但保持高于截?cái)嘀?，表明放射治療部分有效，但放射治療后仍有癌癥。事實(shí)上，該患者在放療后10個(gè)月表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性肺癌。這些結(jié)果表明，含有PBMC的級(jí)分樣品中的AKAP4表達(dá)可用于早期檢測(cè)復(fù)發(fā)、疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后。實(shí)施例4分析作為基于血液的生物標(biāo)志物的癌癥睪丸抗原(“CTA”)基因，用于檢測(cè)NSCLC。針對(duì)X染色體上130個(gè)CT基因中116個(gè)，設(shè)計(jì)了獨(dú)特PCR引物(序列相似性阻止了對(duì)14個(gè)CT-X基因選擇特異性引物)(AlmeidaLG,etal.NucleicAcidsRes2009；37(Databaseissue):D816-9)。巢式PCR用作檢測(cè)方法，因?yàn)榭赡躮RNA在所測(cè)試的PBMC級(jí)分中以低水平存在。進(jìn)行測(cè)試以確定116個(gè)CT-X基因中的任一個(gè)是否在來(lái)自12個(gè)NSCLC肺癌患者和7個(gè)具有吸煙相關(guān)良性肺病(包括COPD和/或良性肉芽腫性炎癥)的對(duì)照患者的PBMC衍生的RNA中差異表達(dá)。四個(gè)對(duì)照具有組織學(xué)證實(shí)的良性肺結(jié)節(jié)。這些高度表征的樣品是先前描述的以開(kāi)發(fā)NSCLC的基于血液的生物標(biāo)志物的微陣列研究的一部分(ShoweMK,etal.CancerRes2009；69(24):9202-10)；KossenkovAV,etal.ClinCancerRes2011；17(18):5867-77)?；诎l(fā)現(xiàn)組的結(jié)果，選擇在該數(shù)據(jù)集中以最佳準(zhǔn)確度將NSCLC與良性肺病區(qū)分開(kāi)的兩個(gè)候選CTX基因：AKAP4和GAGE4，用于在更大的獨(dú)立樣品集上進(jìn)一步分析。AKAP4的表達(dá)完美地分離癌癥和對(duì)照組(圖2A)，而GAGE4(圖2B)在所測(cè)試的所有116個(gè)候選物中僅錯(cuò)誤分類了一個(gè)NSCLC樣品。因此，在兩種生物標(biāo)志物中，AKAP4是最準(zhǔn)確的，并且由于隨后在應(yīng)用于較大數(shù)據(jù)集時(shí)表現(xiàn)差而消除了GAGE4。實(shí)施例5為了確定AKAP4和GAGE4作為NSCLC生物標(biāo)志物的潛在效用，分析了具有141個(gè)NSCLC患者和35個(gè)患有良性肺病的對(duì)照患者，不包括任何發(fā)現(xiàn)組樣品的的另外的隊(duì)列。35例對(duì)照中有24例患有通過(guò)活檢證實(shí)的良性肺結(jié)節(jié)(Showeetal，2009)。雖然AKAP4和GAGE4二者的準(zhǔn)確度在小數(shù)據(jù)集上基本相同，但是AKAP4表達(dá)在較大數(shù)據(jù)集上的性能顯著高于GAGE4，在該比較中AKAP4的AUC為0.9735(圖3A)和GAGE4的AUC為0.7149。在測(cè)試并發(fā)現(xiàn)AKAP4和GAGE4表達(dá)的組合沒(méi)有改善總體預(yù)測(cè)并且由于其在該較大樣品組中的低AUC之后，GAGE4未包括在進(jìn)一步的分析中。然后在第二獨(dú)立隊(duì)列的患者中測(cè)定AKAP4表達(dá)。該數(shù)據(jù)集包括123個(gè)NSCLC患者和100個(gè)對(duì)照。VH數(shù)據(jù)集上的ROC曲線的AUC為0.9805(圖3B)。分析包括來(lái)自兩個(gè)隊(duì)列而不是發(fā)現(xiàn)組(discoveryset)的樣品的合并數(shù)據(jù)集。合并數(shù)據(jù)包括264個(gè)NSCLC患者和135個(gè)對(duì)照。分析了作為NSCLC分類器的AKAP4在合并數(shù)據(jù)集中的表達(dá)，圖3D中顯示的NSCLC和對(duì)照組之間的表達(dá)值的分布的ROC曲線的AUC為0.9714(圖3C)。AKAP4表達(dá)水平-4.3顯示對(duì)于92.7％的總準(zhǔn)確度的最平衡的靈敏度/特異性值(分別為92.8％和92.6％)。除了AKAP4表達(dá)、年齡、性別和吸煙狀況外，還包括交叉驗(yàn)證的線性判別分析作為潛在預(yù)測(cè)因子沒(méi)有顯示改善的AUC或準(zhǔn)確度。用于分類的AKAP4表達(dá)的最終觀察的性能總結(jié)在表1中。此外，進(jìn)行交叉驗(yàn)證研究以估計(jì)報(bào)告的AUC和準(zhǔn)確度值的變化(表2)。合并數(shù)據(jù)集的變異系數(shù)對(duì)于AUC為0.10％和對(duì)于準(zhǔn)確度為0.16％，這表明在研究中呈現(xiàn)非常高的置信結(jié)果。表1AKAP4表達(dá)在不同的NSCLC和對(duì)照子集中的分類表1說(shuō)明了在不同NSCLC和對(duì)照子集的分類中AKAP4表達(dá)的性能。對(duì)于每個(gè)分類，該表列出了在-4.3的閾值下AKAP4表達(dá)所觀察的AUC和95％置信區(qū)間(CI)和靈敏度(sens)，特異性(spec)和總體準(zhǔn)確度(acc)有兩個(gè)特別感興趣的樣品亞組：I期NSCLC(當(dāng)肺切除術(shù)是最有利的時(shí)候從早期檢測(cè)獲益最多的組)以及高風(fēng)險(xiǎn)肺結(jié)節(jié)(需要手術(shù)確認(rèn)以確定惡性/非惡性狀態(tài))。在264個(gè)NSCLC患者中，136個(gè)被診斷為I期NSCLC。用作僅I期NSCLC和所有對(duì)照的分類器的AKAP4表達(dá)水平證明了ROC曲線的AUC是0.9795(圖4A)。雖然該分析中包括的結(jié)節(jié)數(shù)相對(duì)較少，但是用于將所有264個(gè)NSCLC和來(lái)自良性結(jié)節(jié)患者的27個(gè)樣品分類的ROC曲線的AUC給出0.9825的值(圖4B)(所有測(cè)試分類的最佳性能)，這表明與PBMC相關(guān)的AKAP4表達(dá)區(qū)分開(kāi)了良性和惡性肺結(jié)節(jié)。AKAP4提供了一個(gè)靈敏的標(biāo)志物來(lái)跟蹤緩解，并作為復(fù)發(fā)的早期標(biāo)志物。實(shí)施例6因?yàn)樵谙惹暗腜BMC基因表達(dá)研究(Showe2009和Kossenkov2011)中，確定肺鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)的患者比具有肺腺癌(AC)的患者更準(zhǔn)確地分類，并且分類準(zhǔn)確度也隨著晚期癌癥分期而增加，重要的是確定AKAP4PCR信號(hào)的強(qiáng)度是否也與包括癌癥分期和亞型在內(nèi)的多種臨床參數(shù)相關(guān)。使用組織學(xué)、分期、吸煙史、性別和年齡作為自變量進(jìn)行AKAP4表達(dá)的線性回歸分析。所述分析鑒定得到：AKAP4表達(dá)僅與癌癥分期顯著相關(guān)(表2)。圖5顯示，AKAP4表達(dá)的量級(jí)經(jīng)過(guò)所有4個(gè)期持續(xù)增加，II、III和IV期的AKAP4水平分別平均為I期中表達(dá)水平的4.7、9.8和>3000倍。AKAP4表達(dá)不與煙草使用顯著相關(guān)的事實(shí)也表明，AKAP4分類可以以相同的效率成功地用于較高風(fēng)險(xiǎn)的目前吸煙者以及較低風(fēng)險(xiǎn)的非吸煙者。表2變量顯著性(p<0.05)β值95％CIAC診斷ns-0.045[-0.581,0.491]LSCC診斷ns-0.01[-0.635,0.614]分期(階段)顯著0.214[0.049,0.379]從不吸煙者ns-0.182[-0.822,0.458]目前吸煙ns-0.008[-0.446,0.431]吸煙年齡ns-0.009[-0.020,0.001]每年包數(shù)ns-0.051[-0.284,0.182]性別ns-0.028[-0.355,0.298]年齡ns-0.012[-0.029,0.005]表2說(shuō)明了AKAP4表達(dá)和不同臨床參數(shù)的線性回歸分析的結(jié)果。結(jié)果表明，只有腫瘤分期與AKAP4表達(dá)顯著相關(guān)。如圖5所示，檢測(cè)到的AKAP4信號(hào)的來(lái)源是肺癌這進(jìn)一步得到信號(hào)強(qiáng)度與腫瘤分期的強(qiáng)相關(guān)性的支持。沒(méi)有其他患者特征(包括年齡、性別、煙草使用或癌癥亞型)顯示任何顯著相關(guān)。此信號(hào)的腫瘤衍生(derivation)進(jìn)一步由證明以下內(nèi)容的數(shù)據(jù)的支持：在成功的肺切除術(shù)后PBMC的RNA存在的AKAP4顯著降低，并且該表達(dá)隨著肺腫瘤復(fù)發(fā)而再次增加。肺切除后分析了PBMC相關(guān)的AKAP4表達(dá)。對(duì)來(lái)自4個(gè)NSCLC患者的樣品中的表達(dá)進(jìn)行了分析，其中在肺切除術(shù)后多次收集隨訪樣品。將術(shù)前樣品中的AKAP4表達(dá)與手術(shù)切除后不同時(shí)間的表達(dá)進(jìn)行比較。圖6顯示了具有不同結(jié)局的四個(gè)病例。病例1-復(fù)發(fā)：患者vh.603是85歲的女性前吸煙者，其進(jìn)行了肺切除術(shù)，被診斷為I期NSCLC。在隨訪中評(píng)估CT掃描，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該患者收集PBMC樣品：手術(shù)前、手術(shù)后6個(gè)月和手術(shù)后12個(gè)月。手術(shù)后約16個(gè)月，通過(guò)CT掃描發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)，隨后證實(shí)為NSCLC。對(duì)所有可用樣品進(jìn)行巢式PCR，并在大數(shù)據(jù)集上使用截?cái)帱c(diǎn)以評(píng)估AKAP4表達(dá)。手術(shù)前樣品中的AKAP4表達(dá)高于截?cái)帱c(diǎn)，這證實(shí)了NSCLC的存在，這與臨床診斷一致(圖6)?；谖覀兊牟±龑?duì)照研究，手術(shù)后6個(gè)月樣品中的AKAP4表達(dá)降至截?cái)帱c(diǎn)以下，表明患者在6個(gè)月時(shí)緩解(圖6)。隨后在手術(shù)后12個(gè)月的樣品中表達(dá)增加到截?cái)帱c(diǎn)以上，表明癌癥已復(fù)發(fā)(圖6)，雖然在這時(shí)沒(méi)有通過(guò)CT掃描檢測(cè)到復(fù)發(fā)的證據(jù)。大約4個(gè)月后(手術(shù)后16個(gè)月)，通過(guò)CT掃描檢測(cè)到肺結(jié)節(jié)，隨后證實(shí)為NSCLC。病例2-緩解：患者vh.621是85歲的女性前吸煙者，診斷為I期NSCLC。通過(guò)手術(shù)除去患者的腫瘤，并診斷為處于緩解。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集PBMC樣品：手術(shù)前、手術(shù)后9個(gè)月和手術(shù)后24個(gè)月。在手術(shù)前樣品中的AKAP4表達(dá)高于截?cái)帱c(diǎn)，這與NSCLC的存在一致(圖6)。在手術(shù)后9個(gè)月AKAP4表達(dá)下降至截?cái)帱c(diǎn)以下，并且在手術(shù)后24個(gè)月保持在截?cái)帱c(diǎn)以下(圖5)。通過(guò)臨床評(píng)估，該患者處于緩解。病例3-緩解：患者vh.495是也被診斷為I期NSCLC的67歲女性前吸煙者。在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)從該患者收集PBMC：手術(shù)前、手術(shù)后9個(gè)月和手術(shù)后36個(gè)月。AKAP4表達(dá)從手術(shù)前的截?cái)帱c(diǎn)以上下降到手術(shù)后9個(gè)月的截?cái)帱c(diǎn)以下，并且在手術(shù)后36個(gè)月保持在截?cái)帱c(diǎn)以下(圖6)。重復(fù)CT掃描證實(shí)該患者處于緩解。病例4-復(fù)發(fā)+治療：測(cè)定來(lái)自復(fù)發(fā)并隨后經(jīng)歷額外治療的患者的PBMC樣品中的AKAP4表達(dá)?；颊遶h.554是一名79歲的女性目前吸煙者，其診斷為I期NSCLC。進(jìn)行手術(shù)以去除她的腫瘤，并且在32個(gè)月后，在隨訪期間通過(guò)CT掃描檢測(cè)到肺結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)通過(guò)活檢證實(shí)為NSCLC。該患者接受立體定向體放射治療。放射治療后CT掃描未檢測(cè)到任何肺結(jié)節(jié)的存在。然而，在發(fā)現(xiàn)第二個(gè)腫瘤后12個(gè)月檢測(cè)到轉(zhuǎn)移性疾病。在該患者的血液中的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析AKAP4表達(dá)：手術(shù)后6個(gè)月、手術(shù)后32個(gè)月(其在復(fù)發(fā)檢測(cè)時(shí)但是放射治療前)以及手術(shù)后37個(gè)月(放射后3月)。沒(méi)有手術(shù)前血液樣品。雖然手術(shù)后6個(gè)月的AKAP4表達(dá)低于截?cái)帱c(diǎn)(圖6)，但手術(shù)后32個(gè)月的表達(dá)顯著增加到截?cái)帱c(diǎn)以上，這支持了CT和活檢診斷的NSCLC復(fù)發(fā)。在手術(shù)后37個(gè)月(放射治療后3個(gè)月)，AKAP4水平從放射前治療值下降，但仍保持在截?cái)帱c(diǎn)以上，表明存在殘留癌癥，即便CT掃描在那時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到任何肺結(jié)節(jié)并且沒(méi)有殘留疾病的臨床指征。該患者在放射治療后10個(gè)月被臨床診斷為轉(zhuǎn)移性NSCLC。這些臨床研究支持了即便在沒(méi)有陽(yáng)性CT掃描的情況下監(jiān)測(cè)AKAP4表達(dá)也作為緩解/復(fù)發(fā)的標(biāo)志物的效用?；颊遶h.603、vh.621和vh.495顯示在手術(shù)前和手術(shù)后樣品之間AKAP4表達(dá)的顯著下降?；颊遶h.623和vh.495(其分別在手術(shù)后24和36個(gè)月保持緩解)的AKAP4表達(dá)保持在截?cái)嘀狄韵??；颊遶h.603在手術(shù)后12個(gè)月和在被診斷為復(fù)發(fā)之前4個(gè)月AKAP4表達(dá)急劇上升。沒(méi)有獲得患者vh.554的手術(shù)前樣品，但是手術(shù)后6個(gè)月的樣品處于非癌癥范圍。患者vh.554在手術(shù)后32個(gè)月顯示AKAP4急劇增加，與診斷的復(fù)發(fā)和經(jīng)歷的放射治療相關(guān)。在第3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，放射治療后3個(gè)月的AKAP4信號(hào)已經(jīng)大大降低，但仍然在癌癥范圍內(nèi)。出乎意料地確定的是，肺中腫瘤的存在與在外周血樣品中檢測(cè)到AKAP4信號(hào)之間存在強(qiáng)相關(guān)性。前述實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方案的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是示例性的，而不是限制權(quán)利要求所限定的本發(fā)明。容易理解的是，可以使用上述特征的許多變化和組合，而不脫離權(quán)利要求中闡述的本發(fā)明。這樣的變化不被認(rèn)為是偏離本發(fā)明的范圍，并且所有這樣的變化旨在包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3