本申請(qǐng)要求于2014年6月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/012,722和于2014年6月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/012,586的權(quán)益，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及提高具有羧酸還原酶活性的多肽對(duì)二羧酸的活性的方法，其通過(guò)使用具有丙二?；?CoA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽將二羧酸酶促轉(zhuǎn)化成甲酯進(jìn)行。本發(fā)明還涉及用于生物合成2,4-戊二烯?；?CoA(例如作為生物合成1,3-丁二烯的前體)的方法，且更具體地涉及使用一種或多種分離的酶，諸如丙二酰基-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶,甲酯酯酶、羧酸還原酶、或5-羥基戊?；?CoA脫水酶中的一種或多種，或使用表達(dá)一種或多種此類酶的重組宿主細(xì)胞合成2,4-戊二烯?；?CoA。

發(fā)明背景

1,3-丁二烯(以下為丁二烯)是用于生產(chǎn)合成橡膠的重要單體，包括苯乙烯-丁二烯橡膠(SBR)，聚丁二烯(PB)，苯乙烯-丁二烯乳膠(SBL)，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹(shù)脂(ABS)，腈橡膠(nitrile rubber)和己二腈，其用于制造尼龍-66(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

丁二烯通常從蒸汽裂化過(guò)程(steam cracking process)作為副產(chǎn)物產(chǎn)生，蒸餾成粗丁二烯流，并通過(guò)萃取蒸餾純化(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

已經(jīng)通過(guò)正丁烷和正丁烯的脫氫(Houdry法)；和正丁烯的氧化脫氫(Oxo-D或O-X-D法)在其它方法中制備了目的丁二烯(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)。

在工業(yè)上，95％的全球丁二烯生產(chǎn)通過(guò)使用基于石油化工的原料諸如石腦油的蒸汽裂化過(guò)程進(jìn)行。考慮到生產(chǎn)的高成本和低工藝產(chǎn)率(White,Chemico-Biological Interactions,2007,166,10-14)，目的丁二烯的生產(chǎn)是不顯著的。

鑒于依賴于石油化工原料，以及對(duì)于目的丁二烯，依賴于能量密集的催化步驟；生物技術(shù)通過(guò)生物催化提供了一種替代方法。生物催化是使用生物催化劑，如酶，來(lái)進(jìn)行有機(jī)化合物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。

因此，在這種背景下，顯然需要用于生產(chǎn)中間體的可持續(xù)方法。其中所述方法是基于生物催化劑的(Jang等人，Biotechnology&Bioengineering,2012,109(10),2437–2459)。

發(fā)明概述

本公開(kāi)至少部分基于開(kāi)發(fā)用于生物合成2,4-戊二烯酰基-CoA或其前體的酶系統(tǒng)和重組宿主，其可用于制備例如1,3-丁二烯和1,3-丁二烯的聚合物或共聚物。具體地，如本文所述，2,4-戊二烯?；?CoA可以由可再生原料生物合成產(chǎn)生，而不需要任何化學(xué)催化劑，如金屬氧化物。例如，在本文所述的途徑中，2,4-戊二烯酰基-CoA可以通過(guò)各種甲基酯屏蔽途徑(methyl-ester shielded route)由丙二酰基-CoA或丙二?；?[acp]制備。此類甲基酯屏蔽途徑包括使用甲酯酯酶，如庚二酰基-[acp]甲酯酯酶(pimelyl-[acp]methyl ester esterase)或酯酶水解戊二?；?[acp]甲酯、戊二?；?CoA甲酯、戊二酸甲酯、戊二酸半醛甲酯、或5-羥基戊酸甲酯的甲酯，并使用5-羥基戊?；?CoA脫水酶引入1,3-丁二烯的第一末端乙烯基。例如，1,3-丁二烯可以由源自2,4-戊二烯基-CoA的前體制備，如圖7概述。

在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由轉(zhuǎn)化成戊二?；?[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯，接著(i)分別將戊二?；?[acp]甲酯或戊二?；?CoA甲酯脫酯化成戊二?；?[acp]或戊二酰基-CoA，或者(ii)將戊二?；?[acp]甲酯或戊二?；?CoA甲酯水解成戊二酸甲酯從丙二?；?[acp]或丙二?；?CoA形成用于轉(zhuǎn)化成1,3-丁二烯的C5脂肪族主鏈。參見(jiàn)圖1-3。

在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生C5脂肪族主鏈的途徑中的酶有目的地含有不可逆的酶促步驟。

在一些實(shí)施方案中，可以使用酯酶、硫酯酶、可逆性CoA連接酶、CoA轉(zhuǎn)移酶、醛脫氫酶、7-氧庚酸脫氫酶、6-氧己酸脫氫酶或5-氧戊酸脫氫酶酶促形成末端羧基基團(tuán)。參見(jiàn)圖4。

在一些實(shí)施方案中，可以使用醇脫氫酶，4-羥基丁酸脫氫酶，5-羥基戊酸脫氫酶和6-羥基己酸脫氫酶進(jìn)行酶促形成末端羥基基團(tuán)。參見(jiàn)圖5。

在一些實(shí)施方案中，可以使用5-羥基戊?；?CoA脫水酶來(lái)酶促形成末端乙烯基。參見(jiàn)圖6。

在一個(gè)方面，本文件特征在于在重組宿主中生物合成戊二酸甲酯的方法。該方法包括在宿主中使用至少一種具有丙二酰基-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽和至少一種具有硫酯酶活性的多肽將丙二?；?[acp]和丙二?；?CoA中的至少一種酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯。

在一些實(shí)施方案中，使用至少一種具有丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽將丙二?；?[acp]酶促轉(zhuǎn)化成丙二酰基-[acp]甲酯?？梢允褂弥辽僖环N具有選自下組活性的多肽將丙二?；?[acp]甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二?；?[acp]甲酯：合酶活性、脫氫酶活性、脫水酶活性、和還原酶活性?？梢允褂弥辽僖环N具有硫酯酶活性的多肽將戊二?；?[acp]甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯。

在一些實(shí)施方案中，使用至少一種具有丙二酰基-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽將丙二?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成丙二?；?CoA甲酯?？梢允褂弥辽僖环N具有選自下組活性的多肽將丙二?；?CoA甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酰基-CoA甲酯：合酶活性、β-酮硫解酶活性、脫氫酶活性、水合酶活性、和還原酶活性。可以使用至少一種具有硫酯酶活性的多肽將戊二?；?CoA甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯。

具有丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

具有還原酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:19或20中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在宿主中使用至少一種具有羧酸還原酶活性的多肽將戊二酸甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸半醛甲酯。具有羧酸還原酶活性的多肽可以與具有磷酸泛酰巰基乙胺(phosphopantetheine)轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑活性的多肽組合使用。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用至少一種具有選自下組活性的多肽將戊二酸甲酯酶促轉(zhuǎn)化成5-氧戊酸：羧酸還原酶活性和酯酶活性。具有羧酸還原酶活性的多肽可以與具有磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑活性的多肽組合使用。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用至少一種具有酯酶活性的多肽將戊二酸半醛甲酯酶促轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用至少一種具有脫氫酶活性的多肽將戊二酸半醛甲酯酶促轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。

具有酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用至少一種具有酯酶活性的多肽將戊二酸甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸。方法可以進(jìn)一步包括使用至少一種具有羧酸還原酶活性的多肽和至少一種具有EC 1.1.1.-下分類的脫氫酶活性的多肽將戊二酸酶促轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。具有羧酸還原酶活性的多肽可以與具有磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑活性的多肽組合使用。

具有羧酸還原酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:2-7中任一項(xiàng)中列出的任一種氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

具有硫酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:17、18、22、和23中列出的任一種氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用至少一種具有選自下組活性的多肽將5-羥基戊酸酶促轉(zhuǎn)化成2,4-戊二烯?；?CoA：CoA-轉(zhuǎn)移酶活性、合酶活性、和脫水酶活性。具有CoA-轉(zhuǎn)移酶活性或合酶活性的多肽和具有脫水酶活性的多肽可以將5-羥基戊酸酶促轉(zhuǎn)化成2,4-戊二烯酰基-CoA。方法可以進(jìn)一步包括使用至少一種具有選自下組活性的多肽2,4-戊二烯?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成1,3丁二烯：水合酶活性、硫酯酶活性、脫羧酶活性、脫氫酶活性、CoA-轉(zhuǎn)移酶活性、和脫水酶活性。

具有硫酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:14-15中列出的任一種氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在另一個(gè)方面中，本文件特征在于制備戊二酸的方法。方法包括(i)使用具有庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽將戊二?；?[acp]甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二?；?[acp]或戊二酰基-CoA甲酯成戊二?；?CoA，并且(ii)使用至少一種具有硫酯酶活性、可逆的CoA-連接酶活性、CoA-轉(zhuǎn)移酶活性、?；摎涿富钚浴⑷┟摎涿富钚?、戊二酸半醛脫氫酶活性或琥珀酸-半醛脫氫酶活性的多肽將戊二酰基-[acp]或戊二?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸。

具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在一些實(shí)施方案中，使用具有硫酯酶活性的多肽將戊二?；?[acp]或戊二?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸。在一些實(shí)施方案中，使用具有可逆的CoA-連接酶活性或CoA-轉(zhuǎn)移酶活性的多肽將戊二?；?[acp]或戊二?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸。在一些實(shí)施方案中，使用具有酰化脫氫酶活性、醛脫氫酶活性、戊二酸半醛脫氫酶活性、或琥珀酸-半醛脫氫酶活性的多肽將戊二?；?[acp]或戊二?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸。

在另一個(gè)方面中，本文件特征在于重組宿主細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞包括至少一種外源核酸，所述外源核酸編碼具有丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽和具有硫酯酶活性的多肽，所述宿主產(chǎn)生戊二酸甲酯。

宿主可以進(jìn)一步包含具有羧酸還原酶活性的外源多肽，所述宿主產(chǎn)生戊二酸半醛甲酯。在一些實(shí)施方案中，宿主進(jìn)一步包含一種或多種具有選自下組活性的外源多肽：合酶活性、脫氫酶活性、脫水酶活性、和還原酶活性。在一些實(shí)施方案中，宿主進(jìn)一步包含一種或多種具有選自下組活性的外源多肽：合酶活性、β-酮硫解酶活性、脫氫酶活性、水合酶活性、和還原酶活性。

具有丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

具有硫酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:17-18中任一項(xiàng)中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

具有還原酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:19或20中列出的任一種氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

宿主可以進(jìn)一步包含具有酯酶活性的外源多肽，所述宿主進(jìn)一步生成戊二酸或5-氧戊酸。

在一些實(shí)施方案中，宿主包含一種或多種具有選自下組活性的外源多肽：酯酶活性、6-羥基己酸脫氫酶活性、4-羥基丁酸脫氫酶活性、5-羥基戊酸脫氫酶活性、和醇脫氫酶活性，所述宿主產(chǎn)生5-羥基戊酸。宿主可以進(jìn)一步包含具有選自下組活性的外源多肽：CoA-轉(zhuǎn)移酶活性、合酶活性、和脫水酶活性，所述宿主從5-羥基戊酸生成2,4-戊二烯酰基-CoA。宿主可以進(jìn)一步包含一種或多種具有選自下組活性的外源多肽：水合酶活性、硫酯酶活性、脫羧酶活性、脫氫酶活性、CoA-轉(zhuǎn)移酶活性、和脫水酶活性，所述宿主從2,4-戊二烯?；?CoA生成1,3-丁二烯。

具有硫酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

具有羧酸還原酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:2-7中任一項(xiàng)中列出的任一種氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)宿主包含具有羧酸還原酶活性的外源多肽時(shí)，它與具有磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑活性的外源多肽組合使用。

在另一個(gè)方面中，本文件特征在于重組宿主，其包含至少一種外源核酸，所述外源核酸編碼具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽，和至少一種具有選自下組活性的多肽：硫酯酶活性、可逆的CoA-連接酶活性、CoA-轉(zhuǎn)移酶活性、?；摎涿富钚?、醛脫氫酶活性、戊二酸半醛脫氫酶活性、和琥珀酸-半醛脫氫酶活性。

具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽可以與SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(例如至少75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)宿主包含具有羧酸還原酶活性的多肽時(shí)，它與具有磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑活性的外源多肽組合使用。

在另一個(gè)方面中，本文件特征在于生物衍生的產(chǎn)物(bio-derived product)、基于生物的產(chǎn)物(bio-based product)或發(fā)酵衍生的產(chǎn)物(fermentation-derived product)，其中所述產(chǎn)物包含：(i.)組合物，所述組合物包含如本文中描述的至少一種生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的化合物，或其任何組合；(ii.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的聚合物，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的組合物或化合物，或其任何組合；(iii.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的樹(shù)脂，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的化合物或生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的組合物或其任何組合或ii.的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的聚合物或其任何組合或ii.的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的聚合物或其任何組合；(iv.)成型物質(zhì)，其通過(guò)使(ii.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的聚合物或(iii.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的樹(shù)脂或其任何組合成型獲得；(v.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的配制劑，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的組合物、(i.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的化合物、(ii.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的聚合物、(iii.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的樹(shù)脂，或(iv.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的成型物質(zhì)，或其任何組合；或(vi.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的半固體或非半固體流(stream)，其包含(i.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的組合物、(i.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的化合物、(ii.)的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的聚合物、(iii.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的樹(shù)脂，(v.)生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的配制劑，或iv的生物衍生的、基于生物的或發(fā)酵衍生的成型物質(zhì)，或其任何組合。

本文件特征還在于提高具有羧酸還原酶活性的多肽對(duì)取代的或未取代的C₄-C₈二羧酸諸如戊二酸或肥酸(adipic acid)的活性的方法。所述方法包括使用具有丙二?；?CoA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽將所述C₄-C₈二羧酸酶促轉(zhuǎn)化成HOC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃酯，之后使用具有羧酸還原酶活性的多肽將所述HOC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃酯酶促轉(zhuǎn)化成HC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃。該方法可以進(jìn)一步包括使用具有脫氫酶活性的多肽將所述HC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃轉(zhuǎn)化成HOCH₂(C2-C6烴基)-C(＝O)OCH₃。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用具有酯酶活性的多肽將所述HOCH₂(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃酶促轉(zhuǎn)化成HOCH₂(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OH。

本文件特征還在于重組宿主，其包含至少一種外源核酸，所述外源核酸編碼(i)丙二酰基-[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶，(ii)庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶和(iii)硫酯酶，并且生成戊二酸甲酯、戊二?；?[acp]或戊二?；?CoA。

生成戊二酸甲酯的此類重組宿主進(jìn)一步可以包含酯酶，并且進(jìn)一步生成戊二酸。

生成戊二?；?[acp]的此類重組宿主進(jìn)一步可以包含硫酯酶，并且生成戊二酸。

生成戊二?；?CoA的此類重組宿主進(jìn)一步可以包含下列一種或多種：(i)硫酯酶，(ii)可逆性CoA連接酶，(iii)CoA轉(zhuǎn)移酶，或(iv)?；摎涿福?v)醛脫氫酶諸如7-氧庚酸脫氫酶、6-氧己酸脫氫酶或5-氧戊酸脫氫酶，并且進(jìn)一步生成戊二酸或5-氧戊酸。

生成5-氧戊酸或戊二酸的重組宿主進(jìn)一步可以包含下列一種或多種：(i)醇脫氫酶或(ii)羧酸還原酶，并且進(jìn)一步生成5-羥基戊酸。

生成戊二酸甲酯的重組宿主進(jìn)一步可以包含下列一種或多種：(i)醇脫氫酶、(ii)酯酶或(iii)羧酸還原酶，并且進(jìn)一步生成5-羥基戊酸。

在另一個(gè)方面中，本文件特征在于用于生成生物衍生的4或5碳化合物的方法。所述方法包括在下述條件下將如本文中描述的宿主培養(yǎng)或生長(zhǎng)足夠的時(shí)間段，所述條件和時(shí)間段產(chǎn)生生物衍生的4或5碳化合物，其中任選地，生物衍生的4或5碳化合物可以選自下組：2,4-戊二烯酰基-CoA、戊二?；?[acp]甲酯、5-羥基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其組合。

在另一個(gè)方面中，本文件特征在于組合物，其包含生物衍生的4或5碳化合物和除了生物衍生的4或5碳化合物外的化合物，其中生物衍生的4或5碳化合物選自下組：2,4-戊二烯?；?CoA、戊二酰基-[acp]甲酯、5-羥基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其組合。例如，生物衍生的4碳化合物可以是宿主細(xì)胞或生物體的細(xì)胞部分。

本文件特征還在于基于生物(biobased)的聚合物，其包含生物衍生的4或5碳化合物，包括2,4-戊二烯?；?CoA、戊二?；?[acp]甲酯、5-羥基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其組合。

本文件特征還在于基于生物的樹(shù)脂，其包含生物衍生的4或5碳化合物，包括2,4-戊二烯?；?CoA、戊二?；?[acp]甲酯、5-羥基戊酸、3-丁烯-2-酮、3-丁烯-2-醇、1,3-丁二烯及其組合，以及通過(guò)將基于生物的樹(shù)脂成型獲得的成型產(chǎn)物。

在另一個(gè)方面中，本文件的特征還在于用于生成基于生物的聚合物的方法，其包括在聚合物生成反應(yīng)中使生物衍生的4或5碳化合物與自身或另一種化合物起化學(xué)反應(yīng)。

在另一個(gè)方面中，本文件的特征在于用于生成如本文中描述的基于生物的樹(shù)脂的方法，其包括在樹(shù)脂生成反應(yīng)中使生物衍生的4或5碳化合物與自身或另一種化合物起化學(xué)反應(yīng)。

本文件特征還在于包括丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，其中丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶將丙二?；?[acp]酶促轉(zhuǎn)化成丙二?；?[acp]甲酯。生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括合酶，脫氫酶，脫水酶，還原酶和硫酯酶，其中合酶，脫氫酶，脫水酶，還原酶和硫酯酶，將丙二酰基-[acp]甲酯酶促轉(zhuǎn)化為戊二酸甲酯。

在一些實(shí)施方案中，生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步包括羧酸還原酶，其中羧酸還原酶將戊二酸甲酯酶促轉(zhuǎn)化戊二酸半醛甲酯。生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括酯酶和脫氫酶，其中酯酶和脫氫酶將戊二酸半醛甲酯酶促轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。

在一些實(shí)施方案中，生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括CoA-轉(zhuǎn)移酶和脫水酶，其中CoA-轉(zhuǎn)移酶和脫水酶將5-羥基戊酸酶促轉(zhuǎn)化2,4-戊二烯酰基-CoA。生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括水合酶，硫酯酶，脫羧酶，脫氫酶，CoA轉(zhuǎn)移酶和脫水酶，其中水合酶，硫酯酶，脫羧酶，脫氫酶，CoA轉(zhuǎn)移酶和脫水酶將2,4-戊二烯酰基-CoA酶促轉(zhuǎn)化成1,3-丁二烯。

本文件特征還在于包括丙二酰基-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，其中所述丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶將丙二?；?CoA酶促轉(zhuǎn)化成丙二酰基-CoA甲基酯。生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括合酶，β-酮硫解酶，脫氫酶，水合酶，還原酶和硫酯酶，其中合酶，β-酮硫解酶，脫氫酶，水合酶，還原酶和硫酯酶將丙二?；?CoA甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯。

在一些實(shí)施方案中，生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步包括羧酸還原酶，其中羧酸還原酶將戊二酸甲酯酶促轉(zhuǎn)化成戊二酸半醛甲酯。生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括酯酶和脫氫酶，其中酯酶和脫氫酶將戊二酸半醛甲酯酶促轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。

在一些實(shí)施方案中，生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括CoA-轉(zhuǎn)移酶和脫水酶，其中CoA-轉(zhuǎn)移酶和脫水酶將5-羥基戊酸酶促轉(zhuǎn)化成2,4-戊二烯?；?CoA。生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步包括水合酶，硫酯酶，脫羧酶，脫氫酶，CoA轉(zhuǎn)移酶和脫水酶，其中水合酶，硫酯酶，脫羧酶，脫氫酶，CoA轉(zhuǎn)移酶和脫水酶將2,4-戊二烯酰基-CoA酶促轉(zhuǎn)化成1,3-丁二烯。

本文件特征還在于提高具有羧酸還原酶活性的多肽對(duì)取代的或未取代的C₄-C₈二羧酸諸如戊二酸或肥酸的活性的方法。所述方法包括使用具有丙二酰基-CoA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽將所述C₄-C₈二羧酸酶促轉(zhuǎn)化成HOC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃酯，之后使用具有羧酸還原酶活性的多肽將所述HOC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃酯酶促轉(zhuǎn)化成HC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃。所述方法可以進(jìn)一步包括使用具有脫氫酶活性的多肽將所述HC(＝O)(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃轉(zhuǎn)化成HOCH₂(C2-C6烴基)-C(＝O)OCH₃。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使用具有酯酶活性的多肽將所述HOCH₂(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OCH₃產(chǎn)物酶促轉(zhuǎn)化成HOCH₂(C₂-C₆烴基)-C(＝O)OH產(chǎn)物。

可以在重組宿主中通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行任一方法。宿主可以經(jīng)受需氧，厭氧或微需氧培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)策略?？梢栽跔I(yíng)養(yǎng)限制，諸如磷酸鹽、氧或氮限制的條件下培養(yǎng)宿主。可以使用陶瓷膜保留所述宿主以在發(fā)酵期間維持高細(xì)胞密度。

在一些實(shí)施方案中，所述宿主經(jīng)受需氧或微需氧培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)策略。

在一些實(shí)施方案中，生物原料可以用作發(fā)酵的主要碳源。例如，生物原料可以是或可以源自單糖，二糖，木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃縮酒糟(condensed distillers'solubles)或城市廢物。

在一些實(shí)施方案中，非生物原料可以用作發(fā)酵的主要碳源。非生物原料可以是或可以源自天然氣、合成氣、CO₂/H₂、甲醇、乙醇、苯甲酸鹽、非揮發(fā)性殘留物(NVR)或來(lái)自環(huán)己烷氧化過(guò)程的堿洗液(caustic wash)廢物流、或?qū)Ρ蕉姿?異酞酸混合物廢物流。

在本文中描述的任何實(shí)施方案中，宿主可以是原核生物。原核生物可以選自下組：埃希氏菌屬(Escherichia)；梭菌屬(Clostridia)；棒狀桿菌屬(Corynebacteria)；貪銅菌屬(Cupriavidus)；假單胞菌屬(Pseudomonas)；代爾夫特菌屬(Delftia)；芽孢桿菌屬(Bacilluss)；乳桿菌屬(Lactobacillus)；乳球菌屬(Lactococcus)；和紅球菌屬(Rhodococcus)。例如，原核生物選自下組：大腸桿菌(Escherichia coli)、楊氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、克魯佛梭菌(Clostridium kluyveri)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、鉤蟲(chóng)貪銅菌(Cupriavidus necator)、耐金屬貪銅菌(Cupriavidus metallidurans)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、食油假單胞菌(Pseudomonas oleavorans)、食酸代爾夫特菌(Delftia acidovorans)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtillis)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和馬紅球菌(Rhodococcus equi)。

在本文中描述的任何實(shí)施方案中，宿主可以是真核生物。真核生物可以選自下組：曲霉屬(Aspergillus)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤氏酵屬(Pichia)、耶羅維亞酵母屬(Yarrowia)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、Arxula、和克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)。例如，真核生物可以選自下組：黑曲霉(Aspergillus niger)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)、東方伊薩酵母(Issathenkia orientalis)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、Arxula adenoinivorans、和乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)。

在一些實(shí)施方案中，宿主展現(xiàn)出對(duì)高濃度C5構(gòu)件塊(C5building block)的耐受性，并且其中經(jīng)由在選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)改善所述對(duì)高濃度C5構(gòu)件塊的耐受性。

在一些實(shí)施方案中，將宿主的內(nèi)源生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)減弱或提升以(1)確保乙?；?CoA的胞內(nèi)利用度，(2)產(chǎn)生輔因子，即NADH或NADPH的不平衡，其可以經(jīng)由形成戊二酸甲酯、2,4-戊二烯?；?CoA、或1,3-丁二烯來(lái)進(jìn)行平衡，(3)防止導(dǎo)致的中心代謝物，中心前體的降解并且所述中心代謝物，中心前體包括戊二酸甲酯、2,4-戊二烯?；?CoA、或1,3-丁二烯，并且(4)確保從細(xì)胞的足夠流出。

在一些實(shí)施方案中，宿主包含下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：通過(guò)過(guò)表達(dá)形成草乙酸的重組基因在宿主中提高用于生物合成C5構(gòu)件塊的草乙酸的胞內(nèi)濃度；其中產(chǎn)生NADPH的不平衡，其可以經(jīng)由形成C5構(gòu)件塊來(lái)平衡；其中使用用于賴氨酸合成的間2,6二氨基庚二酸(meso 2,6diaminopimelate)途徑在宿主中引入經(jīng)由2-氧代己二酸(2-oxoadipate)從2-酮戊二酸合成賴氨酸的外源賴氨酸生物合成途徑；其中使用用于賴氨酸合成的2-氧代己二酸途徑在宿主中引入從草乙酸至間2,6二氨基庚二酸合成賴氨酸的外源賴氨酸生物合成途徑；其中在宿主中減弱所導(dǎo)致的并且包括C5構(gòu)件塊的中心代謝物和中心前體的內(nèi)源降解途徑；或者其中通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜的遺傳工程化結(jié)構(gòu)修飾或者提高用于C5構(gòu)件塊的任何相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增強(qiáng)或放大C5構(gòu)件塊穿過(guò)細(xì)胞膜流出到胞外培養(yǎng)基。

本文中描述的任何重組宿主可以進(jìn)一步包含一種或多種以下弱化的多肽，其具有弱化的下列各項(xiàng)的活性：聚羥基烷酸酯合酶、乙?；?CoA硫酯酶、乙?；?CoA特異性β-酮硫解酶、乙酰乙?；?CoA還原酶、形成乙酸的磷酸乙酸轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乳酸脫氫酶、menaquinol-延胡索酸氧化還原酶、產(chǎn)生異丁醇的2-酮酸(oxoacid)脫羧酶、形成乙醇的醇脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、丙酮酸脫羧酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、消散輔因子不平衡的轉(zhuǎn)氫酶、對(duì)產(chǎn)生了不平衡的輔因子特異的谷氨酸脫氫酶、利用NADH/NADPH的谷氨酸脫氫酶、庚二酰基-CoA脫氫酶；接受C5構(gòu)件塊和中心前體作為底物的酰基-CoA脫氫酶；戊二酰基-CoA脫氫酶；和庚二?；?CoA合成酶。

本文中描述的任何重組宿主可以進(jìn)一步過(guò)表達(dá)一種或多種編碼多肽的基因，所述多肽具有：乙?；?CoA合成酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶；轉(zhuǎn)酮醇酶；反饋抗性蘇氨酸脫氨酶；吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(puridine nucleotide transhydrogenase)；甲酸脫氫酶；甘油醛-3P-脫氫酶；蘋(píng)果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；果糖1,6二磷酸酶；丙?；?CoA合成酶；L-丙氨酸脫氫酶；L-谷氨酸脫氫酶；L-谷氨酸合成酶；賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；和/或多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。

本文中所述的途徑的反應(yīng)可在一種或多種細(xì)胞(例如宿主細(xì)胞)菌株中進(jìn)行，所述菌株(a)天然表達(dá)一種或多種相關(guān)酶，(b)經(jīng)基因工程化改造以表達(dá)一種或多種相關(guān)酶，或(c)天然表達(dá)一種或多種相關(guān)酶并且遺傳工程化改造以表達(dá)一種或多種相關(guān)酶?；蛘?，可以從上述類型的宿主細(xì)胞中提取相關(guān)酶，并以純化或半純化形式使用。提取的酶可以任選地固定在合適的反應(yīng)容器的底部和/或壁上。此外，這些提取物包括可用作相關(guān)酶來(lái)源的裂解物(例如細(xì)胞裂解物)。在文獻(xiàn)提供的方法中，所有步驟可以在細(xì)胞(例如宿主細(xì)胞)中進(jìn)行，所有步驟可以使用提取的酶進(jìn)行，或者一些步驟可以在細(xì)胞中進(jìn)行，而其它步驟可以使用提取的酶進(jìn)行。

除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的含義。盡管與本文中所述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于實(shí)施本發(fā)明，但下文描述了合適的方法和材料。本文中提及的所有出版物，專利申請(qǐng)，專利和其它參考文獻(xiàn)，包括具有登錄號(hào)的GenBank和NCBI提交物通過(guò)引用整體并入。在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料，該方法和實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，而不是限制性的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，當(dāng)存在于母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子，堿土金屬離子或鋁離子替代；或與有機(jī)堿配位時(shí)，含有羧酸基團(tuán)的化合物(包括但不限于有機(jī)一元酸，羥基酸，氨基酸和二羧酸)形成或轉(zhuǎn)化成其離子鹽形式。可接受的有機(jī)堿包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等?？山邮艿臒o(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。將本發(fā)明的鹽分離為鹽或通過(guò)經(jīng)由添加酸或用酸性離子交換樹(shù)脂處理將pH降至pKa以下而轉(zhuǎn)化成游離酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，含有胺基團(tuán)的化合物(包括但不限于有機(jī)胺，氨基酸和二胺)形成或轉(zhuǎn)化為它們的離子鹽形式，例如通過(guò)向胺中加入酸性質(zhì)子形成銨鹽，與無(wú)機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等形成；或與有機(jī)酸形成，包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋(píng)果酸，馬來(lái)酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羥基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等?？山邮艿臒o(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。本發(fā)明的鹽以鹽的形式分離或通過(guò)經(jīng)由添加堿或用堿性離子交換樹(shù)脂處理將pH至高于pKb轉(zhuǎn)化成游離胺。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，含有胺基團(tuán)和羧酸基團(tuán)兩者的化合物(包括但不限于氨基酸)通過(guò)以下形成或轉(zhuǎn)化成它們的離子鹽形式：通過(guò)1)與無(wú)機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述無(wú)機(jī)酸包括但不限于鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或與有機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述有機(jī)酸包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋(píng)果酸，馬來(lái)酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羥基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基雙環(huán)-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等?？山邮艿臒o(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等，或2)當(dāng)存在于母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子，堿土金屬離子或鋁離子置換時(shí)；或與有機(jī)堿配位?？山邮艿挠袡C(jī)堿包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等?？山邮艿臒o(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鋁，氫氧化鈣，氫氧化鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉等。本發(fā)明的鹽可以作為鹽分離或通過(guò)經(jīng)由添加酸或用酸性離子交換樹(shù)脂處理將pH降至pKa以下而轉(zhuǎn)化為游離酸。

在下面的附圖和描述中闡述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的其它特征，目的和優(yōu)點(diǎn)將從說(shuō)明書(shū)和附圖以及權(quán)利要求書(shū)中顯而易見(jiàn)。根據(jù)專利法中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，權(quán)利要求書(shū)中的詞語(yǔ)“包括”可以被“基本上由...組成”或由“由...組成”替代。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是從丙二酰基-[acp]導(dǎo)致戊二酸甲酯或戊二?；?[acp]的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖2是使用NADPH作為還原性等同物從丙二?；?CoA導(dǎo)致戊二酸甲酯或戊二?；?CoA的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖3是使用NADH作為還原性等同物從丙二?；?CoA導(dǎo)致戊二酸甲酯或戊二酰基-CoA的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖4是使用戊二酸甲酯、戊二?；?[acp]或戊二?；?CoA作為中心前體導(dǎo)致戊二酸的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖5是使用戊二酸甲酯或戊二酸作為中心前體導(dǎo)致5-羥基戊酸的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖6是使用5-羥基戊酸作為中心前體導(dǎo)致2,4-戊二烯?；?CoA的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖7是使用2,4-戊二烯?；?CoA作為中心前體導(dǎo)致1,3-丁二烯的例示性生物化學(xué)途徑的示意圖。

圖8含有大腸桿菌庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAC76437.1，SEQ ID NO:1)，海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)羧酸還原酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ACC40567.1，SEQ ID NO:2)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)羧酸還原酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABK71854.1，SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus羧酸還原酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)EFV11917.1，SEQ ID NO:4)，恥垢分枝桿菌羧酸還原酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABK75684.1，SEQ ID NO:5)，馬賽分枝桿菌(Mycobacterium massiliense)羧酸還原酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)EIV11143.1，SEQ ID NO:6)，Segniliparus rotundus羧酸還原酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ADG98140.1，SEQ ID NO:7)，熒光假單胞菌酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAC60471.2，SEQ ID NO:8)，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)?；?[acp]硫酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABJ63754.1，SEQ ID NO:9)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)酰基-[acp]硫酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABJ63754.1，SEQ ID NO:10)，齒垢密螺旋體(Treponema denticola)烯?；?CoA還原酶(參見(jiàn)，例如Genbank登錄號(hào)AAS11092.1，SEQ ID No:11)，細(xì)小裸藻(Euglena gracilis)烯酰基-CoA還原酶(參見(jiàn)，例如Genbank登錄號(hào)AAW66853.1，SEQ ID No:12)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)丙二?；?[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)，例如Genbank登錄號(hào)AAP11034.1，SEQ ID No:13)，大腸桿菌硫酯酶(參見(jiàn)，例如Genbank登錄號(hào)AAB59067.1，SEQ ID No:14)，和大腸桿菌硫酯酶(參見(jiàn)，例如Genbank登錄號(hào)AAA24665.1，SEQ ID No:15)，枯草芽孢桿菌磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)CAA44858.1，SEQ ID NO:16)，諾卡氏菌屬物種(Nocardia sp.)NRRL 5646磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABI83656.1，SEQ ID NO:17)的氨基酸序列，

圖9是柱狀圖，該柱狀圖匯總了20分鐘后在340nm的吸光度的變化，其是僅酶的對(duì)照(無(wú)底物)中的NADPH的消耗和5種羧酸還原酶制備物的活性的測(cè)量。

圖10是20分鐘后在340nm的吸光度的變化的柱狀圖，所述變化是相對(duì)于空載體對(duì)照，NADPH的消耗和用于將戊二酸甲酯轉(zhuǎn)化成戊二酸半醛甲酯的羧酸還原酶制備物的活性的測(cè)量。

圖11是通過(guò)庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶，戊二?；?CoA甲酯至戊二酰基-CoA的1小時(shí)后轉(zhuǎn)化表。

發(fā)明詳述

本文件提供了酶、非天然途徑、培養(yǎng)策略、給料、宿主微生物和對(duì)宿主生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的弱化，其可用于從中心前體或中心代謝物合成2,4-戊二烯?；?CoA和任選地1,3-丁二烯(又稱為丁-1,3-二烯，二乙烯，或乙烯基乙烯)。因此，丁二烯的產(chǎn)生可以經(jīng)由共同的中間體2,4-戊二烯酰基-CoA進(jìn)行，即使存在有可用于產(chǎn)生2,4-戊二烯?；?CoA的許多不同給料和不同途徑。例如，可以使用丙二酰基-CoA或丙二?；?[acp]經(jīng)由不同甲酯屏蔽途徑產(chǎn)生2,4-戊二烯?；?CoA。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“中心前體”用于表示導(dǎo)致5-羥基戊酸,2,4-戊二烯?；?CoA or丁二烯合成的本文中顯示的任何代謝途徑中的任何代謝物。術(shù)語(yǔ)“中心代謝物”在本文中用于表示在所有微生物中產(chǎn)生以支持生長(zhǎng)的代謝物。

因此，本文中描述的宿主微生物可以包含內(nèi)源途徑，該內(nèi)源途徑可以通過(guò)操作獲得，使得可以生成2,4-戊二烯?；?CoA。在內(nèi)源途徑中，宿主微生物天然表達(dá)催化途徑內(nèi)的反應(yīng)的所有酶。含有工程化途徑的宿主微生物不天然表達(dá)催化途徑內(nèi)的反應(yīng)的所有酶，但是已經(jīng)經(jīng)過(guò)工程化改造，使得在宿主中表達(dá)途徑內(nèi)的所有酶。

如本文中提及核酸(或蛋白質(zhì))和宿主使用的，術(shù)語(yǔ)“外源”指不像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)一樣存在于特定類型細(xì)胞中(并且不能從特定類型細(xì)胞獲得)的核酸或由所述核酸編碼的蛋白質(zhì)。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即視為對(duì)于宿主而言外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸序列的核酸亞序列或片段，只要該核酸作為整體不存在于自然界中。例如，表達(dá)載體內(nèi)含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦導(dǎo)入宿主中對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的，因?yàn)樵摵怂岱肿幼鳛檎w(基因組DNA加載體DNA)不存在于自然界中。如此，作為整體不存在于自然界中的任何載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或皰疹病毒)視為非天然存在的核酸。由此得出結(jié)論通過(guò)PCR或限制內(nèi)切性核酸酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段以及cDNA也視為非天然存在的核酸，因?yàn)樗鼈冏鳛槲匆?jiàn)于自然界的分開(kāi)的分子存在。由此還得出結(jié)論任何以未見(jiàn)于自然界中的排布含有啟動(dòng)子序列和多肽編碼序列(例如cDNA或基因組DNA)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是對(duì)于特定宿主微生物而言外源的。例如，從酵母x的細(xì)胞分離的完整染色體一旦將該染色體導(dǎo)入酵母y的細(xì)胞中就酵母y細(xì)胞而言是外源核酸。

比較而言，如本文中提及核酸(例如基因)(或蛋白質(zhì))和宿主使用的，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”指就像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)一樣的確存在于特定宿主中(并且可以從特定宿主獲得)的核酸(或蛋白質(zhì))。此外，“內(nèi)源表達(dá)”核酸(或蛋白質(zhì))的細(xì)胞就像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時(shí)相同特定類型的宿主那樣表達(dá)所述核酸(或蛋白質(zhì))。此外，“內(nèi)源生成”核酸、蛋白質(zhì)、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被發(fā)現(xiàn)時(shí)相同特定類型的宿主那樣生成所述核酸、蛋白質(zhì)、或化合物。

例如，根據(jù)宿主和由宿主產(chǎn)生的化合物，可以在宿主中表達(dá)一種或多種下列酶，包括丙二?；?[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶，庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶，酯酶，可逆性CoA連接酶，CoA轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酸脫氫酶，5-羥基戊酸脫氫酶，6-羥基己酸脫氫酶，醇脫氫酶，5-氧戊酸脫氫酶，6-氧己酸脫氫酶，7-氧庚酸脫氫酶，醛脫氫酶，或羧酸還原酶。在表達(dá)羧酸還原酶的重組宿主中，也可以表達(dá)磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，因?yàn)樗鰪?qiáng)羧酸還原酶的活性。

本文件特征還在于重組宿主，其包含至少一種外源核酸，所述外源核酸編碼(i)具有丙二?；?[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，(ii)具有庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽和(iii)具有硫酯酶活性的多肽，并且生成戊二酸甲酯、戊二?；?[acp]或戊二?；?CoA。

生成戊二酸甲酯的此類重組宿主進(jìn)一步可以包含具有酯酶活性的多肽，并且進(jìn)一步生成戊二酸。

生成戊二?；?[acp]的此類重組宿主進(jìn)一步可以包含具有硫酯酶活性的多肽，并且生成戊二酸。

生成戊二酰基-CoA此類重組宿主進(jìn)一步可以包含下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：(i)具有硫酯酶活性的多肽，(ii)具有可逆性CoA連接酶活性的多肽，(iii)具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，或(iv)具有?；摎涿富钚缘亩嚯模?v)具有醛脫氫酶活性諸如7-氧庚酸脫氫酶、6-氧己酸脫氫酶或5-氧戊酸脫氫酶活性的多肽，并且進(jìn)一步生成戊二酸或5-氧戊酸。

生成5-氧戊酸或戊二酸的重組宿主進(jìn)一步可以包含下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：(i)具有醇脫氫酶活性的多肽或(ii)具有羧酸還原酶活性的多肽，并且進(jìn)一步生成5-羥基戊酸。

生成戊二酸甲酯的重組宿主進(jìn)一步可以包含下列一項(xiàng)或多項(xiàng)：(i)具有醇脫氫酶活性的多肽，(ii)具有酯酶活性的多肽或(iii)具有羧酸還原酶活性的多肽，并且進(jìn)一步生成5-羥基戊酸。

在工程化途徑內(nèi)，酶可以來(lái)自單一來(lái)源，即來(lái)自一種物種或?qū)?，或者可以?lái)自多種來(lái)源，即不同物種或?qū)?。編碼本文中描述的酶的核酸已經(jīng)自各種生物體鑒定，并且在公眾可用的數(shù)據(jù)庫(kù)(諸如GenBank或EMBL)中容易地可得到。

可用于生成一種或多種C5構(gòu)件塊的本文中描述的任何酶可以與相應(yīng)野生型酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％)。應(yīng)當(dāng)理解，可以基于成熟酶(例如除去任何信號(hào)序列)或基于未成熟的酶(例如包括任何信號(hào)序列)測(cè)定序列同一性。還應(yīng)當(dāng)理解，初始甲硫氨酸殘基可以或可以不存在于本文中描述的任何酶序列上。

例如，具有本文中描述的庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽與大腸桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAC76437.1，SEQ ID NO:1)庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶的氨基酸序列可以具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖1-3。

例如，具有本文中描述的羧酸還原酶活性的多肽可以與海分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，恥垢分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，Segniliparus rugosus(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)EFV11917.1,SEQ ID NO:4)，恥垢分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABK75684.1,SEQ ID NO:5)，馬賽分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ADG98140.1,SEQ ID NO:7)羧酸還原酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖5。

例如，具有本文中描述的磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶活性的多肽可以與枯草芽孢桿菌磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)CAA44858.1,SEQ ID NO:16)或諾卡氏菌屬物種(Nocardia sp.)NRRL 5646磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABI83656.1，SEQ ID NO:17)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖5。

例如，具有本文中描述的酯酶活性的多肽可以與熒光假單胞菌酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAC60471.2,SEQ ID NO:8)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖4，5。

例如，具有本文中描述的硫酯酶活性的多肽可以與短乳桿菌?；?[acp]硫酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABJ63754.1，SEQ ID NO:9)，植物乳桿菌酰基-[acp]硫酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABJ63754.1，SEQ ID NO:10)，或大腸桿菌硫酯酶(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAB59067.1或AAA24665.1，SEQ ID NO:15-16)的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖4。

例如，具有本文中描述的丙二酰基-[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽可以與蠟狀芽孢桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAC76437.1,SEQ ID NO:13)丙二?；?[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖1-3。

例如，具有本文中描述的烯?；?CoA還原酶活性的多肽可以與齒垢密螺旋體(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAS11092.1,SEQ ID NO:11)，或細(xì)小裸藻(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)AAW66853.1,SEQ ID NO:12)烯酰基-CoA還原酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)。參見(jiàn)圖1-3。

可以如下測(cè)定兩種氨基酸序列間的百分比同一性(同源性)。首先，使用來(lái)自含有BLASTP第2.0.14版的單機(jī)版BLASTZ的BLAST 2Sequences(Bl2seq)程序比對(duì)氨基酸序列。此單機(jī)版BLASTZ可以獲自Fish&Richardson的網(wǎng)站(例如www.fr.com/blast/)或美國(guó)政府國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解釋如何使用Bl2seq程序的用法說(shuō)明可以參見(jiàn)伴隨BLASTZ的自述文件。Bl2seq使用BLASTP算法實(shí)施兩種氨基酸序列之間的比較。為了比較兩種氨基酸序列，如下設(shè)置Bl2seq的選項(xiàng)：-i設(shè)置為含有要比較的第一氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j設(shè)置為含有要比較的第二氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p設(shè)置為blastp；-o設(shè)置為任何期望的文件名稱(例如C:\output.txt)；并且所有其它選項(xiàng)保持為其缺省設(shè)置。例如，可以使用以下命令來(lái)產(chǎn)生含有兩種氨基酸序列間的比較的輸出文件：C:\Bl2seq–i c:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果兩種比較序列共享同源性(同一性)，那么指定的輸出文件會(huì)呈現(xiàn)那些同源性區(qū)作為比對(duì)序列。如果兩種比較序列不共享同源性(同一性)，那么指定的輸出文件不會(huì)呈現(xiàn)比對(duì)序列。可以對(duì)核酸序列遵循相似的規(guī)程，只是使用blastn。

一旦比對(duì)，通過(guò)計(jì)算相同氨基酸殘基在這兩種序列中呈現(xiàn)的位置的數(shù)目確定匹配數(shù)目。通過(guò)用匹配數(shù)目除以全長(zhǎng)多肽氨基酸序列的長(zhǎng)度，接著將所得的數(shù)值乘以100來(lái)確定百分比同一性(同源性)。注意到百分比同一性(同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和78.19被向上四舍五入到78.2。還注意到長(zhǎng)度值會(huì)總是整數(shù)。

應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，許多核酸可以編碼具有特定氨基酸序列的多肽。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性是本領(lǐng)域中公知的；即對(duì)于許多氨基酸，存在有超過(guò)一種充當(dāng)氨基酸密碼子的核苷酸三聯(lián)體。例如，可以修飾給定酶的編碼序列中的密碼子，從而獲得特定物種(例如細(xì)菌或真菌)中的最佳表達(dá)，這使用適合于所述物種的密碼子偏愛(ài)表進(jìn)行。

也可以在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“功能性片段”指具有至少25％(例如至少30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；或甚至大于100％)的相應(yīng)的成熟、全長(zhǎng)、野生型蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的肽片段。功能性片段一般但不總是可以由蛋白質(zhì)的連續(xù)區(qū)構(gòu)成，其中該區(qū)具有功能性活性。

此文件還提供了(i)本文件的方法中使用的酶的功能性變體和(ii)上文描述的功能性片段的功能性變體。相對(duì)于相應(yīng)的野生型序列，酶和功能性片段的功能性變體可以含有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般會(huì)具有不超過(guò)50(例如不超過(guò)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)處氨基酸取代(例如保守取代)。這適用于本文中描述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一種氨基酸取代具有相似特征的另一種。保守取代包括下列組內(nèi)的取代：纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸、和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸、半胱氨酸、和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上文提及的極性、堿性或酸性組的一種成員被相同組的另一種成員的任何取代可以視為保守取代。比較而言，非保守取代是用一種氨基酸取代具有不同特征的另一種。

缺失變體可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個(gè)氨基酸的區(qū)段(具有兩種或更多種氨基酸)或非連續(xù)的單一氨基酸。添加(添加變體)包括融合蛋白，其含有：(a)本文中描述的任何酶或其片段；和(b)內(nèi)部或末端(C或N)無(wú)關(guān)或異源氨基酸序列。在此類融合蛋白的背景中，術(shù)語(yǔ)“異源氨基酸序列”指與(a)不同的氨基酸序列。異源序列可以是例如用于純化重組蛋白的序列(例如FLAG、多組氨酸(例如六組氨酸)、凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP))。異源序列也可以是可用作可檢測(cè)標(biāo)志物的蛋白質(zhì)，例如螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、或氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白含有來(lái)自另一種蛋白質(zhì)的信號(hào)序列。在某些宿主細(xì)胞(例如酵母宿主細(xì)胞)中，可以經(jīng)由使用異源信號(hào)序列提高靶蛋白的表達(dá)和/或分泌。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引發(fā)免疫應(yīng)答以生成抗體的載體(例如KLH)或ER或高爾基體保留信號(hào)。異源序列可以是不同長(zhǎng)度的，并且在一些情況中可以是比與異源序列附接的全長(zhǎng)靶蛋白質(zhì)更長(zhǎng)的序列。

工程化宿主可以天然表達(dá)本文中描述的途徑的酶中的無(wú)一或一些(例如一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、或六種或更多種)。如此，工程化宿主內(nèi)的途徑可以包含所有外源酶，或者可以包含內(nèi)源和外源酶兩者。也可以破壞工程化宿主的內(nèi)源基因以阻止不想要的代謝物的形成或阻止經(jīng)由對(duì)中間體起作用的其它酶引起的途徑中此類中間體的損失。工程化宿主可以稱為重組宿主或重組宿主細(xì)胞。如本文中描述的，重組宿主可以包含編碼如本文中描述的還原酶、脫乙酰酶、N-乙?；D(zhuǎn)移酶、丙二?；?[acp]O-甲基轉(zhuǎn)移酶、酯酶、硫酯酶、水合酶、脫氫酶、CoA連接酶、和/或CoA轉(zhuǎn)移酶的活性。

另外，可以使用本文中描述的分離的酶，使用來(lái)自宿主微生物的裂解物(例如細(xì)胞裂解物)作為酶來(lái)源，或者使用來(lái)自不同宿主微生物的多種裂解物作為酶來(lái)源體外進(jìn)行一種或多種C5構(gòu)件塊的產(chǎn)生。

在生物合成2,4-戊二烯?；?CoA中產(chǎn)生末端羧基基團(tuán)的酶

如圖4中描繪，可以使用(i)具有硫酯酶活性的多肽，(ii)具有可逆性CoA連接酶活性的多肽，(iii)具有CoA轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，(iv)具有?；摎涿富钚缘亩嚯?，或(v)具有醛脫氫酶活性諸如7-氧庚酸脫氫酶、6-氧己酸脫氫酶、或5-氧戊酸脫氫酶活性的多肽，或(vi)具有酯酶活性的多肽酶促形成末端羧基基團(tuán)。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在EC 3.1.2.-下分類的硫酯酶，諸如YciA(SEQ ID NO:14)、tesB(Genbank登錄號(hào)AAA24665.1,SEQ ID NO:15)或Acot13(參見(jiàn)例如，Cantu et al.,Protein Science,2010,19,1281–1295；Zhuang et al.,Biochemistry,2008,47(9),2789–2796；或Naggert et al.,J.Biol.Chem.,1991,266(17),11044–11050)的基因產(chǎn)物酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的末端羧基基團(tuán)。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)CoA-轉(zhuǎn)移酶諸如戊烯二酸CoA-轉(zhuǎn)移酶(例如，在EC 2.8.3.12下分類，諸如來(lái)自發(fā)酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans))酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的第二末端羧基基團(tuán)。參見(jiàn)例如，Buckel et al.,1981,Eur.J.Biochem.,118:315–321。圖4。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)可逆的CoA-連接酶諸如琥珀酸-CoA連接酶(例如，在EC 6.2.1.5下分類，諸如來(lái)自Thermococcus kodakaraensis))酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的第二末端羧基基團(tuán)。參見(jiàn)例如，Shikata et al.,2007,J.Biol.Chem.,282(37):26963–26970。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在EC 3.1.2.-分類的?；?[acp]硫酯酶，諸如短乳桿菌(GenBank登錄號(hào)ABJ63754.1,SEQ ID NO:9)或來(lái)自植物乳桿菌(GenBank登錄號(hào)CCC78182.1,SEQ ID NO:10)的?；?[acp]硫酯酶酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的第二末端羧基基團(tuán)。此類酰基-[acp]硫酯酶具有C6–C8鏈長(zhǎng)度特異性(參見(jiàn)例如，Jing et al.,2011,BMC Biochemistry,12(44))。參見(jiàn)例如圖4。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)醛脫氫酶，例如，在EC 1.2.1.3下分類的醛脫氫酶(參見(jiàn)Guerrillot&Vandecasteele,Eur.J.Biochem.,1977,81,185–192)酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的第二末端羧基基團(tuán)。參見(jiàn)圖4。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在EC 1.2.1.-下分類的醛脫氫酶，諸如戊二酸半醛脫氫酶(例如，在EC 1.2.1.20下分類)，琥珀酸-半醛脫氫酶(例如，在EC1.2.1.16或EC 1.2.1.79下分類)，或EC 1.2.1.3下分類的醛脫氫酶酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的第二末端羧基基團(tuán)。例如，EC 1.2.1.-下分類的醛脫氫酶可以是5-氧戊酸脫氫酶諸如CpnE的基因產(chǎn)物、6-氧己酸脫氫酶(例如來(lái)自不動(dòng)細(xì)菌屬物種(Acinetobacter sp.)的ChnE的基因產(chǎn)物)，或7-氧代庚酸(7-oxoheptanoate)脫氫酶(例如，來(lái)自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因產(chǎn)物)(Iwaki et al.,Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158–5162；López-Sánchez et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2010,76(1),110-118)。例如，6-氧己酸脫氫酶可以在EC 1.2.1.63下分類，諸如ChnE的基因產(chǎn)物。例如，7-氧代庚酸脫氫酶可以在EC 1.2.1.-下分類。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)具有酯酶活性的多肽諸如在EC 3.1.1.-，諸如EC 3.1.1.1或EC 3.1.1.6下分類的酯酶酶促形成導(dǎo)致戊二酸合成的第二末端羧基基團(tuán)。

在2,4-戊二烯?；?CoA的生物合成中產(chǎn)生末端羥基基團(tuán)的酶

如圖5中描繪，可以使用醇脫氫酶諸如6-羥基己酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶、或4-羥基丁酸脫氫酶酶促形成末端羥基基團(tuán)。

例如，可以通過(guò)脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-下分類的脫氫酶，諸如6-羥基己酸脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.258下分類的6-羥基己酸脫氫酶(例如來(lái)自ChnD的基因)，5-羥基戊酸脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-下分類的5-羥基戊酸脫氫酶，諸如CpnD的基因產(chǎn)物(參見(jiàn)例如，Iwaki et al.,2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，來(lái)自Clostridium viride的5-羥基戊酸脫氫酶，或4-羥基丁酸脫氫酶諸如gabD(參加例如，Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMS Microbiology Letters,181(1):63–71)酶促形成導(dǎo)致5-羥基戊酸的末端羥基基團(tuán)。參見(jiàn)圖5。

在生物合成2,4-戊二烯?；?CoA中產(chǎn)生末端乙烯基基團(tuán)的酶

如圖6中描繪，可以使用脫水酶諸如來(lái)自Clostridium viride的5-羥基戊?；?羥基pentanoyl)-CoA脫水酶(Eikmanns and Buckel,1991,Eur.J.Biochem.,197,661-668)酶促形成末端乙烯基基團(tuán)。

生物化學(xué)途徑

從丙二?；?[acp]或丙二?；?CoA至戊二酸甲酯、戊二?；?CoA或戊二?；?[acp]的途徑

如圖1中顯示，可以如下從丙二?；?[acp]合成戊二酸甲酯：通過(guò)丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶，例如，在EC 2.1.1.197下分類的丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶，諸如bioC的基因產(chǎn)物將丙二?；?[acp]轉(zhuǎn)化成丙二酰基-[acp]甲酯；接著通過(guò)用丙二?；?[acp]和β-酮酰基-[acp]合酶，例如，在EC 2.3.1.-諸如EC2.3.1.41、EC 2.3.1.179或EC 2.3.1.180下分類(例如fabB,fabFor fabH的基因產(chǎn)物)縮合轉(zhuǎn)化成3-氧戊二酰基-[acp]甲酯(3-oxoglutaryl-[acp]methyl ester)；接著通過(guò)3-羥基酰基-CoA脫氫酶，例如在EC 1.1.1.-諸如EC 1.1.1.100下分類(例如fabG的基因產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化成3-羥基-戊二?；?[acp]甲酯；接著通過(guò)3-羥基?；?[acp]脫水酶，例如在EC 4.2.1.59下分類，諸如fabZ的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成2,3-脫氫戊二酰基-[acp]甲酯；接著通過(guò)反-2-烯酰基-CoA還原酶(trans-2-enoyl-CoA reductase)，例如，在EC 1.3.1.-諸如EC 1.3.1.10下分類，諸如fabI的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成戊二?；?[acp]甲酯；接著(i)通過(guò)硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分類，諸如tesB(SEQ ID NO:17)，YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)?；?ACP硫酯酶(GenBank登錄號(hào)AAO77182)或植物乳桿菌?；?CoA硫酯酶(GenBank登錄號(hào)CCC78182.1)轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯或(ii)通過(guò)庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶，例如，在EC 3.1.1.85下分類，諸如bioH(SEQ ID NO:1)轉(zhuǎn)化成戊二?；?[acp]。

如圖2中顯示，可以如下從丙二?；?CoA合成戊二酸甲酯：通過(guò)丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶，例如，在EC 2.1.1.197下分類，諸如bioC的基因產(chǎn)物將丙二?；?CoA轉(zhuǎn)化成丙二?；?CoA甲酯；接著通過(guò)β-酮硫解酶，例如，在EC 2.3.1.16下分類，諸如bktB的基因產(chǎn)物與乙?；?CoA縮合或者通過(guò)β-酮酰基-[acp]合酶，例如，在EC 2.3.1.180下分類，諸如fabH的基因產(chǎn)物與丙二酰基-CoA縮合轉(zhuǎn)化成3-氧戊二?；?CoA甲酯；接著通過(guò)3-羥基酰基-CoA脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-諸如EC 1.1.1.100(例如fabG的基因產(chǎn)物)或EC 1.1.1.36(例如phaB的基因產(chǎn)物)下分類轉(zhuǎn)化成3-羥基-戊二?；?CoA甲酯；接著通過(guò)烯?；?CoA水合酶，例如，在EC 4.2.1.119下分類，諸如phaJ的基因產(chǎn)物(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915；Fukui et al.,Journal of Bacteriology,1998,180(3),667–673)轉(zhuǎn)化成2,3-脫氫戊二酰基-CoA甲酯；接著通過(guò)反-2-烯?；?CoA還原酶，例如，在EC 1.3.1.-諸如EC 1.3.1.38，EC 1.3.1.8，EC 1.3.1.10或EC 1.3.1.44下分類轉(zhuǎn)化成戊二?；?CoA甲酯；接著(i)通過(guò)硫酯酶，例如在EC 3.1.2.-下分類，諸如tesB(SEQ ID NO:17)，YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形擬桿菌?；?ACP硫酯酶(GenBank登錄號(hào)AAO77182)或植物乳桿菌?；?ACP硫酯酶(GenBank登錄號(hào)CCC78182.1)轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯或者(ii)通過(guò)庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶，例如，在EC 3.1.1.85下分類，諸如bioH(SEQ ID NO:1)轉(zhuǎn)化成戊二?；?CoA。

如圖3中顯示，可以如下從丙二酰基-CoA合成戊二酸甲酯：通過(guò)丙二?；?CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶，例如，在EC 2.1.1.197下分類，諸如bioC的基因產(chǎn)物將丙二酰基-CoA轉(zhuǎn)化成丙二?；?CoA甲酯；接著通過(guò)β-酮硫解酶，例如，在EC 2.3.1.16下分類，諸如bktB的基因產(chǎn)物與乙酰基-CoA縮合或者通過(guò)β-酮酰基-[acp]合酶，例如，在EC 2.3.1.180下分類，諸如fabH的基因產(chǎn)物與丙二?；?CoA縮合轉(zhuǎn)化成3-氧戊二?；?CoA甲酯；接著通過(guò)3-羥基?；?CoA脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-諸如EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.157下分類(例如fadB或hbd的基因產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化成3-羥基-戊二酰基-CoA甲酯；接著conversion to 2,3-dehydro戊二酰基-CoA甲酯通過(guò)烯?；?CoA水合酶，例如，在EC 4.2.1.17下分類，諸如crt的基因產(chǎn)物；接著通過(guò)反-2-烯酰基-CoA還原酶，例如，在EC 1.3.1.44下分類，諸如ter或tdter的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成戊二酰基-CoA甲酯；接著(i)通過(guò)硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分類，諸如tesB(SEQ ID NO:17)，YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形擬桿菌?；?ACP硫酯酶(GenBank登錄號(hào)AAO77182)或植物乳桿菌酰基-CoA硫酯酶(GenBank登錄號(hào)CCC78182.1)轉(zhuǎn)化成戊二酸甲酯或(ii)通過(guò)庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶，例如，在EC 3.1.1.85下分類，諸如bioH(SEQ ID NO:1)轉(zhuǎn)化成戊二酰基-CoA。

使用戊二酸甲酯、戊二?；?[acp]或戊二酰基-CoA作為中心前體至戊二酸或5-氧戊酸的途徑

如圖4中描繪，可以通過(guò)酯酶，例如在EC 3.1.1.-，諸如EC 3.1.1.1或EC 3.1.1.6下分類，諸如estC(SEQ ID NO:8)將戊二酸甲酯轉(zhuǎn)化成戊二酸。

如圖4中描繪，可以將戊二?；?CoA轉(zhuǎn)化成戊二酸，其通過(guò)(i)硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分類，諸如tesB(SEQ ID NO:17)、YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13、多形擬桿菌?；?ACP硫酯酶(GenBank登錄號(hào)AAO77182)或植物乳桿菌?；?CoA硫酯酶(GenBank登錄號(hào)CCC78182.1)(ii)可逆的CoA-連接酶，例如，在EC 6.2.1.5下分類，(iii)CoA-轉(zhuǎn)移酶，例如，在EC 2.8.3.-，諸如EC 2.8.3.12下分類，或者(iv)?；摎涿福纾贓C 1.2.1.10或EC 1.2.1.76下分類，諸如由PduB或PduP編碼，和EC 1.2.1.-下分類的醛脫氫酶，諸如戊二酸半醛脫氫酶，例如，在EC 1.2.1.20下分類，琥珀酸-半醛脫氫酶，例如，在EC 1.2.1.16或EC 1.2.1.79下分類，或醛脫氫酶，在EC 1.2.1.3下分類進(jìn)行。例如，5-氧戊酸(oxovalerate)脫氫酶諸如CpnE的基因產(chǎn)物，6-氧己酸脫氫酶諸如ChnE的基因產(chǎn)物，或7-氧庚酸脫氫酶(例如來(lái)自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因產(chǎn)物)可用于將5-氧戊酸轉(zhuǎn)化成戊二酸。

如圖4中描繪，可以通過(guò)硫酯酶，例如，在EC 3.1.2.-下分類，諸如tesB(SEQ ID NO:17)、YciA(SEQ ID NO:16)或Acot13，多形擬桿菌?；?ACP硫酯酶(GenBank登錄號(hào)AAO77182)或植物乳桿菌?；?CoA硫酯酶(GenBank登錄號(hào)CCC78182.1)將戊二?；?[acp]轉(zhuǎn)化成戊二酸。

使用戊二酸甲酯作為中心前體至5-羥基戊酸的途徑

如圖5中描繪，可以如下從中心前體戊二酸甲酯合成5-羥基戊酸：通過(guò)酯酶，在EC 3.1.1.-下分類(例如estC的基因產(chǎn)物)，諸如EC 3.1.1.1下分類的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分類的乙?；ッ笇⑽於峒柞マD(zhuǎn)化成戊二酸；接著通過(guò)羧酸還原酶，例如，在EC 1.2.99.6下分類，諸如car的基因產(chǎn)物組合磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑(例如由來(lái)自枯草芽孢桿菌的sfp(Genbank登錄號(hào)CAA44858.1,SEQ ID NO:16)基因或來(lái)自諾卡氏菌的npt(Genbank登錄號(hào)ABI83656.1,SEQ ID NO:17)基因編碼)，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)將戊二酸轉(zhuǎn)化成戊二酸半醛；接著通過(guò)脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-下分類，諸如6-羥基己酸脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.258下分類(例如來(lái)自ChnD的基因)、5-羥基戊酸脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-下分類，諸如CpnD的基因產(chǎn)物(參見(jiàn)例如，Iwaki et al.,2002,Appl.Environ.Microbiol.,68(11):5671–5684)，或4-羥基丁酸脫氫酶諸如gabD(參見(jiàn)例如，Lütke-Eversloh&Steinbüchel,1999,FEMS Microbiology Letters,181(1):63–71)轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。參見(jiàn)圖5。

如圖5中描繪的，可以如下從中心前體戊二酸甲酯合成5-羥基戊酸：其通過(guò)羧酸還原酶，例如，在EC 1.2.99.6下分類，諸如來(lái)自海分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，恥垢分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，馬賽分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，組合磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑(例如由來(lái)自枯草芽孢桿菌的sfp(Genbank登錄號(hào)CAA44858.1,SEQ ID NO:16)基因或來(lái)自諾卡氏菌的npt(Genbank登錄號(hào)ABI83656.1,SEQ ID NO:17)基因編碼)，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)將戊二酸甲酯轉(zhuǎn)化成戊二酸半醛甲酯；接著通過(guò)EC 3.1.1.-下分類的酯酶(例如estC的基因產(chǎn)物)，諸如EC 3.1.1.1下分類的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分類的乙?；ッ皋D(zhuǎn)化成戊二酸半醛；接著通過(guò)脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-下分類，諸如6-羥基己酸脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.258下分類(例如來(lái)自ChnD的基因)，5-羥基戊酸脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-下分類，諸如CpnD的基因產(chǎn)物，或4-羥基丁酸脫氫酶諸如gabD轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。

如圖5中描繪，可以如下從中心前體戊二酸甲酯合成5-羥基戊酸：通過(guò)羧酸還原酶，例如，在EC 1.2.99.6下分類，諸如來(lái)自海分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ACC40567.1,SEQ ID NO:2)，恥垢分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ABK71854.1,SEQ ID NO:3)，馬賽分枝桿菌(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)EIV11143.1,SEQ ID NO:6)，或Segniliparus rotundus(參見(jiàn)Genbank登錄號(hào)ADG98140.1,SEQ ID NO:7)，組合磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)劑(例如由來(lái)自枯草芽孢桿菌的sfp(Genbank登錄號(hào)CAA44858.1,SEQ ID NO:14)基因或來(lái)自諾卡氏菌的npt(Genbank登錄號(hào)ABI83656.1,SEQ ID NO:15)基因編碼)，或GriC&GriD的基因產(chǎn)物(Suzuki et al.,J.Antibiot.,2007,60(6),380–387)將戊二酸甲酯轉(zhuǎn)化成戊二酸半醛甲酯；接著通過(guò)醇脫氫酶，例如，在EC 1.1.1.-(例如EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、或EC 1.1.1.184)下分類，諸如YMR318C的基因產(chǎn)物、YqhD、或具有GenBank登錄號(hào)CAA81612.1的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成5-羥基戊酸甲酯；接著通過(guò)EC 3.1.1.-下分類的酯酶(例如estC的基因產(chǎn)物)諸如EC 3.1.1.1下分類的羧基酯酶或EC 3.1.1.6下分類的乙?；ッ皋D(zhuǎn)化成5-羥基戊酸。

使用5-羥基戊酸作為中心前體至2,4-戊二烯?；?CoA的途徑

如圖6中描繪，可以如下從5-羥基戊酸合成2,4-戊二烯酰基-CoA：通過(guò)5-羥基戊酸CoA-轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酸CoA-轉(zhuǎn)移酶，例如，在EC 2.8.3.-諸如EC 2.8.3.14或EC 2.8.3.9下分類或者通過(guò)合酶，例如，在EC 6.2.1.-下分類，諸如EC 6.2.1.36下分類的3-羥基丙?；?CoA合酶將5-羥基戊酸轉(zhuǎn)化成5-羥基戊?；?CoA；接著通過(guò)脫水酶諸如5-羥基戊?；?CoA脫水酶，例如，在EC 4.2.1.-下分類(獲自Clostridium viride)轉(zhuǎn)化成2,4-戊二烯酰基-CoA。

培養(yǎng)策略

在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)策略需要實(shí)現(xiàn)需氧、厭氧、微需氧、或混合氧/反硝化培養(yǎng)條件。體外表征為氧敏感性的酶需要維持極低溶解氧濃度的微需氧培養(yǎng)策略(參見(jiàn)例如，Chayabatra&Lu-Kwang,Appl.Environ.Microbiol.,2000,66(2),493 0 498；Wilson and Bouwer,1997,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,18(2-3),116-130)。

在一些實(shí)施方案中，循環(huán)培養(yǎng)策略需要在實(shí)現(xiàn)厭氧培養(yǎng)條件和實(shí)現(xiàn)有氧培養(yǎng)條件之間交替。

在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)策略需要營(yíng)養(yǎng)限制，如氮，磷酸鹽或氧限制。

在一些實(shí)施方案中，可以利用除了氧外的最終電子受體諸如硝酸鹽。在一些實(shí)施方案中，可以采用使用例如陶瓷膜的細(xì)胞保留策略來(lái)實(shí)現(xiàn)并維持補(bǔ)料分批或連續(xù)發(fā)酵期間的高細(xì)胞密度。

在一些實(shí)施方案中，在一種或多種C5構(gòu)件塊合成中對(duì)發(fā)酵補(bǔ)料的主要碳源可以源自生物或非生物原料。

在一些實(shí)施方案中，所述生物原料可以是或可以源自單糖，二糖，木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃縮酒糟(condensed distillers'solubles)或城市廢物。

已經(jīng)在幾種微生物(諸如大腸桿菌、鉤蟲(chóng)貪銅菌、食油假單胞菌、惡臭假單胞菌和解脂耶羅維亞酵母)中證明了源自生物柴油生產(chǎn)的粗制甘油的有效分解代謝(Lee et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,2012,166:1801–1813；Yang et al.,Biotechnology for Biofuels,2012,5:13；Meijnen et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,90:885-893)。

已經(jīng)在幾種生物體(諸如鉤蟲(chóng)貪銅菌和惡臭假單胞菌)中在經(jīng)由前體丙?；?CoA至3-羥基戊酸的合成中證明了木質(zhì)纖維素衍生的乙酰丙酸的有效分解代謝(Jaremko and Yu,2011,supra；Martin and Prather,J.Biotechnol.,2009,139:61–67)。

已經(jīng)在幾種微生物(諸如惡臭假單胞菌、鉤蟲(chóng)貪銅菌)中證明了木質(zhì)素衍生的芳香族化合物諸如苯甲酸類似物的有效分解代謝(Bugg et al.,Current Opinion in Biotechnology,2011,22,394–400；Pérez-Pantoja et al.,FEMS Microbiol.Rev.,2008,32,736–794)。

已經(jīng)在幾種微生物(包括解脂耶羅維亞酵母)中證明了農(nóng)業(yè)廢物(諸如橄欖磨坊廢水)的有效利用(Papanikolaou et al.,Bioresour.Technol.,2008,99(7):2419-2428).

已經(jīng)針對(duì)幾種微生物(諸如大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和德氏乳桿菌和乳酸乳球菌)證明了可發(fā)酵糖類(諸如源自纖維素、半纖維素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它農(nóng)業(yè)來(lái)源的單糖和二糖)的有效利用(參見(jiàn)，例如Hermann et al,J.Biotechnol.,2003,104:155–172；Wee et al.,Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2):163–172；Ohashi et al.,J.Bioscience and Bioengineering,1999,87(5):647-654)。

已經(jīng)針對(duì)鉤蟲(chóng)貪銅菌證明了源自多種農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維素來(lái)源的糠醛的有效利用(Li et al.,Biodegradation,2011,22:1215–1225).

在一些實(shí)施方案中，所述非生物原料可以是或可以源自天然氣、合成氣、CO₂/H₂、甲醇、乙醇、苯甲酸鹽、非揮發(fā)性殘留物(NVR)或來(lái)自環(huán)己烷氧化過(guò)程的堿洗液(caustic wash)廢物流、或?qū)Ρ蕉姿?異酞酸混合物廢物流。

已經(jīng)針對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母證明了甲醇的有效分解代謝。

已經(jīng)針對(duì)克魯佛梭菌證明了乙醇的有效分解代謝(Seedorf et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133).

已經(jīng)針對(duì)鉤蟲(chóng)貪銅菌證明了CO₂和H₂(其可以源自天然氣和其它化學(xué)和石油化學(xué)來(lái)源)的有效分解代謝(Prybylski et al.,Energy,Sustainability and Society,2012,2:11)。

已經(jīng)針對(duì)多種微生物(諸如楊氏梭菌和自產(chǎn)乙醇梭菌)證明了合成氣的有效分解代謝(et al.,Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15):5467–5475)。

已經(jīng)針對(duì)多種微生物(諸如食酸代爾夫特菌和鉤蟲(chóng)貪銅菌)證明了來(lái)自環(huán)己烷過(guò)程的非揮發(fā)性殘留物廢物流的有效分解代謝(Ramsay et al.,Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1):152–156)。

代謝工程

本文件提供方法，所述方法涉及少于針對(duì)所有上述途徑描述的所有步驟的步驟。這種方法可涉及例如此類步驟中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多個(gè)。在這種方法包含少于所有步驟的情況下，第一個(gè)，且在一些實(shí)施方案中唯一的步驟可為所列步驟中的任何步驟。

此外，本文中描述的重組宿主可以包括上述酶中的任何組合，使得所述步驟中的一個(gè)或者多個(gè)，例如此類步驟中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多個(gè)可以在重組宿主內(nèi)實(shí)施。本文件提供所列出的和遺傳工程化以表達(dá)本文件中列舉的任何酶的一種或者多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多種)重組形式的任何屬和種的宿主細(xì)胞。如此，例如，宿主細(xì)胞可含有外源核酸，其編碼催化本文中描述的任何途徑的一個(gè)或者多個(gè)步驟的酶。

另外，本文件認(rèn)識(shí)到，在酶已經(jīng)被描述為接受CoA活化的底物的情況下，存在與[acp]結(jié)合底物相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。

此外，本文件認(rèn)識(shí)到，在酶已經(jīng)被描述為接受底物的(R)-對(duì)映異構(gòu)體的情況下，存在與底物的(S)-對(duì)映異構(gòu)體相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。

本文件還認(rèn)識(shí)到，在已經(jīng)顯示酶接受特定輔因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情況下，許多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同輔因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件認(rèn)識(shí)到，在酶對(duì)例如特定輔助因子如NADH具有高特異性的情況下，對(duì)輔助因子NADPH具有高特異性的具有相似或者相同活性的酶可為不同的酶種類。

在一些實(shí)施方案中，本文中概述的途徑中的酶是經(jīng)由非直接或者合理酶設(shè)計(jì)方法的酶工程的結(jié)果，目的在于改善活性、改善特異性、降低反饋抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改變立體特異性，或者改變輔助因子特異性。

在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由附加型或者染色體整合方法將本文概述的途徑中的酶基因投入(gene dose)至所得的遺傳修飾的生物體中(即，過(guò)表達(dá))。

在一些實(shí)施方案中，可以利用基因組級(jí)別(genome-scale)系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)如通量平衡分析來(lái)設(shè)計(jì)用于將碳流量引導(dǎo)至2,4-戊二烯?；?CoA的基因組級(jí)別的弱化或者敲除策略。

弱化策略包括但不限于使用轉(zhuǎn)座子、同源重組(雙交叉方法)、誘變、酶抑制劑和RNAi干擾。

在一些實(shí)施方案中，可以利用通量組(fluxomic)、代謝物組(metabolomic)和轉(zhuǎn)錄物組(transcriptomal)數(shù)據(jù)來(lái)告知或者支持基因組級(jí)別的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，由此在將碳流量導(dǎo)向2,4-戊二烯?；?CoA的過(guò)程中設(shè)計(jì)基因組級(jí)別的弱化或者敲除策略。

在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由在選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)改善宿主微生物對(duì)高濃度的2,4-戊二烯酰基-CoA的耐受性。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化或提升宿主微生物的內(nèi)源生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以(1)確保乙?；?CoA的胞內(nèi)利用度，(2)產(chǎn)生NADH或NADPH不平衡，其可以經(jīng)由2,4-戊二烯?；?CoA的形成來(lái)平衡，和/或(3)防止所導(dǎo)致的并且包括2,4-戊二烯酰基-CoA的中心代謝物，中心前體的降解。

在需要乙?；?CoA-CoA的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行C5構(gòu)件塊合成的一些實(shí)施方案中，可以在宿主生物體中弱化催化水解乙酰基-CoA的內(nèi)源酶諸如短鏈長(zhǎng)度硫酯酶。

在需要縮合乙?；?CoA和丙二?；?CoA以進(jìn)行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以弱化催化將僅乙?；?CoA縮合成乙酰乙?；?CoA的一種或多種內(nèi)源β-酮硫解酶，諸如AtoB或phaA的內(nèi)源基因產(chǎn)物。

在需要乙?；?CoA的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以弱化產(chǎn)生乙酸的內(nèi)源磷酸乙酸轉(zhuǎn)移酶，諸如pta(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。

在需要乙酰基-CoA的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行2,4-戊二烯?；?CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以弱化編碼乙酸激酶的乙酸合成途徑中的內(nèi)源基因，諸如ack。

在需要乙?；?CoA和NADH的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行2,4-戊二烯?；?CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以弱化編碼催化丙酮酸降解成乳酸的酶的內(nèi)源基因，諸如由ldhA編碼的乳酸脫氫酶(Shen et al.,2011,見(jiàn)上文)。

在需要乙?；?CoA和NADH的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行2,4-戊二烯?；?CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以弱化編碼將磷酸烯醇式丙酮酸降解成琥珀酸的酶，諸如menaquinol-延胡索酸氧化還原酶的內(nèi)源基因，諸如frdBC(參見(jiàn)，例如Shen et al.,2011,見(jiàn)上文)。

在需要乙?；?CoA和NADH的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行2,4-戊二烯酰基-CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以弱化編碼催化將乙?；?CoA降解成乙醇的酶，諸如由adhE編碼的醇脫氫酶的內(nèi)源基因(Shen et al.,2011,見(jiàn)上文)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑需要過(guò)量的NADH輔因子來(lái)進(jìn)行2,4-戊二烯?；?CoA合成的情況下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)重組甲酸脫氫酶基因(Shen et al.,2011,見(jiàn)上文)。

在一些實(shí)施方案中，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)乙?；?CoA羧化酶。

在一些實(shí)施方案中，可以在宿主中過(guò)表達(dá)3-磷酸甘油酸脫氫酶，3-磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和磷酸絲氨酸磷酸酶中的一種或多種以產(chǎn)生作為S-腺苷-L-甲硫氨酸循環(huán)的甲基供體的絲氨酸。

在一些實(shí)施方案中，可以在宿主中過(guò)表達(dá)甲醇脫氫酶或甲醛脫氫酶以允許經(jīng)由甲酸的甲醇分解代謝。

在一些實(shí)施方案中，在途徑需要過(guò)量的NADH或NADPH輔因子進(jìn)行2,4-戊二烯?；?CoA合成的情況下，可以弱化消散輔因子不平衡的轉(zhuǎn)氫酶。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化編碼催化將丙酮酸降解成乙醇的酶，諸如丙酮酸脫氫酶的內(nèi)源基因。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化編碼催化產(chǎn)生異丁醇的酶，諸如2-酮酸脫羧酶的內(nèi)源基因。

在需要乙酰基-CoA的胞內(nèi)利用度以進(jìn)行2,4-戊二烯?；?CoA合成的一些實(shí)施方案中，可以在微生物中過(guò)表達(dá)重組乙?；?CoA合成酶，諸如acs的基因產(chǎn)物(Satoh et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。

在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)弱化內(nèi)源葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.9)將碳流量定向到戊糖磷酸循環(huán)中以提高NADPH的供應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)過(guò)表達(dá)6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和/或轉(zhuǎn)酮醇酶將碳流量重定向到戊糖磷酸循環(huán)中以提高NADPH的供應(yīng)(Lee et al.,2003,Biotechnology Progress,19(5),1444–1449)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成2,4-戊二烯?；?CoA中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)基因諸如編碼吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的UdhA(Brigham et al.,Advanced Biofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39,1065-1090)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)重組甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因諸如GapN(Brigham et al.,2012,見(jiàn)上文)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成2,4-戊二烯?；?CoA中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況中，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)重組蘋(píng)果酸酶(malic enzyme)基因諸如maeA或maeB(Brigham et al.,2012,見(jiàn)上文)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成2,4-戊二烯?；?CoA中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)重組葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因諸如zwf(Lim et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543-549)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)重組果糖1,6二磷酸酶基因諸如fbp(Becker et al.,J.Biotechnol.,2007,132:99-109)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成C5構(gòu)件塊中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況下，可以弱化內(nèi)源丙糖磷酸異構(gòu)酶(EC 5.3.1.1)。

在一些實(shí)施方案中，在途徑中在合成2,4-戊二烯酰基-CoA中需要過(guò)量的NADPH輔因子的情況下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)重組葡萄糖脫氫酶諸如gdh的基因產(chǎn)物(Satoh et al.,J.Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335–341)。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化促進(jìn)NADPH轉(zhuǎn)化成NADH的內(nèi)源酶，所述轉(zhuǎn)化諸如NADH產(chǎn)生循環(huán)，其可以經(jīng)由EC 1.4.1.2(NADH-特異性)和EC1.4.1.4(NADPH-特異性)下分類的谷氨酸脫氫酶的互變產(chǎn)生。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化利用NADH和NADPH兩者作為輔因子的內(nèi)源谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.3)。

在一些實(shí)施方案中，可以經(jīng)由與小的可溶性蛋白質(zhì)，諸如麥芽糖結(jié)合蛋白形成的融合蛋白表達(dá)溶解膜結(jié)合烯?；?CoA還原酶(Gloerich et al.,FEBS Letters,2006,580,2092–2096)。

在使用天然積累聚羥基鏈烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)的宿主的一些實(shí)施方案中，可以在宿主菌株中弱化酶內(nèi)源聚羥基鏈烷酸酯合酶。

在使用天然積累脂質(zhì)體的宿主的一些實(shí)施方案中，弱化編碼涉及脂質(zhì)體合成的酶的基因。

在一些實(shí)施方案中，可以在宿主中過(guò)表達(dá)L-谷氨酸脫氫酶、L-谷氨酸合成酶、或谷氨酸合酶以從作為氨基供體的2-酮戊二酸再生L-谷氨酸，用于ω-轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化酶諸如EC 1.3.1.62下分類的庚二?；?CoA脫氫酶；?；?CoA脫氫酶，例如，在EC 1.3.8.7或EC 1.3.8.1下分類；和/或戊二酰基-CoA脫氫酶，例如，在EC 1.3.8.6下分類的戊二?；?CoA脫氫酶，其降解所導(dǎo)致的并且包括C5構(gòu)件塊的中心代謝物和中心前體。

在一些實(shí)施方案中，可以弱化經(jīng)由輔酶A酯化活化C5構(gòu)件塊的內(nèi)源酶，諸如例如，EC 6.2.1.6下分類的CoA-連接酶(例如戊二?；?CoA合成酶)。

使用重組宿主產(chǎn)生2,4-戊二烯?；?CoA

通常，可以通過(guò)提供宿主微生物，并且用含有如上文描述的合適的碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)提供的微生物生成2,4-戊二烯?；?CoA。一般地，培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)可以使得微生物生長(zhǎng)到足夠的密度并且有效產(chǎn)生2,4-戊二烯?；?CoA。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程，可以使用任何方法，諸如別處描述的(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,2nd Edition,Editors:A.L.Demain and J.E.Davies,ASM Press；和Principles of Fermentation Technology,P.F.Stanbury and A.Whitaker,Pergamon)。簡(jiǎn)言之，用特定微生物接種含有合適的培養(yǎng)基的大罐(例如，100加侖、200加侖、500加侖、或更多的罐)。在接種后，培養(yǎng)微生物以容許產(chǎn)生生物量。一旦達(dá)到期望的生物量，可以將含有微生物的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到第二個(gè)罐。此第二個(gè)罐可以是任何大小。例如，第二個(gè)罐可以是較大的，較小的，或者與第一個(gè)罐相同大小的。通常，第二個(gè)罐大于第一個(gè)，使得可以對(duì)來(lái)自第一個(gè)罐的培養(yǎng)基添加額外的培養(yǎng)基。另外，此第二個(gè)罐內(nèi)的培養(yǎng)基可以與第一個(gè)罐中使用的培養(yǎng)基相同或不同。

一旦轉(zhuǎn)移，可以培養(yǎng)微生物以允許生成2,4-戊二烯酰基-CoA。一旦生成，可以使用任何方法從2,4-戊二烯?；?CoA生成1,3-丁二烯，諸如圖7中描述。本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不限制權(quán)利要求書(shū)中描述的本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1

使用戊二酸甲酯作為底物并且形成戊二酸半醛甲酯的羧酸還原酶的酶活性

將編碼His-標(biāo)簽的核苷酸序列添加到分別編碼SEQ ID NO:2-4，和7的羧酸還原酶(分別為GenBank登錄號(hào)ACC40567.1，ABK71854.1，EIV11143.1，和ADG98140.1)的來(lái)自海分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、Segniliparus rugosus、馬賽分枝桿菌、和Segniliparus rotundus的基因(參見(jiàn)圖8)，使得可以生成N端加HIS標(biāo)簽的羧酸還原酶。將每個(gè)修飾的基因克隆到pET Duet表達(dá)載體中，在編碼來(lái)自枯草芽孢桿菌的加His標(biāo)簽的磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶的sfp基因旁，兩者都在T7啟動(dòng)子的控制下。與來(lái)自實(shí)施例2的表達(dá)載體一起將每種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21[DE3]大腸桿菌宿主中。在以230rpm搖動(dòng)的情況下，在含有50mL LB培養(yǎng)基和抗生素選擇壓力下的250mL燒瓶培養(yǎng)物中在37℃培養(yǎng)每種所得的重組大腸桿菌菌株。在37℃使用自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物過(guò)夜。

經(jīng)由離心收獲來(lái)自每種誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的團(tuán)粒。重懸每種團(tuán)粒，并且經(jīng)由超聲處理裂解。經(jīng)由離心分開(kāi)細(xì)胞碎片與上清液。使用Ni親和層析從上清液中純化羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，以10倍稀釋到50mM HEPES緩沖液(pH＝7.5)中，并且經(jīng)由超濾濃縮。

酶活性測(cè)定在由最終濃度為50mM HEPES緩沖液(pH＝7.5)，2mM戊二酸甲酯，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH組成的緩沖液中一式三份進(jìn)行。通過(guò)向含有戊二酸甲酯的測(cè)定緩沖液中加入純化的羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶或空載體對(duì)照，然后在室溫下溫育20分鐘來(lái)啟動(dòng)酶活性測(cè)定反應(yīng)。通過(guò)340nm處的吸光度監(jiān)測(cè)NADPH的消耗。沒(méi)有戊二酸甲酯的僅酶的對(duì)照證明NADPH的低基線消耗。參見(jiàn)圖9。

通過(guò)sfp的基因產(chǎn)物增強(qiáng)的SEQ ID NO 2-4和7的基因產(chǎn)物接受戊二酸甲酯作為底物，如針對(duì)空載體對(duì)照(參見(jiàn)圖10)和合成的戊二酸半醛甲酯確認(rèn)的。

實(shí)施例2

使用戊二酰基-CoA甲酯作為底物并且形成戊二?；?CoA的庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶的酶活性

將編碼C末端的加His-標(biāo)簽的序列添加到編碼SEQ ID NO:1的庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶的來(lái)自大腸桿菌的基因(參見(jiàn)圖8)，使得可以產(chǎn)生C-末端加HIS標(biāo)簽的庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶。將得到的修飾基因克隆到在T7啟動(dòng)子控制下的pET28b+表達(dá)載體中，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21[DE3]大腸桿菌宿主中。將所得的重組大腸桿菌菌株在37℃下在含有100mL LB培養(yǎng)基和抗生素選擇壓力下的500mL搖瓶培養(yǎng)中在230rpm振蕩下培養(yǎng)。每種培養(yǎng)物在18℃下使用0.3mM IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜。

通過(guò)離心收集來(lái)自每個(gè)誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的沉淀。將每個(gè)沉淀重懸并通過(guò)超聲處理裂解。通過(guò)離心分開(kāi)細(xì)胞碎片與上清液。使用Ni親和層析從上清液純化庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶，緩沖液交換，通過(guò)超濾濃縮到20mM HEPES緩沖液(pH＝7.5)中，并在4℃貯存。

在由終濃度為25mM Tris·HCl緩沖液(pH＝7.0)和5[mM]戊二?；?CoA甲酯構(gòu)成的緩沖液中一式三份進(jìn)行將戊二?；?CoA甲酯轉(zhuǎn)化為戊二酰基-CoA的酶活性測(cè)定。通過(guò)向含有戊二酸基-CoA甲酯的測(cè)定緩沖液中加入庚二酰基-[acp]甲酯甲基酯酶至終濃度為10μM來(lái)啟動(dòng)酶活性測(cè)定反應(yīng)，并在30℃在250rpm振蕩下振蕩1小時(shí)。通過(guò)LC-MS定量戊二酰基-CoA的形成。

沒(méi)有酶的僅底物的對(duì)照沒(méi)有顯示痕量的底物戊二酰基-CoA。參見(jiàn)圖11。SEQ ID NO.1的庚二?；?[acp]甲酯甲基酯酶接受戊二酰基-CoA甲酯作為底物，并且合成戊二?；?CoA作為反應(yīng)產(chǎn)物，如經(jīng)由LC-MS確認(rèn)的。參見(jiàn)圖11。

其它實(shí)施方案

應(yīng)當(dāng)理解，雖然已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)描述描述了本發(fā)明，但是前面的描述旨在說(shuō)明而不是限制由所附權(quán)利要求書(shū)的范圍限定的本發(fā)明的范圍。其它方面，優(yōu)點(diǎn)和修改在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 英威達(dá)技術(shù)有限責(zé)任公司

<120>用于產(chǎn)生戊二酸和戊二酸甲酯的方法

<130> 35643-0056WO1

<150> US 62/012,722

<151> 2014-06-16

<150> US 62/012,586

<151> 2014-06-16

<160> 17

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 256

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 1

Met Asn Asn Ile Trp Trp Gln Thr Lys Gly Gln Gly Asn Val His Leu

1 5 10 15

Val Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ala Glu Val Trp Arg Cys Ile

20 25 30

Asp Glu Glu Leu Ser Ser His Phe Thr Leu His Leu Val Asp Leu Pro

35 40 45

Gly Phe Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Ala Leu Ser Leu Ala Asp Met

50 55 60

Ala Glu Ala Val Leu Gln Gln Ala Pro Asp Lys Ala Ile Trp Leu Gly

65 70 75 80

Trp Ser Leu Gly Gly Leu Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Thr His Pro

85 90 95

Glu Arg Val Gln Ala Leu Val Thr Val Ala Ser Ser Pro Cys Phe Ser

100 105 110

Ala Arg Asp Glu Trp Pro Gly Ile Lys Pro Asp Val Leu Ala Gly Phe

115 120 125

Gln Gln Gln Leu Ser Asp Asp Phe Gln Arg Thr Val Glu Arg Phe Leu

130 135 140

Ala Leu Gln Thr Met Gly Thr Glu Thr Ala Arg Gln Asp Ala Arg Ala

145 150 155 160

Leu Lys Lys Thr Val Leu Ala Leu Pro Met Pro Glu Val Asp Val Leu

165 170 175

Asn Gly Gly Leu Glu Ile Leu Lys Thr Val Asp Leu Arg Gln Pro Leu

180 185 190

Gln Asn Val Ser Met Pro Phe Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asp Gly

195 200 205

Leu Val Pro Arg Lys Val Val Pro Met Leu Asp Lys Leu Trp Pro His

210 215 220

Ser Glu Ser Tyr Ile Phe Ala Lys Ala Ala His Ala Pro Phe Ile Ser

225 230 235 240

His Pro Ala Glu Phe Cys His Leu Leu Val Ala Leu Lys Gln Arg Val

245 250 255

<210> 2

<211> 1174

<212> PRT

<213> 海分枝桿菌

<400> 2

Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala

20 25 30

Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile

35 40 45

Glu Thr Val Met Thr Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Ala Gln Arg

50 55 60

Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg

85 90 95

Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro

100 105 110

Gly Asp Arg Val Cys Leu Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr

115 120 125

Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln

130 135 140

Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln

145 150 155 160

Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu

165 170 175

Leu Ala Leu Ser Gly Gln Thr Ala Thr Arg Val Leu Val Phe Asp His

180 185 190

His Arg Gln Val Asp Ala His Arg Ala Ala Val Glu Ser Ala Arg Glu

195 200 205

Arg Leu Ala Gly Ser Ala Val Val Glu Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala

210 215 220

Arg Gly Asp Val Pro Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Thr

225 230 235 240

Asp Val Ser Asp Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr

260 265 270

Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile

275 280 285

Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Gln Ile Leu

290 295 300

Tyr Gly Thr Leu Cys Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser

305 310 315 320

Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu

325 330 335

Leu Thr Phe Val Pro Arg Val Trp Asp Met Val Phe Asp Glu Phe Gln

340 345 350

Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Asp Arg Val Ala Leu

355 360 365

Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu Ile Arg Asn Asp Val Leu Gly Gly Arg

370 375 380

Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Met Lys

385 390 395 400

Ala Trp Val Glu Glu Leu Leu Asp Met His Leu Val Glu Gly Tyr Gly

405 410 415

Ser Thr Glu Ala Gly Met Ile Leu Ile Asp Gly Ala Ile Arg Arg Pro

420 425 430

Ala Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe

435 440 445

Leu Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Val Lys Thr Asp

450 455 460

Ser Leu Phe Pro Gly Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Val Thr Ala Asp Val

465 470 475 480

Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Met Ala Glu Val

485 490 495

Gly Pro Glu Gln Phe Val Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys

500 505 510

Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ser Lys Leu Glu Ala Val Phe

515 520 525

Gly Asp Ser Pro Leu Val Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Ala

530 535 540

Arg Ala Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Gln Glu Ala Leu Asp

545 550 555 560

Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln

565 570 575

Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp

580 585 590

Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr

595 600 605

Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu

610 615 620

Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu

625 630 635 640

Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr

645 650 655

Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val

660 665 670

Gln Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala

675 680 685

Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro

690 695 700

Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp

705 710 715 720

Tyr Val Glu Ala Ala Arg Lys Pro Gly Ser Ser Arg Pro Thr Phe Ala

725 730 735

Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly

740 745 750

Asp Leu Ser Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Ala Thr Leu Ala Glu Ala

755 760 765

Pro Arg Leu Pro Ala Ala Asn Thr Gln Val Arg Thr Val Leu Leu Thr

770 775 780

Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu

785 790 795 800

Arg Met Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Cys Leu Val Arg Ala Lys

805 810 815

Ser Asp Thr Glu Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly

820 825 830

Asp Pro Glu Leu Leu Ala His Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp His Leu

835 840 845

Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asp Leu Gly Leu Asp Arg

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Pro Ala Val Ala Glu Gln Val Leu Arg Pro Gly Leu His Leu Ser Glu

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Ala Ile Ala Ala Leu Met Thr Gly Tyr Ala Glu Arg Pro Ala Leu Gly

50 55 60

Glu Arg Ala Arg Glu Leu Val Ile Asp Gln Asp Gly Arg Thr Thr Leu

65 70 75 80

Arg Leu Leu Pro Arg Phe Asp Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Leu Trp Ser

85 90 95

Arg Thr Thr Ser Val Ala Ala Ala Trp His His Asp Ala Thr His Pro

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Val Lys Ala Gly Asp Leu Val Ala Thr Leu Gly Phe Thr Ser Ile Asp

115 120 125

Tyr Thr Val Leu Asp Leu Ala Ile Met Ile Leu Gly Gly Val Ala Val

130 135 140

Pro Leu Gln Thr Ser Ala Pro Ala Ser Gln Trp Thr Thr Ile Leu Ala

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Glu Ala Glu Pro Asn Thr Leu Ala Val Ser Ile Glu Leu Ile Gly Ala

165 170 175

Ala Met Glu Ser Val Arg Ala Thr Pro Ser Ile Lys Gln Val Val Val

180 185 190

Phe Asp Tyr Thr Pro Glu Val Asp Asp Gln Arg Glu Ala Phe Glu Ala

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Ala Ser Thr Gln Leu Ala Gly Thr Gly Ile Ala Leu Glu Thr Leu Asp

210 215 220

Ala Val Ile Ala Arg Gly Ala Ala Leu Pro Ala Ala Pro Leu Tyr Ala

225 230 235 240

Pro Ser Ala Gly Asp Asp Pro Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly

245 250 255

Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met His Ser Glu Asn Ile Val Arg

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Arg Trp Trp Ile Arg Glu Asp Val Met Ala Gly Thr Glu Asn Leu Pro

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Met Ile Gly Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Ile Met Gly Arg Gly

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Ser Ser Asp Met Ser Thr Leu Phe Glu Asp Met Glu Leu Ile Arg Pro

325 330 335

Thr Ala Leu Ala Leu Val Pro Arg Val Cys Asp Met Val Phe Gln Arg

340 345 350

Phe Gln Thr Glu Val Asp Arg Arg Leu Ala Ser Gly Asp Thr Ala Ser

355 360 365

Ala Glu Ala Val Ala Ala Glu Val Lys Ala Asp Ile Arg Asp Asn Leu

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Phe Gly Gly Arg Val Ser Ala Val Met Val Gly Ser Ala Pro Leu Ser

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420 425 430

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435 440 445

Leu Gly Tyr Phe Ser Thr Asp Lys Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu

450 455 460

Leu Lys Thr Asp Gly Met Phe Leu Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Val

465 470 475 480

Thr Ala Ser Val Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Met Thr Gly Asp Ile

485 490 495

Val Ala Glu Leu Ala His Asp Asn Ile Glu Ile Ile Asp Arg Arg Asn

500 505 510

Asn Val Leu Lys Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Ala Val Ala Thr Leu

515 520 525

Glu Ala Glu Tyr Ala Asn Ser Pro Val Val His Gln Ile Tyr Val Tyr

530 535 540

Gly Ser Ser Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Ala Val Val Val Pro Thr Pro

545 550 555 560

Glu Ala Val Ala Ala Ala Lys Gly Asp Ala Ala Ala Leu Lys Thr Thr

565 570 575

Ile Ala Asp Ser Leu Gln Asp Ile Ala Lys Glu Ile Gln Leu Gln Ser

580 585 590

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Val Ser Ser Ala Glu Leu Ala Ala Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly

675 680 685

Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser Asp Leu Leu Arg Asp Ile

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Phe Ala Val Glu Val Pro Val Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Asp

705 710 715 720

Leu Gly Gly Val Ala Lys Phe Val Asp Glu Gln Arg His Ser Gly Gly

725 730 735

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Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Glu Ala Thr Leu

755 760 765

His Ala Ala Pro Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Ile Pro His Thr Val

770 775 780

Leu Leu Thr Gly Ser Asn Gly Tyr Leu Gly His Tyr Leu Ala Leu Glu

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Arg Gly Lys Asn Ala Glu Ala Ala Tyr Gly Arg Leu Glu Glu Ala Phe

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Asp Thr Gly Asp Thr Glu Leu Leu Ala His Phe Arg Ser Leu Ala Asp

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Lys His Leu Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu Gly

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865 870 875 880

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Asn Ala Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu

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980 985 990

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1075 1080 1085

Tyr Pro Ile Ala Arg Ile Asp Asn Tyr Thr Glu Trp Phe Thr Arg Phe

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Asp Thr Ala Ile Arg Gly Leu Ser Glu Lys Gln Lys Gln His Ser Leu

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Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Glu Gln Pro Ser Ala Ala Glu Asn His

1125 1130 1135

Gly Val Val Pro Ala Lys Arg Phe Gln His Ala Val Gln Ala Ala Gly

1140 1145 1150

Ile Gly Pro Val Gly Gln Asp Gly Thr Thr Asp Ile Pro His Leu Ser

1155 1160 1165

Arg Arg Leu Ile Val Lys Tyr Ala Lys Asp Leu Glu Gln Leu Gly Leu

1170 1175 1180

Leu

1185

<210> 7

<211> 1186

<212> PRT

<213> Segniliparus rotundus

<400> 7

Met Thr Gln Ser His Thr Gln Gly Pro Gln Ala Ser Ala Ala His Ser

1 5 10 15

Arg Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu Leu Leu Ala Thr Asp Pro Gln Ala

20 25 30

Ala Ala Thr Leu Pro Asp Pro Glu Val Val Arg Gln Ala Thr Arg Pro

35 40 45

Gly Leu Arg Leu Ala Glu Arg Val Asp Ala Ile Leu Ser Gly Tyr Ala

50 55 60

Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg Ser Phe Gln Thr Val Lys Asp Pro

65 70 75 80

Ile Thr Gly Arg Ser Ser Val Glu Leu Leu Pro Thr Phe Asp Thr Ile

85 90 95

Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Thr Ala Ile Ala Ser Asp Leu

100 105 110

Ala His His Pro Gln Ala Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Leu Ala Ser

115 120 125

Ile Gly Phe Ile Ser Val Asp Tyr Val Ala Ile Asp Ile Ala Gly Val

130 135 140

Phe Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro Leu Gln Thr Gly Ala Thr Leu Ala

145 150 155 160

Thr Leu Thr Ala Ile Thr Ala Glu Thr Ala Pro Thr Leu Phe Ala Ala

165 170 175

Ser Ile Glu His Leu Pro Thr Ala Val Asp Ala Val Leu Ala Thr Pro

180 185 190

Ser Val Arg Arg Leu Leu Val Phe Asp Tyr Arg Ala Gly Ser Asp Glu

195 200 205

Asp Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Arg Lys Ile Ala Asp Ala Gly

210 215 220

Ser Ser Val Leu Val Asp Val Leu Asp Glu Val Ile Ala Arg Gly Lys

225 230 235 240

Ser Ala Pro Lys Ala Pro Leu Pro Pro Ala Thr Asp Ala Gly Asp Asp

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys

260 265 270

Gly Ala Met Tyr Pro Glu Arg Asn Val Ala His Phe Trp Gly Gly Val

275 280 285

Trp Ala Ala Ala Phe Asp Glu Asp Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ile

290 295 300

Asn Ile Thr Phe Leu Pro Leu Ser His Val Ala Ser Arg Leu Ser Leu

305 310 315 320

Met Pro Thr Leu Ala Arg Gly Gly Leu Met His Phe Val Ala Lys Ser

325 330 335

Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Lys Leu Ala Arg Pro Thr Asn

340 345 350

Leu Phe Leu Val Pro Arg Val Val Glu Met Leu Tyr Gln His Tyr Gln

355 360 365

Ser Glu Leu Asp Arg Arg Gly Val Gln Asp Gly Thr Arg Glu Ala Glu

370 375 380

Ala Val Lys Asp Asp Leu Arg Thr Gly Leu Leu Gly Gly Arg Ile Leu

385 390 395 400

Thr Ala Gly Phe Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Leu Ala Gly Phe

405 410 415

Ile Glu Ser Leu Leu Gln Ile His Leu Val Asp Gly Tyr Gly Ser Thr

420 425 430

Glu Ala Gly Pro Val Trp Arg Asp Gly Tyr Leu Val Lys Pro Pro Val

435 440 445

Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr

450 455 460

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465 470 475 480

Leu Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Thr Thr Ala Glu Val Phe Asp

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Ala Tyr Ser Ser

530 535 540

Ser Pro Leu Val Arg Gln Leu Phe Val Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Ser

545 550 555 560

Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Pro Asp Ala Leu Lys Lys Phe

565 570 575

Gly Val Gly Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Gly Glu Ser Leu Gln Lys

580 585 590

Ile Ala Arg Asp Glu Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp Phe

595 600 605

Ile Ile Glu Thr Asp Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Asp

610 615 620

Ala Arg Lys Ser Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg

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645 650 655

Arg Asp Ile Arg Arg Gly Val Gln Gln Arg Pro Thr Leu Glu Thr Val

660 665 670

Arg Arg Ala Ala Ala Ala Met Leu Gly Ala Ser Ala Ala Glu Ile Lys

675 680 685

Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu

690 695 700

Thr Phe Ser Asn Phe Leu His Asp Leu Phe Glu Val Asp Val Pro Val

705 710 715 720

Gly Val Ile Val Ser Ala Ala Asn Thr Leu Gly Ser Val Ala Glu His

725 730 735

Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gly Gly Arg Ala Arg Pro Thr Phe Ala Thr

740 745 750

Val His Gly Lys Gly Ser Thr Thr Ile Lys Ala Ser Asp Leu Thr Leu

755 760 765

Asp Lys Phe Ile Asp Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys His Leu Pro

770 775 780

Lys Pro Ala Asp Pro Pro Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly

785 790 795 800

Trp Leu Gly Arg Phe Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro

805 810 815

Ala Gly Gly Lys Leu Ile Thr Ile Val Arg Gly Lys Asp Ala Ala Gln

820 825 830

Ala Lys Ala Arg Leu Asp Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Asp Pro Lys Leu

835 840 845

Ala Gly His Tyr Gln Asp Leu Ala Ala Thr Thr Leu Glu Val Leu Ala

850 855 860

Gly Asp Phe Ser Glu Pro Arg Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Asn

865 870 875 880

Arg Leu Ala Asp Glu Val Asp Phe Ile Ser His Pro Gly Ala Leu Val

885 890 895

Asn His Val Leu Pro Tyr Asn Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Ala Gly

900 905 910

Val Ala Glu Ile Ile Lys Leu Ala Ile Thr Thr Arg Ile Lys Pro Val

915 920 925

Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Val Glu Pro Ser Ala

930 935 940

Leu Asp Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val Ser Ala Glu Arg Ser Val

945 950 955 960

Asp Glu Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Gly Gly Glu

965 970 975

Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Arg Thr Gly Leu Pro Val Arg Val

980 985 990

Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Gln Lys Tyr Thr Gly Gln Val

995 1000 1005

Asn Ala Thr Asp Gln Phe Thr Arg Leu Val Gln Ser Leu Leu Ala Thr

1010 1015 1020

Gly Leu Ala Pro Lys Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Gln Gly Asn Arg

1025 1030 1035 1040

Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Ile Pro Val Asp Phe Thr Ala Glu Ser

1045 1050 1055

Ile Thr Thr Leu Gly Gly Asp Gly Leu Glu Gly Tyr Arg Ser Tyr Asn

1060 1065 1070

Val Phe Asn Pro His Arg Asp Gly Val Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp

1075 1080 1085

Trp Leu Ile Glu Ala Gly His Pro Ile Thr Arg Ile Asp Asp Tyr Asp

1090 1095 1100

Gln Trp Leu Ser Arg Phe Glu Thr Ser Leu Arg Gly Leu Pro Glu Ser

1105 1110 1115 1120

Lys Arg Gln Ala Ser Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Ala Arg Pro

1125 1130 1135

Gly Pro Ala Val Asp Gly Ser Pro Phe Arg Asn Thr Val Phe Arg Thr

1140 1145 1150

Asp Val Gln Lys Ala Lys Ile Gly Ala Glu His Asp Ile Pro His Leu

1155 1160 1165

Gly Lys Ala Leu Val Leu Lys Tyr Ala Asp Asp Ile Lys Gln Leu Gly

1170 1175 1180

Leu Leu

1185

<210> 8

<211> 382

<212> PRT

<213>熒光假單胞菌

<400> 8

Met Gln Ile Gln Gly His Tyr Glu Leu Gln Phe Glu Ala Val Arg Glu

1 5 10 15

Ala Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Gly Leu

20 25 30

Cys Ile Gln Ile Gly Gly Glu Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly Thr

35 40 45

Ala Asp Lys Asp Gly Thr Glu Ala Trp His Ser Asp Thr Ile Val Asn

50 55 60

Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Thr Ala Leu Gln Leu

65 70 75 80

Val Ala Glu Gly Lys Leu Gln Leu Asp Ala Pro Val Ala Asn Tyr Trp

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Pro Glu Phe Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ala Ile Thr Leu Arg Gln Leu

100 105 110

Leu Cys His Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Glu Met Leu Pro Thr

115 120 125

Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Arg Leu Met Val Asp Thr Leu Ala Ala Glu

130 135 140

Ala Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Glu Ala Ile Thr

145 150 155 160

Tyr Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly

165 170 175

Pro Gly Glu Ser Ile Val Ala Arg Val Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp

180 185 190

Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile

195 200 205

Ala Arg Ser Lys Gly Asn Met Gly Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Leu

210 215 220

Gln Val Met Met Arg Glu Pro Thr Ala Met Thr Thr Arg Ala Phe Ala

225 230 235 240

Asn Pro Pro Ser Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg

245 250 255

Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala

260 265 270

Gly Phe Tyr Ser Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ala Asp Met

275 280 285

Leu Glu Gln Leu Thr Arg Glu His Ser Ile Gly Pro Asp Lys Thr Leu

290 295 300

Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Gln Pro

305 310 315 320

Gln Leu Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Arg Ala Phe Gly His

325 330 335

Pro Arg Ser Ala Pro Val Val Arg Trp Val Leu Pro Glu His Asp Val

340 345 350

Ala Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp

355 360 365

Pro Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Ile Leu Ala Gly Cys Leu

370 375 380

<210> 9

<211> 246

<212> PRT

<213> 短乳桿菌

<400> 9

Met Ala Ala Asn Glu Phe Ser Glu Thr His Arg Val Val Tyr Tyr Glu

1 5 10 15

Ala Asp Asp Thr Gly Gln Leu Thr Leu Ala Met Leu Ile Asn Leu Phe

20 25 30

Val Leu Val Ser Glu Asp Gln Asn Asp Ala Leu Gly Leu Ser Thr Ala

35 40 45

Phe Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val Thr Gln Tyr His Leu

50 55 60

His Ile Asp Glu Leu Pro Arg Thr Gly Ala Gln Val Thr Ile Lys Thr

65 70 75 80

Arg Ala Thr Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe Ala Tyr Arg Glu Tyr Trp Leu

85 90 95

Leu Asp Asp Ala Gly Gln Val Leu Ala Tyr Gly Glu Gly Ile Trp Val

100 105 110

Thr Met Ser Tyr Ala Thr Arg Lys Ile Thr Thr Ile Pro Ala Glu Val

115 120 125

Met Ala Pro Tyr His Ser Glu Glu Gln Thr Arg Leu Pro Arg Leu Pro

130 135 140

Arg Pro Asp His Phe Asp Glu Ala Val Asn Gln Thr Leu Lys Pro Tyr

145 150 155 160

Thr Val Arg Tyr Phe Asp Ile Asp Gly Asn Gly His Val Asn Asn Ala

165 170 175

His Tyr Phe Asp Trp Met Leu Asp Val Leu Pro Ala Thr Phe Leu Arg

180 185 190

Ala His His Pro Thr Asp Val Lys Ile Arg Phe Glu Asn Glu Val Gln

195 200 205

Tyr Gly His Gln Val Thr Ser Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Leu Thr

210 215 220

Thr Gln His Met Ile Lys Val Gly Asp Leu Thr Ala Val Lys Ala Thr

225 230 235 240

Ile Gln Trp Asp Asn Arg

245

<210> 10

<211> 261

<212> PRT

<213> 植物乳桿菌

<400> 10

Met Ala Thr Leu Gly Ala Asn Ala Ser Leu Tyr Ser Glu Gln His Arg

1 5 10 15

Ile Thr Tyr Tyr Glu Cys Asp Arg Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr

20 25 30

Leu Ile Asp Ile Ala Val Leu Ala Ser Glu Asp Gln Ser Asp Ala Leu

35 40 45

Gly Leu Thr Thr Glu Met Val Gln Ser His Gly Val Gly Trp Val Val

50 55 60

Thr Gln Tyr Ala Ile Asp Ile Thr Arg Met Pro Arg Gln Asp Glu Val

65 70 75 80

Val Thr Ile Ala Val Arg Gly Ser Ala Tyr Asn Pro Tyr Phe Ala Tyr

85 90 95

Arg Glu Phe Trp Ile Arg Asp Ala Asp Gly Gln Gln Leu Ala Tyr Ile

100 105 110

Thr Ser Ile Trp Val Met Met Ser Gln Thr Thr Arg Arg Ile Val Lys

115 120 125

Ile Leu Pro Glu Leu Val Ala Pro Tyr Gln Ser Glu Val Val Lys Arg

130 135 140

Ile Pro Arg Leu Pro Arg Pro Ile Ser Phe Glu Ala Thr Asp Thr Thr

145 150 155 160

Ile Thr Lys Pro Tyr His Val Arg Phe Phe Asp Ile Asp Pro Asn Arg

165 170 175

His Val Asn Asn Ala His Tyr Phe Asp Trp Leu Val Asp Thr Leu Pro

180 185 190

Ala Thr Phe Leu Leu Gln His Asp Leu Val His Val Asp Val Arg Tyr

195 200 205

Glu Asn Glu Val Lys Tyr Gly Gln Thr Val Thr Ala His Ala Asn Ile

210 215 220

Leu Pro Ser Glu Val Ala Asp Gln Val Thr Thr Ser His Leu Ile Glu

225 230 235 240

Val Asp Asp Glu Lys Cys Cys Glu Val Thr Ile Gln Trp Arg Thr Leu

245 250 255

Pro Glu Pro Ile Gln

260

<210> 11

<211> 397

<212> PRT

<213> 齒垢密螺旋體

<400> 11

Met Ile Val Lys Pro Met Val Arg Asn Asn Ile Cys Leu Asn Ala His

1 5 10 15

Pro Gln Gly Cys Lys Lys Gly Val Glu Asp Gln Ile Glu Tyr Thr Lys

20 25 30

Lys Arg Ile Thr Ala Glu Val Lys Ala Gly Ala Lys Ala Pro Lys Asn

35 40 45

Val Leu Val Leu Gly Cys Ser Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Ser Arg Ile

50 55 60

Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Ile Gly Val Ser Phe Glu

65 70 75 80

Lys Ala Gly Ser Glu Thr Lys Tyr Gly Thr Pro Gly Trp Tyr Asn Asn

85 90 95

Leu Ala Phe Asp Glu Ala Ala Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Ser Val Thr

100 105 110

Ile Asp Gly Asp Ala Phe Ser Asp Glu Ile Lys Ala Gln Val Ile Glu

115 120 125

Glu Ala Lys Lys Lys Gly Ile Lys Phe Asp Leu Ile Val Tyr Ser Leu

130 135 140

Ala Ser Pro Val Arg Thr Asp Pro Asp Thr Gly Ile Met His Lys Ser

145 150 155 160

Val Leu Lys Pro Phe Gly Lys Thr Phe Thr Gly Lys Thr Val Asp Pro

165 170 175

Phe Thr Gly Glu Leu Lys Glu Ile Ser Ala Glu Pro Ala Asn Asp Glu

180 185 190

Glu Ala Ala Ala Thr Val Lys Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Arg

195 200 205

Trp Ile Lys Gln Leu Ser Lys Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Cys Ile

210 215 220

Thr Leu Ala Tyr Ser Tyr Ile Gly Pro Glu Ala Thr Gln Ala Leu Tyr

225 230 235 240

Arg Lys Gly Thr Ile Gly Lys Ala Lys Glu His Leu Glu Ala Thr Ala

245 250 255

His Arg Leu Asn Lys Glu Asn Pro Ser Ile Arg Ala Phe Val Ser Val

260 265 270

Asn Lys Gly Leu Val Thr Arg Ala Ser Ala Val Ile Pro Val Ile Pro

275 280 285

Leu Tyr Leu Ala Ser Leu Phe Lys Val Met Lys Glu Lys Gly Asn His

290 295 300

Glu Gly Cys Ile Glu Gln Ile Thr Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Leu Tyr

305 310 315 320

Arg Lys Asp Gly Thr Ile Pro Val Asp Glu Glu Asn Arg Ile Arg Ile

325 330 335

Asp Asp Trp Glu Leu Glu Glu Asp Val Gln Lys Ala Val Ser Ala Leu

340 345 350

Met Glu Lys Val Thr Gly Glu Asn Ala Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ala

355 360 365

Gly Tyr Arg His Asp Phe Leu Ala Ser Asn Gly Phe Asp Val Glu Gly

370 375 380

Ile Asn Tyr Glu Ala Glu Val Glu Arg Phe Asp Arg Ile

385 390 395

<210> 12

<211> 539

<212> PRT

<213> 細(xì)小裸藻

<400> 12

Met Ser Cys Pro Ala Ser Pro Ser Ala Ala Val Val Ser Ala Gly Ala

1 5 10 15

Leu Cys Leu Cys Val Ala Thr Val Leu Leu Ala Thr Gly Ser Asn Pro

20 25 30

Thr Ala Leu Ser Thr Ala Ser Thr Arg Ser Pro Thr Ser Leu Val Arg

35 40 45

Gly Val Asp Arg Gly Leu Met Arg Pro Thr Thr Ala Ala Ala Leu Thr

50 55 60

Thr Met Arg Glu Val Pro Gln Met Ala Glu Gly Phe Ser Gly Glu Ala

65 70 75 80

Thr Ser Ala Trp Ala Ala Ala Gly Pro Gln Trp Ala Ala Pro Leu Val

85 90 95

Ala Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Leu Trp Trp Trp Ala Ala Arg Arg

100 105 110

Ser Val Arg Arg Pro Leu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Pro Thr Ala Val

115 120 125

Thr His Leu Ala Pro Pro Met Ala Met Phe Thr Thr Thr Ala Lys Val

130 135 140

Ile Gln Pro Lys Ile Arg Gly Phe Ile Cys Thr Thr Thr His Pro Ile

145 150 155 160

Gly Cys Glu Lys Arg Val Gln Glu Glu Ile Ala Tyr Ala Arg Ala His

165 170 175

Pro Pro Thr Ser Pro Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Ile Gly Cys Ser

180 185 190

Thr Gly Tyr Gly Leu Ser Thr Arg Ile Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gln

195 200 205

Ala Ala Thr Leu Gly Val Phe Leu Ala Gly Pro Pro Thr Lys Gly Arg

210 215 220

Pro Ala Ala Ala Gly Trp Tyr Asn Thr Val Ala Phe Glu Lys Ala Ala

225 230 235 240

Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Ser Leu Asn Gly Asp Ala Phe Asp

245 250 255

Ser Thr Thr Lys Ala Arg Thr Val Glu Ala Ile Lys Arg Asp Leu Gly

260 265 270

Thr Val Asp Leu Val Val Tyr Ser Ile Ala Ala Pro Lys Arg Thr Asp

275 280 285

Pro Ala Thr Gly Val Leu His Lys Ala Cys Leu Lys Pro Ile Gly Ala

290 295 300

Thr Tyr Thr Asn Arg Thr Val Asn Thr Asp Lys Ala Glu Val Thr Asp

305 310 315 320

Val Ser Ile Glu Pro Ala Ser Pro Glu Glu Ile Ala Asp Thr Val Lys

325 330 335

Val Met Gly Gly Glu Asp Trp Glu Leu Trp Ile Gln Ala Leu Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Val Leu Ala Glu Gly Ala Lys Thr Val Ala Tyr Ser Tyr Ile

355 360 365

Gly Pro Glu Met Thr Trp Pro Val Tyr Trp Ser Gly Thr Ile Gly Glu

370 375 380

Ala Lys Lys Asp Val Glu Lys Ala Ala Lys Arg Ile Thr Gln Gln Tyr

385 390 395 400

Gly Cys Pro Ala Tyr Pro Val Val Ala Lys Ala Leu Val Thr Gln Ala

405 410 415

Ser Ser Ala Ile Pro Val Val Pro Leu Tyr Ile Cys Leu Leu Tyr Arg

420 425 430

Val Met Lys Glu Lys Gly Thr His Glu Gly Cys Ile Glu Gln Met Val

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Arg Leu Leu Thr Thr Lys Leu Tyr Pro Glu Asn Gly Ala Pro Ile Val

450 455 460

Asp Glu Ala Gly Arg Val Arg Val Asp Asp Trp Glu Met Ala Glu Asp

465 470 475 480

Val Gln Gln Ala Val Lys Asp Leu Trp Ser Gln Val Ser Thr Ala Asn

485 490 495

Leu Lys Asp Ile Ser Asp Phe Ala Gly Tyr Gln Thr Glu Phe Leu Arg

500 505 510

Leu Phe Gly Phe Gly Ile Asp Gly Val Asp Tyr Asp Gln Pro Val Asp

515 520 525

Val Glu Ala Asp Leu Pro Ser Ala Ala Gln Gln

530 535

<210> 13

<211> 269

<212> PRT

<213> 蠟狀芽孢桿菌

<400> 13

Met Ile Asn Lys Thr Leu Leu Gln Lys Arg Phe Asn Gly Ala Ala Val

1 5 10 15

Ser Tyr Asp Arg Tyr Ala Asn Val Gln Lys Lys Met Ala His Ser Leu

20 25 30

Leu Ser Ile Leu Lys Glu Arg Tyr Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Ile

35 40 45

Leu Glu Leu Gly Cys Gly Thr Gly Tyr Val Thr Glu Gln Leu Ser Lys

50 55 60

Leu Phe Pro Lys Ser His Ile Thr Ala Val Asp Phe Ala Glu Ser Met

65 70 75 80

Ile Ala Ile Ala Gln Thr Arg Gln Asn Val Lys Asn Val Thr Phe His

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130 135 140

Thr Phe Gly His Glu Thr Phe Gln Glu Leu His Ala Ser Phe Gln Arg

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Glu Gly Ser Tyr Cys Gln Ser Pro Ser Leu Phe Arg Ala Met Leu Arg

225 230 235 240

Ile Tyr Glu Arg Asp Phe Thr Gly Asn Glu Gly Ile Met Ala Thr Tyr

245 250 255

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260 265

<210> 14

<211> 132

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 14

Met Ser Thr Thr His Asn Val Pro Gln Gly Asp Leu Val Leu Arg Thr

1 5 10 15

Leu Ala Met Pro Ala Asp Thr Asn Ala Asn Gly Asp Ile Phe Gly Gly

20 25 30

Trp Leu Met Ser Gln Met Asp Ile Gly Gly Ala Ile Leu Ala Lys Glu

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Ile Ala His Gly Arg Val Val Thr Val Arg Val Glu Gly Met Thr Phe

50 55 60

Leu Arg Pro Val Ala Val Gly Asp Val Val Cys Cys Tyr Ala Arg Cys

65 70 75 80

Val Gln Lys Gly Thr Thr Ser Val Ser Ile Asn Ile Glu Val Trp Val

85 90 95

Lys Lys Val Ala Ser Glu Pro Ile Gly Gln Arg Tyr Lys Ala Thr Glu

100 105 110

Ala Leu Phe Lys Tyr Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Lys Pro Arg Ala

115 120 125

Leu Pro Val Glu

130

<210> 15

<211> 286

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 15

Met Ser Gln Ala Leu Lys Asn Leu Leu Thr Leu Leu Asn Leu Glu Lys

1 5 10 15

Ile Glu Glu Gly Leu Phe Arg Gly Gln Ser Glu Asp Leu Gly Leu Arg

20 25 30

Gln Val Phe Gly Gly Gln Val Val Gly Gln Ala Leu Tyr Ala Ala Lys

35 40 45

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50 55 60

Leu Arg Pro Gly Asp Ser Lys Lys Pro Ile Ile Tyr Asp Val Glu Thr

65 70 75 80

Leu Arg Asp Gly Asn Ser Phe Ser Ala Arg Arg Val Ala Ala Ile Gln

85 90 95

Asn Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Met Thr Ala Ser Phe Gln Ala Pro Glu

100 105 110

Ala Gly Phe Glu His Gln Lys Thr Met Pro Ser Ala Pro Ala Pro Asp

115 120 125

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130 135 140

Pro Pro Val Leu Lys Asp Lys Phe Ile Cys Asp Arg Pro Leu Glu Val

145 150 155 160

Arg Pro Val Glu Phe His Asn Pro Leu Lys Gly His Val Ala Glu Pro

165 170 175

His Arg Gln Val Trp Ile Arg Ala Asn Gly Ser Val Pro Asp Asp Leu

180 185 190

Arg Val His Gln Tyr Leu Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Leu Asn Phe Leu

195 200 205

Pro Val Ala Leu Gln Pro His Gly Ile Gly Phe Leu Glu Pro Gly Ile

210 215 220

Gln Ile Ala Thr Ile Asp His Ser Met Trp Phe His Arg Pro Phe Asn

225 230 235 240

Leu Asn Glu Trp Leu Leu Tyr Ser Val Glu Ser Thr Ser Ala Ser Ser

245 250 255

Ala Arg Gly Phe Val Arg Gly Glu Phe Tyr Thr Gln Asp Gly Val Leu

260 265 270

Val Ala Ser Thr Val Gln Glu Gly Val Met Arg Asn His Asn

275 280 285

<210> 16

<211> 224

<212> PRT

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 16

Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu

1 5 10 15

Asn Glu Arg Phe Met Ser Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys

20 25 30

Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp

35 40 45

Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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210 215 220

<210> 17

<211> 222

<212> PRT

<213> 諾卡氏菌屬物種NRRL 5646

<400> 17

Met Ile Glu Thr Ile Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Ala Glu Leu Leu

1 5 10 15

Glu Tyr Pro Glu Asp Leu Lys Ala His Pro Ala Glu Glu His Leu Ile

20 25 30

Ala Lys Ser Val Glu Lys Arg Arg Arg Asp Phe Ile Gly Ala Arg His

35 40 45

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50 55 60

Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Ile Trp Pro Arg Gly Val Val Gly

65 70 75 80

Ser Leu Thr His Cys Asp Gly Tyr Arg Ala Ala Ala Val Ala His Lys

85 90 95

Met Arg Phe Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Glu Pro His Ala Thr Leu

100 105 110

Pro Glu Gly Val Leu Asp Ser Val Ser Leu Pro Pro Glu Arg Glu Trp

115 120 125

Leu Lys Thr Thr Asp Ser Ala Leu His Leu Asp Arg Leu Leu Phe Cys

130 135 140

Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Trp Trp Pro Leu Thr Ala Arg Trp

145 150 155 160

Leu Gly Phe Glu Glu Ala His Ile Thr Phe Glu Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Ala Asp Ser Gly Asn Gly Thr Phe His Ser Glu Leu Leu Val Pro Gly

180 185 190

Gln Thr Asn Asp Gly Gly Thr Pro Leu Leu Ser Phe Asp Gly Arg Trp

195 200 205

Leu Ile Ala Asp Gly Phe Ile Leu Thr Ala Ile Ala Tyr Ala

210 215 220