本申請要求于2014年6月17日提交的美國臨時專利申請No.62/013,159的優(yōu)先權(quán)。上述申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文，包括所有文本、表格、序列表和附圖。

序列表

本申請隨同序列表提交。序列表以ASCII格式通過EFS-Web以文本文件的形式以電子形式提交。所述ASCII拷貝在2015年6月16日創(chuàng)建，命名為XycrobeSeqListing0439565.1.txt，大小為806kb，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

介紹

本公開涉及包含經(jīng)遺傳修飾的微生物的組合物，制備經(jīng)遺傳修飾的微生物的方法及其用途。在一些方面，本文所述的主題涉及皮膚病學領域和用于局部皮膚病用途的組合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾的微生物。在具體實施方案中，微生物是丙酸桿菌屬的細菌。在各個方面，丙酸桿菌屬的經(jīng)遺傳修飾的細菌包含編碼哺乳動物生長因子或哺乳動物細胞因子的核酸。在一些方面，生長因子是激素。在某些方面，生長因子是人激素或牛激素。在某些實施方案中，生長因子是促生長素。在一些實施方案中，生長因子包括SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49。在某些實施方案中，生長因子是由細菌分泌的。在一些實施方案中，生長因子是人生長因子。在某些實施方案中，生長因子是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF1)、血小板衍生生長因子(PDGF)、粒細胞單核細胞集落刺激因子(GMCSF)、表皮生長因子(EGF)和/或人生長激素(HGH)。生長因子可以是包含SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:69中的任一種的轉(zhuǎn)化生長因子。在一些實施方案中，生長因子是包含SEQ ID NO:70的肝細胞生長因子。在一些實施方案中，生長因子是包含SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:91中的任一種的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。在一些實施方案中，生長因子是包含SEQ ID NO:93至SEQ ID NO:102中的任一種的血小板衍生生長因子(PDGF)。在某些實施方案中，生長因子是包含SEQ ID NO:103至SEQ ID NO:106中的任一種的表皮生長因子(EGF)。在一些實施方案中，成纖維細胞生長因子(FGF)包含SEQ ID NO:107至SEQ ID NO:144中的任一種。在一些實施方案中，一種或多種細菌分泌哺乳動物生長因子或哺乳動物細胞因子。在一些實施方案中，哺乳動物細胞因子是免疫抑制性細胞因子。在一些實施方案中，哺乳動物細胞因子是人細胞因子。在某些實施方案中，細胞因子選自白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)和白介素-8(IL-8)。在一些實施方案中，細胞因子選自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。在一些實施方案中，哺乳動物細胞因子包括IL-10。在一些實施方案中，IL-10包含SEQ ID NO:25。

在一些實施方案中，丙酸桿菌屬包括選自由產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidifaciens)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、澳大利亞丙酸桿菌(Propionibacterium australiense)、貪婪丙酸桿菌(Propionibacterium avidum)、環(huán)己酸丙酸桿菌(Propionibacterium cyclohexanicum)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum)、詹氏丙酸桿菌(Propionibacterium jensenii)、微嗜氧丙酸桿菌(Propionibacterium microaerophilum)、丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium propionicum)和特氏丙酸桿菌(Propionibacterium thoeniiand)組成的群組中的物種。在一些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌的菌株包含CRISPR(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復)陣列。在一些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌的菌株是痤瘡丙酸桿菌，II型，核糖體型6(R6Type II P.acnes)。

在一些實施方案中，核酸包含配置為調(diào)節(jié)哺乳動物生長因子或哺乳動物細胞因子的表達的誘導型啟動子。在一些實施方案中，核酸包含配置為指導哺乳動物生長因子或哺乳動物細胞因子的表達的內(nèi)源啟動子。在一些實施方案中，在一種或多種經(jīng)遺傳修飾的細菌中顯著減少或消除了內(nèi)源性致病性蛋白的表達。在一些實施方案中，內(nèi)源性致病性蛋白包含甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)蛋白或CAMP2蛋白。在一些實施方案中，一種或多種經(jīng)遺傳修飾的細菌包含調(diào)節(jié)必需蛋白的表達的誘導型啟動子。在某些實施方案中，必需蛋白是合適的管家基因。在某些實施方案中，必需蛋白是合適的染色體復制起始蛋白。在一些實施方案中，必需蛋白選自：染色體復制起始蛋白DnaA、FtsA、FtsI、FtsL、FtsK、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsZ(例如絲狀溫度敏感性生長，在一些實施方案中，具有FTS的基因是編碼允許分裂的縮窄環(huán)的操縱子)，細胞分裂蛋白(例如ZipA基因)，莽草酸5-脫氫酶(例如AROE，aroE基因)，ATP合酶(例如ATP合酶，F(xiàn)1復合物，β亞基，例如atpD基因)，鳥苷酸激酶(例如gmk)，GMP合酶(例如guaA)，GTP結(jié)合蛋白(例如lepA)，重組酶A蛋白(例如recA)，超氧化物歧化酶(例如sodA基因)。在一些實施方案中，誘導型啟動子可由糖誘導，例如由乳糖或阿拉伯糖誘導。在一些實施方案中，誘導型啟動子可被氨基酸誘導，例如被合成氨基酸誘導。在一些實施方案中，組合物被配置用于局部或粘膜施用于哺乳動物。

在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物，例如痤瘡丙酸桿菌種的細菌，包含多重遺傳修飾。在一特定方面，經(jīng)修飾的微生物1)表達哺乳動物生長因子，其中分泌哺乳動物生長因子；2)包括指導必需蛋白的表達的誘導啟動子，必需蛋白如染色體復制起始蛋白DnaA、FtsA、FtsI、FtsL、FtsK、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsZ、ZipA、aroE、atpD、gmk、guaA、lepA、recA、或sodA)；和3)被修飾，使得內(nèi)源性CAMP2和/或內(nèi)源性GADPH蛋白的表達被顯著減少或消除。在另一個特定方面，經(jīng)遺傳修飾的微生物，例如痤瘡丙酸桿菌種的細菌，包含1)人細胞因子，例如IL10，其中分泌細胞因子(例如IL10)；2)包括指導必需蛋白(例如，必需蛋白和/或編碼必需蛋白的基因)的表達的誘導型啟動子，例如染色體復制起始蛋白DnaA、FtsA、FtsI、FtsL、FtsK、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsZ、ZipA、aroE、atpD、gmk、guaA、lepA、recA、orsodA；和3)被修飾，使得內(nèi)源性CAMP2和/或內(nèi)源性GADPH蛋白的表達被顯著減少或消除。

在某些實施方案中，一種組合物包含一種或多種遺傳修飾的微生物，例如包含痤瘡丙酸桿菌種的細菌。在具體方面，一種組合物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種的例如痤瘡丙酸桿菌種的細菌，其中的每一種以不同方式經(jīng)遺傳修飾。例如，組合物的第一經(jīng)遺傳修飾的微生物可以表達細胞因子，例如表達IL-10，IL-6，IL-7或IL-8；并且組合物的第二經(jīng)遺傳修飾的微生物可以表達生長因子，例如表達TGF-β、VEGF、HGF、FGF、IGF1、PDGF、GMCSF、EGF或HGH。這樣的組合可以包括一種或多種經(jīng)遺傳修飾的微生物，其中在一種或多種遺傳修飾的細菌中顯著減少或消除了內(nèi)源性致病性蛋白的表達，例如甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)蛋白或CAMP2蛋白的表達。這樣的組合還可以包括一種或多種經(jīng)遺傳修飾的微生物，這樣的微生物包括調(diào)節(jié)必需蛋白的表達的誘導型啟動子，例如蛋白選自染色體復制起始蛋白DnaA、FtsA、FtsI、FtsL、FtsK、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsZ、ZipA、aroE、atpD、gmk、guaA、lepA、recA和sodA。這樣的組合還包括經(jīng)遺傳修飾的微生物，該微生物如痤瘡丙酸桿菌種的具有多重遺傳修飾的細菌。

在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物，例如痤瘡丙酸桿菌種的細菌，包含調(diào)節(jié)必需蛋白表達的誘導型啟動子。在某些方面，蛋白質(zhì)表達通過所存在的糖或糖類似物誘導或刺激，即啟動子由糖或糖類似物誘導。

附圖說明

附圖示出了本技術(shù)的一些實施方案，并且不是限制性的。為了清楚和易于說明，附圖不是按比例繪制的，在一些情況下，示出了夸大或放大的各個方面，以便于理解特定的實施方案。

圖1顯示了dnaA-Bs-Cm的質(zhì)粒圖譜：用于構(gòu)建枯草芽孢桿菌的生長停滯菌株的自連接DNA。

圖2顯示了18-araRE-ftsOp-erm的質(zhì)粒圖譜：用于構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌I的生長停滯菌株的質(zhì)粒，阿拉伯糖誘導型fts操縱子。

圖3顯示了18-bgalpro-dnaA-erm-cm的質(zhì)粒圖：用于構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌II的生長停滯菌株的質(zhì)粒，乳糖誘導型dnaA。

圖4A顯示了蛋白質(zhì)表達載體pET15-IL10的質(zhì)粒圖譜：用于IL-10的表達載體。

圖4B顯示了蛋白質(zhì)表達載體pET15-EGF的質(zhì)粒圖譜：用于EGF的表達載體。

圖4C顯示了蛋白質(zhì)表達載體pET15-GH的質(zhì)粒圖譜：用于GH的表達載體。

圖5顯示了18-CAMPII-erm-cm的質(zhì)粒圖譜：用于構(gòu)建CAMPII突變痤瘡丙酸桿菌菌株的質(zhì)粒。

圖6顯示了β-gal pro-IL10的質(zhì)粒圖譜：用于構(gòu)建乳糖誘導型IL10分泌痤瘡丙酸桿菌菌株的質(zhì)粒。

圖7顯示了19-CAMPII-sig-IL10的質(zhì)粒圖譜：用于構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌的CAMPII突變體和IL-10表達菌株的質(zhì)粒。

圖8顯示了19-sig-IL10-gapdh的質(zhì)粒圖譜：用于構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌的GAPDH突變體和IL-10表達菌株的質(zhì)粒。

圖9顯示了用于構(gòu)建無標記突變構(gòu)建體的方案。

圖10顯示了來自痤瘡丙酸桿菌的II型菌株(RecA ATCC 11828，SEQ ID NO:274)的RecA基因和來自痤瘡丙酸桿菌的I型菌株(RecA NCTC737，SEQ ID NO:275)的RecA基因的比對。陰影區(qū)域指示在相同的堿基位置的核苷酸堿基同一性。所示的編號相對于全長基因中序列的位置。

圖11顯示了從推定的RT6克隆測序的RecA基因(RecA NCTC737,SEQ ID NO:277；NC_017_41_RecA,SEQ ID NO:278；NC_001_4_RecA,SEQ ID NO:279；NC_003_18_RecA,SEQ ID NO:280；NC_005_31_RecA,SEQ ID NO:281；NC_007_33_RecA,SEQ ID NO:282；NC_009_34_RecA,SEQ ID NO:283；NC_011_35_RecA,SEQ ID NO:284；NC_015_39_RecA,SEQ ID NO:285；NC_019_43_RecA,SEQ ID NO:286；NC_021_44_RecA,SEQ ID NO:287；NC_023_45_RecA,SEQ ID NO:288；NC_025_46_RecA,SEQ ID NO:289)與來自ATTCC11828菌株的RecA基因(RecA 11828，SEQ ID NO:276)的區(qū)域720-1191的比對。陰影區(qū)域表示在相同的堿基位置的核苷酸堿基同一性。

圖12顯示痤瘡丙酸桿菌的菌株ATCC11828的16S RNA的SNP序列(SEQ ID NO:290)與從在實施例1中的分離的痤瘡丙酸桿菌菌株分離的SNP序列(PA_001_4_16S,SEQ ID NO:291；PA_002_18_16S,SEQ ID NO:292；PA_003_20_16S,SEQ ID NO:293；PA_005_31_16S,SEQ ID NO:294；PA_007_33_16S,SEQ ID NO:295；PA_008_34_16S,SEQ ID NO:296；PA_009_35_16S,SEQ ID NO:297；PA_011_39_16S,SEQ ID NO:298；PA_013_43_16S,SEQ ID NO:299；PA_014_44_16S,SEQ ID NO:300；PA_015_45_16S,SEQ ID NO:301；PA_017_48_16S,SEQ ID NO:302)的比對。陰影區(qū)域表示在相同的堿基位置的核苷酸堿基同一性。

圖13顯示了在生長培養(yǎng)基中個體的經(jīng)遺傳修飾的痤瘡丙酸桿菌的人IL-10(泳道1，IL-10)、人生長激素(泳道2，GH)和人表皮生長因子菌株(泳道3，EGF)的表達。所指示的蛋白質(zhì)在誘導型LacZ啟動子的指導下表達。

圖14顯示了用于構(gòu)建生長停滯痤瘡丙酸桿菌突變菌株的方案。從枯草芽孢桿菌擴增阿拉伯糖誘導型啟動子和調(diào)節(jié)子的DNA區(qū)，并將fts操縱子的片段連接到阿拉伯糖誘導型啟動子的下游。將該質(zhì)粒引入痤瘡丙酸桿菌中用于單交換重組以構(gòu)建阿拉伯糖調(diào)節(jié)的生長停滯菌株。

圖15顯示了痤瘡丙酸桿菌野生型和生長停滯突變菌株的生長比較。痤瘡丙酸桿菌野生型菌株和生長停滯突變菌株劃線到含有葡萄糖(1％)和阿拉伯糖(1.5％)的經(jīng)修飾的增強梭菌培養(yǎng)基上，并在37℃下在厭氧條件下孵育。在第6、10和15天檢查這些菌株的菌落大小。

圖16顯示了經(jīng)0.1m M IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導1.5小時在經(jīng)遺傳修飾的痤瘡丙酸桿菌菌株的生長培養(yǎng)基中IL-10(泳道2)的表達。誘導前的生長培養(yǎng)基顯示在泳道1中。

具體實施方式

除非本文另有說明，否則本部分中描述的材料對于本申請中的權(quán)利要求不是現(xiàn)有技術(shù)，并且不因被包括在本部分中而被承認為現(xiàn)有技術(shù)。

本文公開了經(jīng)遺傳修飾的微生物和包含經(jīng)遺傳修飾的微生物的組合物。微生物(例如細菌)可以被遺傳修飾以表達和/或分泌有益于哺乳動物的生物分子。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌進一步被修飾以顯著減少或消除有害的毒力因子(例如毒素或抗原)的表達。在一些實施方案中，可以通過引入包含誘導型啟動子的核酸來控制/調(diào)節(jié)這樣的經(jīng)遺傳修飾的微生物的生長和存活力，所述誘導型啟動子調(diào)節(jié)對經(jīng)修飾的微生物的生長和/或存活是必需的蛋白質(zhì)的表達。在某些實施方案中，包含這種經(jīng)遺傳修飾的微生物的組合物被配制用于局部遞送至哺乳動物的皮膚。

本文所用的微生物或微小生物可以指微觀生物體、單細胞生物體或多細胞生物體。微生物的實例可包括但不限于細菌、古細菌、原生動物和真菌。在某些實施方案中，微生物是細菌。

如本文所用的“經(jīng)遺傳修飾的生物體”可以指其中生物體的遺傳物質(zhì)已使用遺傳工程技術(shù)改變的生物體。術(shù)語經(jīng)遺傳修飾還指多重遺傳修飾，例如。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個遺傳修飾，例如一種微生物，其具有為表達蛋白質(zhì)而引入的外源基因以及修飾(例如基因敲除)，從而減少編碼致病性分子(例如致病性肽或蛋白質(zhì))的內(nèi)源(微生物)基因的表達。

微生物(例如細菌、真細菌、酵母、真菌)可以被遺傳修飾以產(chǎn)生一種或多種蛋白質(zhì)，產(chǎn)生生物治療，改變代謝，防止過度生長，和/或阻止生物分子的表達。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物體是經(jīng)遺傳修飾的微生物。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的生物體是經(jīng)遺傳修飾的細菌。在某些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌細菌是被遺傳修飾的。本領域技術(shù)人員應理解，存在多種方式來產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物體，例如通過產(chǎn)生基因敲除、通過引入異源核酸和/或通過產(chǎn)生突變來產(chǎn)生。

在一些實施方案中，使用合適的技術(shù)將核酸(例如，基因或其部分)引入微生物中。在一些實施方案中，通過合適的技術(shù)用核酸轉(zhuǎn)化微生物。用于將核酸引入微生物的合適技術(shù)的非限制性實例包括電穿孔、轉(zhuǎn)導(例如通過噬菌體注射核酸)、顯微注射、借助誘導能力(例如借助加入堿性陽離子、銫、鋰、聚乙二醇或通過滲透壓休克)等或其組合。核酸可以以例如線性或環(huán)狀質(zhì)粒的形式引入微生物中。在一些實施方案中，通過使用合適的選擇方法(例如選擇標記物)選擇轉(zhuǎn)化的微生物以將核酸整合到微生物的基因組中。

基因編碼特異性蛋白質(zhì)，其在通過轉(zhuǎn)錄和翻譯表達后在活微生物中實現(xiàn)特異性生物化學功能?；蛴袝r包括參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA區(qū)段，并且有時包括參與基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄/翻譯以及轉(zhuǎn)錄/翻譯的調(diào)節(jié)的編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(例如開放閱讀框)。必需基因是產(chǎn)生微生物生長和/或存活所必需的多肽(例如，必需蛋白)的內(nèi)源基因(例如，對于微生物是內(nèi)源性的)。細菌的必需蛋白質(zhì)的非限制性實例包括DnaA、FtsA、FtsI、FtsL、FtsK、FtsN、FtsQ、FtsW、FtsZ、ZipA、aroE、atpD、gmk、guaA、lepA、recA和sodA。

本文使用的“基因敲除”是指可以使特異性基因不可操作或無活性的一些遺傳技術(shù)的組合。在一些實施方案中，基因敲除減少或消除來自基因的多肽的表達。在某些實施方案中，基因的表達被顯著減少或消除。顯著減少是指當與基因的內(nèi)源表達水平相比時，基因的表達減少至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。可以通過合適的技術(shù)(例如，通過測量轉(zhuǎn)錄物或所表達的蛋白質(zhì)水平)確定基因的表達。任何合適的技術(shù)可用于在微生物(例如細菌)中產(chǎn)生基因敲除。微生物中的基因敲除可以通過以下技術(shù)進行：轉(zhuǎn)座子誘變，體外遺傳工程以修飾包含在質(zhì)?；蚣毦斯と旧w(BAC)上的基因并將經(jīng)修飾的構(gòu)建體移至所研究的生物體，體內(nèi)同源重組和其它對本領域技術(shù)人員而言已知的技術(shù)。在某些實施方案中，通過使基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的內(nèi)源啟動子、操縱子或調(diào)節(jié)元件失活來敲除基因。在一些實施方案中，通過引入一個或多個使從基因表達的蛋白質(zhì)的功能不能實現(xiàn)的突變來敲除基因。在某些實施方案中，基因從微生物的基因組中部分或完全去除。在一些實施方案中，通過將基因用不同的基因(例如，異源基因或非功能基因)替換來敲除內(nèi)源基因。

在一些實施方案中，微生物被遺傳修飾以防止致病性分子(例如致病性肽或蛋白質(zhì))的分泌。在一些實施方案中，致病分子是毒性分子(例如毒素)。在某些實施方案中，敲除編碼致病性分子和/或毒性分子的基因。在某些實施方案中，細菌被遺傳修飾以顯著減少或消除致病性分子或毒性分子的表達。毒性分子的非限制性實例包括細菌內(nèi)毒素、細菌外毒素和細菌抗原。細菌抗原是在哺乳動物中誘導免疫應答的任何源自細菌的分子(例如化合物或蛋白質(zhì))。在一些實施方案中，致病性分子是Christie-Atkins-Munch-Petersen(CAMP)因子(例如痤瘡丙酸桿菌的CAMP因子)。在某些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌的一種或多種CAMP因子(例如，CAMP1、CAMP2、CAMP3、CAMP4和/或CAMP5)被敲除。在某些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌細菌被遺傳修飾以顯著減少或消除一種或多種CAMP因子的表達。在一些實施方案中，致病性分子是細菌甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(例如痤瘡丙酸桿菌的GAPDH)。在某些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌的一個或多個GAPDH基因被敲除。在某些實施方案中，痤瘡丙酸桿菌細菌被遺傳修飾以顯著減少或消除GAPDH的表達。

在一些實施方案中，微生物被遺傳修飾以產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型。在一些實施方案中，微生物被遺傳修飾以防止遺傳物質(zhì)的接受。在一些實施方案中，微生物被天然修飾或被遺傳修飾以防止遺傳物質(zhì)的捐贈。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白ComEA的基因以防止遺傳物質(zhì)的捐贈。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白ComEA的基因以防止遺傳物質(zhì)的接受。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白ComFA的基因以防止遺傳物質(zhì)的捐贈。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白ComFA的基因以防止遺傳物質(zhì)的接受。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白ComA的基因以防止遺傳物質(zhì)的捐贈。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白ComA的基因以防止遺傳物質(zhì)的接受。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白質(zhì)ComK的基因以防止遺傳物質(zhì)的捐贈。在一些實施方案中，修飾用于感受態(tài)蛋白質(zhì)ComK的基因以防止遺傳物質(zhì)的接受。在某些實施方案中，微生物包含CRISPR陣列，或者將CRISPR陣列引入微生物(例如細菌)中以防止或減少從其它微生物接受外來遺傳物質(zhì)。

也可以進行微生物的遺傳修飾以向基因組引入非功能性和非有害的改變，其中對微生物沒有有害的表型。如本文所述的“遺傳標記”是指在基因組中的引入的非功能性序列，以檢測經(jīng)遺傳修飾的生物體或微生物的存在。可以使用合適的技術(shù)將任何合適的遺傳標記摻入經(jīng)遺傳修飾的微生物中。可以進行遺傳修飾以便將經(jīng)遺傳修飾的微生物與野生型微生物編目和區(qū)分開，并且以便確定環(huán)境中經(jīng)遺傳修飾的微生物的存在。經(jīng)遺傳修飾的微生物在環(huán)境中可以通過以下方式確定：擦拭含有可疑的經(jīng)遺傳修飾的微生物源，使微生物在最小培養(yǎng)基培養(yǎng)物中生長，獲得遺傳物質(zhì)，使用qPCR與特異性引物至目標序列，以及對經(jīng)遺傳修飾的微生物的DNA測序。使用遺傳修飾來引入特異性遺傳標簽可以使得人們能夠在有需要的受試者上編目和確定存在的經(jīng)遺傳修飾的微生物。此外，當不再需要微生物時，所述技術(shù)可以使得人們能夠確定經(jīng)遺傳修飾的微生物不存在于環(huán)境中。在一些實施方案中，微生物被遺傳修飾以攜帶用于確定宿主上存在或不存在經(jīng)遺傳修飾的微生物的標記。用于確定經(jīng)遺傳修飾的細菌的繁殖的標記還可以用于分析受試者的微生物群落以確保細菌在治療期間平衡。

經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于分泌生物分子(例如蛋白質(zhì))以治療有需要的受試者的病癥。經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療有需要的患有皮膚病的受試者。攜帶用于肽的受控表達的核酸的經(jīng)遺傳修飾的微生物會是有利的，因為它們可以在皮膚上移動并深入到毛孔和毛囊中，從而允許吸收分泌的生物分子。微生物可以配制用于例如一般美容品以及用于一般美容品。

在本文所述的若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療患有遺傳疾病的受試者。在本文的若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療患有胃疾病的受試者。在本文的若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療患有自身免疫性疾病的受試者。在若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療用抗凝血劑治療的受試者。在若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療患有血友病的受試者。用于治療的包括用于肽的核酸的經(jīng)遺傳修飾的微生物可以聯(lián)合使用以滿足有需要的受試者的需求。在一些實施方案中，第二種經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療有需要的受試者。在一些實施方案中，第三種經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療有需要的受試者。在一些實施方案中，多于三種的經(jīng)遺傳修飾的微生物可用于治療有需要的受試者。

在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物包含核酸(例如基因)，其中基因的表達受啟動子調(diào)節(jié)。通常在相對于目標基因的合適位置處引入啟動子。例如，啟動子(例如誘導型啟動子)通常位于目標基因的轉(zhuǎn)錄起始位點5'。在某些實施方案中，核酸包括啟動基因(例如異源基因或內(nèi)源基因)表達所必需的啟動子和/或調(diào)節(jié)元件。啟動子可以是內(nèi)源啟動子、異源啟動子或其組合。在一些實施方案中，啟動子是組成型啟動子(例如，T7、SP6、T3或任何合適的組成型啟動子)。在一些實施方案中，微生物被遺傳改變以包括在誘導型啟動子的控制下的基因(例如，目標基因，必需基因)。誘導型啟動子通常是指導基因的條件表達的核酸序列。誘導型啟動子可以是內(nèi)源啟動子、異源啟動子或其組合。誘導型啟動子可以包含操縱子系統(tǒng)。誘導型啟動子通常被配置成調(diào)節(jié)基因(例如，目標基因，必需基因)的表達。在某些實施方案中，誘導型啟動子包含一個或多個基因、調(diào)節(jié)元件和/或基因產(chǎn)物(例如誘導型系統(tǒng))。在一些實施方案中，誘導型啟動子需要存在某些化合物、營養(yǎng)物、氨基酸、糖、肽、蛋白質(zhì)或條件(例如光、氧、熱、冷)以誘導基因活性(例如轉(zhuǎn)錄)。在某些實施方案中，誘導型啟動子包含一個或多個阻遏物元件。在一些實施方案中，誘導型啟動子(例如，包含阻遏物元件的啟動子)要求某些化合物、營養(yǎng)物、氨基酸、糖、肽、蛋白質(zhì)或條件不存在以誘導基因活性(例如轉(zhuǎn)錄)。任何合適的誘導型啟動子、系統(tǒng)或操縱子可用于調(diào)節(jié)基因(例如，必需基因)的表達。誘導型啟動子的非限制性實例包括乳糖調(diào)節(jié)系統(tǒng)(例如乳糖操縱子系統(tǒng))、糖調(diào)節(jié)系統(tǒng)、金屬調(diào)節(jié)系統(tǒng)、類固醇調(diào)節(jié)系統(tǒng)、醇調(diào)節(jié)系統(tǒng)、IPTG誘導系統(tǒng)、阿拉伯糖調(diào)節(jié)系統(tǒng)(例如阿拉伯糖操縱子系統(tǒng)，例如，ARA操縱子啟動子、pBAD、pARA、P_ARAE、_ARAE、_ARAR-P_araE、其部分、其組合等)，合成的氨基酸調(diào)節(jié)系統(tǒng)(例如參見Rovner AJ,et al.,(2015)Nature518(7537):89-93)、果糖阻遏物、tac啟動子/操縱子(pTac)、色氨酸啟動子、PhoA啟動子、recA啟動子、proU啟動子、cst-1啟動子、tetA啟動子、cadA啟動子、nar啟動子、P_L啟動子、cspA啟動子、類似物或其組合。在某些實施方案中，啟動子包含Lac-Z(LacZ)啟動子或其部分。在一些實施方案中，啟動子包含Lac操縱子或其部分。在一些實施方案中，誘導型啟動子包含阿拉伯糖(ARA)操縱子啟動子或其部分。在某些實施方案中，誘導型啟動子包含阿拉伯糖啟動子或其部分。阿拉伯糖啟動子可以從任何合適的細菌獲得。在某些實施方案中，誘導型啟動子包含大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的阿拉伯糖操縱子。在某些實施方案中，誘導型啟動子通過存在的糖或其類似物而被激活。糖和糖類似物的非限制性實例包括乳糖、阿拉伯糖(例如L-阿拉伯糖)、葡萄糖、蔗糖、果糖、IPTG等。

為了測量安全性，也可以對用于生產(chǎn)生物分子的微生物的使用進行控制。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物被工程化為營養(yǎng)缺陷型，其中微生物的生長和/或存活取決于存在的必需營養(yǎng)素。在一些實施方案中，本文的組合物包含這種必需營養(yǎng)素。營養(yǎng)缺陷型可以通過所提供的營養(yǎng)物質(zhì)的消耗來控制，以防止微生物過度生長，或從環(huán)境中除去微生物。例如，對于Trp營養(yǎng)缺陷型，供應的色氨酸可以被去除或耗盡以便減緩微生物生長或從環(huán)境中完全去除微生物。在Lys營養(yǎng)缺陷型的情況下，例如，可以從環(huán)境中除去所提供的賴氨酸以減緩Lys營養(yǎng)缺陷型的生長或?qū)⑵鋸沫h(huán)境中完全除去。在某些實施方案中，組合物包含氨基酸，例如賴氨酸(Lys)或色氨酸(Trp)。在一些實施方案中，所提供的營養(yǎng)物可以作為化合物施用于活化的局部組合物中，以便根據(jù)需要將微生物保持在環(huán)境中。

本文公開了制備用于受控表達用于治療的肽的核酸的方法。用于治療的肽的基因轉(zhuǎn)錄物可以通過本領域技術(shù)人員已知的標準分子克隆技術(shù)合成，并且可以用于轉(zhuǎn)化微生物以攜帶經(jīng)編碼的目標基因轉(zhuǎn)錄物。在某些實施方案中，誘導型啟動子包含操縱子。在一些實施方案中，核酸包括操縱子序列。操縱子可用于控制基因轉(zhuǎn)錄物的表達或用于在DNA水平的治療的肽的表達。在一些實施方案中，操縱子是lac操縱子。在一些實施方案中，操縱子是Trp操縱子。在一些實施方案中，操縱子是阻遏物操縱子。如本文所述的阻遏物操縱子是指由阻遏物控制的操縱子或可以通過結(jié)合操縱子或操縱子來抑制一個或多個基因的表達的DNA或RNA結(jié)合蛋白。在lac操縱子中，如果存在可結(jié)合操縱子并抑制RNA聚合酶結(jié)合的乳糖水平，則基因被關閉，從而減少目標基因的轉(zhuǎn)錄。trp操縱子也是通過可負抑制反饋機制來工作的阻遏物操縱子。trp操縱子的阻遏物是色氨酸，其可以結(jié)合操縱子并防止基因的轉(zhuǎn)錄。通過由操縱子控制目標基因的產(chǎn)生，可以通過向微生物提供阻遏物分子來控制所產(chǎn)生的分泌的生物分子的水平來控制用于治療的肽的產(chǎn)生水平。在一些實施方案中，用于治療的肽的表達可以通過添加阻遏物分子來抑制。在一些實施方案中，阻遏物分子是色氨酸。在一些實施方案中，阻遏物分子是乳糖。

本文所述的生物分子是指由活生物體產(chǎn)生的任何類型的分子。生物分子可包括但不限于大分子、蛋白質(zhì)、糖、多糖、脂質(zhì)、核酸、肽、代謝物、糖脂、甾醇、生長因子、激素、甘油脂、維生素、神經(jīng)遞質(zhì)、代謝物、酶、單體、低聚物、以及聚合物。生物分子可以由微生物產(chǎn)生。在某些實施方案中，目標基因編碼生物分子。在本文所述的若干實施方案中，描述了一些方法，其中經(jīng)遺傳修飾的微生物分泌生物分子。在若干實施方案中，描述了一些方法，其中經(jīng)遺傳修飾的微生物攜帶催化生物分子的產(chǎn)生的酶。在若干實施方案中，描述了一些方法，其中經(jīng)遺傳修飾的微生物攜帶催化生產(chǎn)透明質(zhì)酸的酶。在若干實施方案中，描述了一些方法，其中經(jīng)遺傳修飾的微生物攜帶催化黑色素的產(chǎn)生的酶。不同類型的生物分子可用于治療有需要的受試者。在一些實施方案中，受試者患有皮膚病、遺傳性疾病、疾病、自身免疫疾病、胃病、老化損傷和血友病。在一些實施方案中，受試者或有需要的受試者患有痤瘡。

在某些實施方案中，微生物被遺傳修飾以表達和/或分泌生長因子。生長因子可以是哺乳動物生長因子(例如，人生長因子)。

生長因子是天然存在的生物分子，其能夠起始和刺激細胞生長，引起細胞傳導信號、增殖、愈合和細胞分化。生長因子可以是蛋白質(zhì)或肽。在一些實施方案中，生長因子是激素(例如哺乳動物激素)。在某些實施方案中，通過引入編碼一種或多種生長因子(例如哺乳動物生長因子)的核酸來對細菌進行遺傳修飾。編碼生長因子的核酸可以包括：驅(qū)動生長因子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯(例如表達)的合適的啟動子和/或調(diào)節(jié)元件，編碼生長因子的開放閱讀框，以及在一些實施方案中，指導生長因子的微生物分泌的合適的核酸和/或肽元件。在某些實施方案中，通過引入兩種或更多種編碼一種或多種生長因子(例如，哺乳動物生長因子)的核酸來對細菌進行遺傳修飾。在某些實施方案中，通過引入指導一種或多種生長因子(例如，哺乳動物生長因子)的表達的核酸來對細菌進行遺傳修飾。在某些實施方案中，細菌被遺傳修飾以表達和/或分泌生長因子(例如哺乳動物生長因子)。

生長因子的幾個實例包括但不限于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、腎上腺髓質(zhì)素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌運動因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、表皮生長因子(EGF)、促紅細胞生成素(EPO)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長分化因子-9(GDF9)、愈合因子、肝細胞生長因子(HGF)、肝癌衍生生長因子(HDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、遷移刺激因子、肌肉生長抑制素(GDF-8)、神經(jīng)生長因子(NGF)以及其他神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、Wnt信號傳導通路、胎盤生長因子(PGF)、胎牛生長因子(FBS)、IL-3和IL-6的IL-1-輔因子、IL-2-T細胞生長因子、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物(例如細菌)分泌生長因子。

轉(zhuǎn)化生長因子β是在許多細胞類型中控制增殖、分化和其他功能的激素。許多細胞合成TGFB1并具有針對它的特異性受體。它積極和消極地調(diào)節(jié)許多其他生長因子。它在骨重建中起重要作用，因為它是成骨細胞骨形成的有效刺激物，引起定型成骨細胞中的趨化性、增殖和分化。在一些實施方案中，用于治療的肽包括轉(zhuǎn)化生長因子β。TGFB可用于一般美容、老化損傷、組織的一般老化，以通過吸引成纖維細胞，并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，且導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化生長因子β包括SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69。

肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)是用于旁分泌細胞生長、運動和形態(tài)發(fā)生因子的激素。它由間充質(zhì)細胞和靶分泌，并且可主要作用于上皮和內(nèi)皮細胞，但也作用于造血祖細胞。已經(jīng)顯示其在胚胎器官發(fā)育中，特別是在肌細胞生成中，在成年器官再生和傷口愈合中具有主要作用。

例如，受體酪氨酸-蛋白激酶(MET)可以通過結(jié)合肝細胞生長因子/HGF配體將信號從細胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)導到細胞質(zhì)中。這個過程可以調(diào)節(jié)許多生理過程，包括增殖、散射、形態(tài)發(fā)生和存活。在細胞表面的配體結(jié)合誘導MET的自磷酸化，在其細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上為下游傳導信號的分子提供停泊位點。在被配體激活后，存在與PI3-激酶亞基PIK3R1、PLCG1、SRC、GRB2、STAT3或銜接子GAB1的相互作用。通過MET募集這些下游效應物導致幾種信號傳導級聯(lián)反應的激活，該級聯(lián)反應包括RAS-ERK、PI3激酶-KKT或PLCγ-PKC級聯(lián)反應。RAS-ERK激活與形態(tài)發(fā)生效應相關，而PI3K/AKT協(xié)調(diào)促生存效應。在胚胎發(fā)育期間，MET信號傳導在原腸胚形成、肌肉和神經(jīng)元前體的發(fā)育和遷移、血管生成和腎形成中起作用。在成人中，級聯(lián)反應參與傷口愈合、以及器官再生和組織重塑。

肝細胞生長因子可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞，并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，且導致更厚、更年輕的皮膚。該過程還可以促進造血細胞的分化和增殖。在一些實施方案中，用于治療的肽包括肝細胞生長因子。在一些實施方案中，肝細胞生長因子包括SEQ ID NO:70。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是由細胞產(chǎn)生的刺激血管形成(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)的信號蛋白。它是系統(tǒng)的一部分，該部分在血液循環(huán)不足時恢復對組織的氧供應。VEGF的正常功能是創(chuàng)建在胚胎發(fā)育期間的新血管、損傷后的新血管、運動后的肌肉和繞過阻塞血管的新血管。VEGF可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。

VEGF-A是在血管生成、血管形成和內(nèi)皮細胞生長中有活性的生長因子。VEGF-A誘導內(nèi)皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制凋亡和誘導血管的透化。VEGF-A結(jié)合FLT1/VEGFR1和KDR/VEGFR2受體、硫酸肝素和肝素。NRP1/神經(jīng)氈蛋白-1結(jié)合同種型VEGF-165和VEGF-145。同種型VEGF165B結(jié)合KDR，但不激活下游信號傳導通路，不激活血管生成，并抑制腫瘤生長。在一些實施方案中，用于治療的肽包括VEGF-A。在一些實施方案中，VEGF-A包括SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,或SEQ ID NO:87。

VEGF-B是內(nèi)皮細胞的生長因子。VEGF-B167結(jié)合肝素和神經(jīng)氈蛋白-1，而與VEGF-B186的神經(jīng)氈蛋白-1的結(jié)合受蛋白水解調(diào)節(jié)。在一些實施方案中，用于治療的肽包括VEGF-B。在一些實施方案中，VEGF-B包括SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89。

VEGF-C是在血管生成和內(nèi)皮細胞生長中具有活性的生長因子，刺激它們的增殖和遷移，并且還對血管的通透性具有影響。VEGF-C可以在胚胎發(fā)生期間的靜脈和淋巴血管系統(tǒng)的血管生成中起作用，并且還在維持成年人中分化的淋巴內(nèi)皮中起作用。VEGF-C可以結(jié)合并激活VEGFR-2(KDR/FLK1)和VEGFR-3(FLT4)受體。在一些實施方案中，用于治療的肽包括VEGF-C。在一些實施方案中，VEGF-C包括SEQ ID NO:90。

VEGF-D(c-Fos誘導的生長因子或FIGF)是在血管生成、淋巴管生成和內(nèi)皮細胞生長中具有活性的生長因子，刺激它們的增殖和遷移，并且還對血管的通透性具有影響。VEGF-D可以在胚胎發(fā)生期間的靜脈和淋巴血管系統(tǒng)的形成中起作用，并且還在維持成年人中分化的淋巴內(nèi)皮中起作用。VEGF-D可以結(jié)合并激活VEGFR-2(KDR/FLK1)和VEGFR-3(FLT4)受體。在一些實施方案中，用于治療的肽包括VEGF-D。在一些實施方案中，VEGF-D包括SEQ ID NO:91。

胎盤生長因子(PGF)是VEGF家族的成員，并且可以在胚胎發(fā)生期間在血管生成和血管形成中起作用。PGF在血管生成和內(nèi)皮細胞生長中具有活性，刺激它們的增殖和遷移。它結(jié)合受體FLT1/VEGFR-1。同種型PlGF-2以肝素依賴性方式結(jié)合NRP1/神經(jīng)氈蛋白-1和NRP2/神經(jīng)氈蛋白-2。PFG還可以促進細胞腫瘤生長。PGF可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括PGF。在一些實施方案中，PGF包括SEQ ID NO:92。

血小板衍生生長因子亞基A(PDGFA)在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞遷移、存活和趨化性的調(diào)節(jié)中起重要作用。PDGFA是間充質(zhì)起源的細胞的有效促分裂原。PDGFA是在胚胎發(fā)生、胃腸道正常發(fā)育、Leydig細胞正常發(fā)育和精子發(fā)生過程中正常肺泡間隔形成所需的。PDGFA是在脊髓和小腦中的正常少突膠質(zhì)細胞發(fā)育和正常髓鞘形成所需的。PDGFA在傷口愈合中起重要作用。傳導信號也可以通過與PDGFB形成異二聚體來調(diào)節(jié)。

PDGFA可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括PDGFA。在一些實施方案中，PDGFA包括SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94。

血小板衍生生長因子亞基B(PDGFB)在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞遷移、存活和趨化性的調(diào)節(jié)中起重要作用。PDGFB是間充質(zhì)起源的細胞的有效促分裂原。PDGFB是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肺、心臟和胎盤中的周細胞和血管平滑肌細胞的正常增殖和募集所需的。PDGFB是正常血管發(fā)育和腎小球正常發(fā)育所需的。PDGFB在傷口愈合中起重要作用。傳導信號也可以通過PDGFB與PDGFA形成異二聚體來調(diào)節(jié)。PDGFB可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括PDGFB。在一些實施方案中，PDGFB包括SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:96。

血小板衍生生長因子C(PDGFC)在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞遷移、存活和趨化性的調(diào)節(jié)中起重要作用。PDGFC是間充質(zhì)起源的細胞的有效促分裂原和化學引誘劑。PDGFC是在胚胎發(fā)育期間正常骨骼形成所需的，特別是顱面骨骼的正常發(fā)育和腭的正常發(fā)育所需的。PDGFC是胚胎發(fā)育期間正常皮膚形態(tài)發(fā)生所需的。PDGFC在傷口愈合中起重要作用，其中其似乎涉及三個階段：發(fā)炎、增殖和重塑。PDGFC在血管生成和血管發(fā)育中起重要作用，并且參與纖維化過程，其中發(fā)生間質(zhì)成纖維細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞加上膠原沉積。PDGFC的CUB結(jié)構(gòu)域在冠狀動脈平滑肌細胞中具有促有絲分裂活性，這表明超過維持PDGF結(jié)構(gòu)域的潛伏期的作用。在核中，PDGFC似乎具有額外的功能。PDGFC可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括PDGFC。在一些實施方案中，PDGFC包括或SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100。

血小板衍生生長因子D(PDGFD)在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞遷移、存活和趨化性的調(diào)節(jié)中起重要作用。PDGFD是間充質(zhì)來源的細胞的有效促分裂原。PDGFD在傷口愈合中起重要作用。PDGFD在血管生成期間誘導巨噬細胞募集、增加的間質(zhì)壓力和血管成熟。PDGFD可以引發(fā)導致腎小球膜增生性腎小球腎炎的事件，包括單核細胞和巨噬細胞的流入和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。PDGFD可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括PDGFD。在一些實施方案中，PDGFB包括SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102。

用于表皮生長因子(EGF)的基因編碼表皮生長因子超家族的成員。所編碼的蛋白質(zhì)合成成為大前體分子，其被蛋白水解切割以產(chǎn)生53個氨基酸的表皮生長因子肽。這種蛋白質(zhì)作為有效的促有絲分裂因子，在許多細胞類型的生長、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。這種蛋白質(zhì)通過結(jié)合高親和力細胞表面受體—表皮生長因子受體而發(fā)揮作用。該基因的缺陷是4型低鎂血癥的原因。該基因的失調(diào)與某些癌癥的生長和進展有關。選擇性剪接導致多個轉(zhuǎn)錄物變體和同種型。Pro-EGF可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括Pro-EGF。Pro-EGF可以由于可變剪接而具有同種型。在一些實施方案中，Pro-EGF包括SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:106。

成纖維細胞生長因子(FGF)在細胞存活、細胞分裂、血管生成、細胞分化和細胞遷移的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF可以作為體外的有效的有絲分裂原。FGF可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，并導致更厚、更年輕的皮膚。有FGF的22種不同的同種型。

在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF1。在一些實施方案中，F(xiàn)GF1包括SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:108。

FGF2具有通過替代起始產(chǎn)生的4種同種型。FGF2在細胞存活、細胞分裂、血管生成、細胞分化和細胞遷移的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF2作為體外的有效的促分裂原。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF2。在一些實施方案中，F(xiàn)GF2包括SEQ ID NO:109，SEQ ID NO:110，SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112。

FGF3具有1種同種型，并且在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞分化的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF3是正常耳朵發(fā)育所需的。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF3。在一些實施方案中，F(xiàn)GF3包括SEQ ID NO:113。

FGF4可以由于選擇性剪接而具有兩種同種型。FGF4在細胞存活、細胞分裂、血管生成、細胞分化和細胞遷移的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF4可以作為體外的有效的促分裂原。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF4。在一些實施方案中，F(xiàn)GF4包括SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115。

FGF5可以由于選擇性剪接而具有兩種同種型。FGF5可以在細胞增殖和細胞分化的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF5是正常調(diào)節(jié)毛發(fā)生長周期所需的。FGF5可以通過促進從毛囊的生長期(生長階段)進入退化期(凋亡誘導的退化期)而起到毛發(fā)伸長的抑制劑的作用。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF5。在一些實施方案中，F(xiàn)GF5包括SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117。

FGF6同種型在細胞增殖、細胞分化、血管發(fā)生和肌發(fā)生的調(diào)節(jié)中起重要作用，并且是正常肌肉再生所需的。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF6。在一些實施方案中，F(xiàn)GF6包括SEQ ID NO:118。

FGF7(角質(zhì)形成細胞生長因子，KGF)具有一種同種型，并在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞分化的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF7是正常分支形態(tài)發(fā)生所需的。該生長因子對角質(zhì)形成細胞特別有活性。FGF7是正常上皮細胞增殖的可能的主要旁分泌效應子。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF7。在一些實施方案中，F(xiàn)GF7包括SEQ ID NO:119。

FGF8由于選擇性剪接而具有四種同種型，并在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化和細胞遷移的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF8是在胚胎發(fā)生過程中正常的腦、眼、耳和肢體發(fā)育所需的。FGF8是促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元系統(tǒng)正常發(fā)育所需的。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF8。在一些實施方案中，F(xiàn)GF8包括SEQ ID NO:120，SEQ ID NO:121，SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:123。

FGF9具有一種同種型，并在胚胎發(fā)育、細胞增殖、細胞分化和細胞遷移的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF9在發(fā)育期間的神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長和分化，在腦組織的損傷之后的修復和再生期間的神經(jīng)膠質(zhì)增生癥，神經(jīng)元細胞的分化和存活，以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長刺激中會具有作用。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF9。在一些實施方案中，F(xiàn)GF9包括SEQ ID NO:124。

FGF10(KGF2)具有一種同種型，并且在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞分化的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF10是正常分支形態(tài)發(fā)生所需的。FGF10可以在傷口愈合中起作用。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF10。在一些實施方案中，F(xiàn)GF10包括SEQ ID NO:125。

FGF11具有一種同種型并參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF11。在一些實施方案中，F(xiàn)GF11包括SEQ ID NO:126。

FGF12由于選擇性剪接而具有兩種同種型，并且參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF12。在一些實施方案中，F(xiàn)GF12包括SEQ ID NO:127或SEQ ID NO:128。

FGF13具有通過選擇性剪接產(chǎn)生的5種同種型。FGF13是直接結(jié)合微管蛋白并且參與微管的聚合和穩(wěn)定的微管結(jié)合蛋白。通過其對微管的作用，F(xiàn)GF13可以通過負調(diào)節(jié)軸突和主導過程分支參與軸突的細化。FGF13在大腦皮層和海馬中的神經(jīng)元極化和遷移中起關鍵作用。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF13。在一些實施方案中，F(xiàn)GF13包括或SEQ ID NO:129，SEQ ID NO:130，SEQ ID NO:131，SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:133。

FGF14具有通過選擇性剪接產(chǎn)生的兩種同種型，并且參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF14。在一些實施方案中，F(xiàn)GF14包括SEQ ID NO:134或SEQ ID NO:135。

FGF16具有一種同種型，并在胚胎發(fā)育、細胞增殖和細胞分化的調(diào)節(jié)中起重要作用，并且是正常心肌細胞增殖和心臟發(fā)育所需的。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF16。在一些實施方案中，F(xiàn)GF16包括SEQ ID NO:136。

FGF17由于選擇性剪接而具有兩種同種型，并且在胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)中起重要作用且在胚胎腦的誘導和圖案化中作為傳導信號的分子。FGF17是正常腦發(fā)育所需的。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF17。在一些實施方案中，F(xiàn)GF17包括SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138。

FGF18具有一種同種型，并在細胞增殖、細胞分化和細胞遷移的調(diào)節(jié)中起重要作用。FGF18是正常骨化和骨發(fā)育所需的。FGF18刺激肝和腸的增殖。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF18。在一些實施方案中，F(xiàn)GF18包括SEQ ID NO:139。

FGF19具有一種同種型，并且通過在正調(diào)節(jié)JNK和ERK1/2級聯(lián)后下調(diào)CYP7A1的表達來參與膽汁酸生物合成的抑制。FGF19刺激脂肪細胞中的葡萄糖攝取。FGF19的活性要求存在KLB和FGFR4。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF19。在一些實施方案中，F(xiàn)GF19包括SEQ ID NO:140。

FGF20具有一種同種型并且作為調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)發(fā)育和功能的神經(jīng)營養(yǎng)因子起作用。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF20。在一些實施方案中，F(xiàn)GF20包括SEQ ID NO:141。

FGF21具有一種同種型并且通過誘導葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白SLC2A1/GLUT1表達(但不是SLC2A4/GLUT4表達)刺激分化的脂肪細胞中的葡萄糖攝取。FGF21的活性要求存在KLB。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF21。在一些實施方案中，F(xiàn)GF21包括SEQ ID NO:142。

FGF22具有一種同種型，并在空腹反應、葡萄糖體內(nèi)平衡、脂肪分解和脂肪生成中起作用。FGF22可以在體外刺激細胞增殖，并且可以參與毛發(fā)發(fā)育。在一些實施方案中，分泌FGF22的細胞可用于治療禿發(fā)。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF22。在一些實施方案中，F(xiàn)GF22包括SEQ ID NO:143。

FGF23具有一種同種型并且是磷酸鹽穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑。FGF23通過降低SLC34A1水平來抑制腎小管磷酸鹽轉(zhuǎn)運，并且可以在KL存在時上調(diào)EGR1表達。FGF23直接作用于甲狀旁腺以減少PTH分泌。FGF23也是維生素D代謝的調(diào)節(jié)劑，并且可以負調(diào)節(jié)成骨細胞分化和基質(zhì)礦化。在一些實施方案中，用于治療的肽包括FGF23。在一些實施方案中，F(xiàn)GF23包括SEQ ID NO:144。

激素是一類在所有生物體中由腺體產(chǎn)生并通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至遠處的靶器官以協(xié)調(diào)其生理學、功能和行為的調(diào)節(jié)生物化學物質(zhì)。激素可以充當不同器官和組織之間的主要的通信形式。激素調(diào)節(jié)各種生理和行為活動，包括消化、新陳代謝、呼吸、組織功能、感覺知覺、睡眠、知覺、壓力、生長和發(fā)育、運動和繁殖。在一些實施方案中，用于治療的肽包括激素。激素可以由患有由受試者中的低激素產(chǎn)生而促成的疾病的受試者使用。在某些實施方案中，通過引入編碼激素(例如，哺乳動物激素)的核酸來對細菌進行遺傳修飾。在某些實施方案中，細菌被遺傳修飾以表達和/或分泌激素(例如，哺乳動物激素)。在某些實施方案中，激素是促生長素。在某些實施方案中，激素是哺乳動物促生長素。在某些實施方案中，激素是牛促生長素或人促生長素。在某些實施方案中，促生長素是生長激素(GH)。

促生長素是在生長控制中起重要作用的激素。它在刺激身體生長中的主要作用是刺激肝臟和其他組織分泌IGF-1。它刺激成肌細胞的分化和增殖。它還刺激肌肉和其他組織中的氨基酸攝取和蛋白質(zhì)合成。在一些實施方案中，用于治療的肽包括促生長素。在一些實施方案中，促生長素包括SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49。促生長素可以由患有低人促生長素(HGH)產(chǎn)生的受試者或患有低睪酮產(chǎn)生的受試者使用。在一些實施方案中，包含用于表達肽的核酸的細胞包括用于促生長素的氨基酸序列。由于微生物可以具有能夠進入真皮的角質(zhì)層下并進入毛孔的能力的益處，所以，皮膚將具有更好的和增加的機會來吸收這些局部施加物，這是與分子本身通過洗劑或乳膏局部施用的情況相比而言的。向有需要的受試者遞送微生物產(chǎn)生的激素的一個益處是，這種方法降低了激素暴露于其他受試者的風險。因為在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物經(jīng)常根據(jù)僅提供給有需要的受試者的必需營養(yǎng)物而被工程化。因此，向有需要的受試者遞送微生物產(chǎn)生的激素會比提供局部激素的其它方法更安全，其他方法通?？蓪е虏幌Ｍ械霓D(zhuǎn)移該局部激素到其他受試者。

抗炎劑是減輕炎癥的物質(zhì)或治療劑。白介素(IL)是一組可以作為傳導信號的分子并作為抗炎劑的細胞因子。抗炎劑可以用于有需要的患有炎性病癥(例如痤瘡)的受試者。分泌抗炎劑的微生物相對于含有抗炎劑的乳膏具有優(yōu)勢，因為微生物具有能夠進入真皮的角質(zhì)層下并進入孔中的能力，從而增大吸收這些抗炎劑的機會。

在一些實施方案中，微生物被遺傳修飾以表達和/或分泌抗炎劑。在某些實施方案中，抗炎劑是細胞因子。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物分泌細胞因子。細胞因子的非限制性實例包括IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10和IL-13。在某些實施方案中，通過引入編碼一種或多種細胞因子(例如，哺乳動物細胞因子)的核酸來對細菌進行遺傳修飾。編碼細胞因子的核酸可以包括：驅(qū)動細胞因子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯(例如表達)的合適的啟動子和/或調(diào)節(jié)元件，編碼細胞因子的開放閱讀框，以及在一些實施方案中，指導細胞因子的微生物分泌的合適的核酸酸和/或肽元件。在某些實施方案中，通過引入編碼兩種或更多種細胞因子(例如，哺乳動物細胞因子)的兩種或更多種核酸來對細菌進行遺傳修飾。在某些實施方案中，通過引入指導一種或多種細胞因子(例如，哺乳動物細胞因子)的表達的核酸來對細菌進行遺傳修飾。在某些實施方案中，細菌被遺傳修飾以表達和/或分泌細胞因子(例如，哺乳動物細胞因子)。

白介素4(IL-4)可參與至少幾種B細胞活化過程以及其它細胞類型的活化過程。它是DNA合成的共刺激劑。它誘導II型MHC分子在靜息B細胞上的表達。它增強IgE和IgG1的分泌和細胞表面表達。它還調(diào)節(jié)淋巴細胞和單核細胞上IgE(CD23)的低親和力Fc受體的表達。在一些實施方案中，用于治療的肽包括白介素4或其一部分。在一些實施方案中，白介素4包括SEQ ID NO:24。

白介素10(IL-10)可以抑制許多細胞因子的合成，這些細胞因子包括由活化的巨噬細胞以及由輔助T細胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。在一些實施方案中，用于治療的肽包括白介素10或其一部分。在一些實施方案中，白介素10包括SEQ ID NO:25。

白介素13(IL-13)是抑制炎性細胞因子產(chǎn)生的細胞因子。白介素13與白介素2(IL2)協(xié)同調(diào)節(jié)干擾素-γ合成。白介素13在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應中是關鍵的。在一些實施方案中，用于治療的肽包括白介素13或其一部分。在一些實施方案中，白介素13包括SEQ ID NO:26。

白介素-1受體2型(IL1R2)是用于IL1A、IL1B和IL1RN的非傳導信號受體。IL1R2降低IL1B活性。在某些實施方案中，細菌被遺傳修飾以表達和/或分泌IL1R2。IL1R2可通過與IL1B的競爭性結(jié)合并防止其與IL1R1的結(jié)合而充當誘餌受體。IL1R2還可以在結(jié)合IL1B后通過與IL1RAP的非傳導信號締合來調(diào)節(jié)細胞反應。IL1R2(膜和分泌形式)優(yōu)先結(jié)合IL1B以及不良地結(jié)合IL1A和IL1RN。分泌的IL1R2以高親和力募集分泌的IL1RAP；這種復合物形成可以是通過分泌/可溶性受體中和IL1B的主要機制。在一些實施方案中，用于治療的肽包括IL1R2或其一部分。在一些實施方案中，白介素13包括SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28。

透明質(zhì)酸或HA/透明質(zhì)酸是由稱為透明質(zhì)酸合酶的一類內(nèi)在膜蛋白合成的生物分子，其中脊椎動物有三種類型：HAS1，HAS2和HAS3。它是廣泛分布在整個結(jié)締組織、上皮組織和神經(jīng)組織的陰離子型的糖胺聚糖。透明質(zhì)酸是非硫酸化的，并在質(zhì)膜而不是高爾基體(Golgi)中形成，并且可以非常大，分子量通常達到數(shù)百萬(以KDa計)。細胞外基質(zhì)的主要成分之一，透明質(zhì)酸顯著促進細胞增殖和遷移，并且還可以參與一些惡性腫瘤的進展。

HAS1催化GlcNAc或GlcUA單糖朝新生透明質(zhì)酸聚合物的添加。它在透明質(zhì)酸合成中是基本的，因為透明質(zhì)酸是大多數(shù)細胞外基質(zhì)的主要組分，其在組織結(jié)構(gòu)中具有結(jié)構(gòu)作用并調(diào)節(jié)細胞粘附、遷移和分化。

HAS1是催化將GlcNAc或GlcUA單糖添加到透明質(zhì)酸聚合物的反應的同功酶之一。HAS1還能夠基于底物催化殼寡糖的合成。HAS2催化GlcNAc或GlcUA單糖朝新生透明質(zhì)酸聚合物的添加。HAS2是催化該反應的同功酶之一，并且它特別負責高分子量透明質(zhì)酸的合成。HAS 2是心內(nèi)膜墊細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞所必需的，該轉(zhuǎn)化是心臟發(fā)育的關鍵過程。HAS2也可以在血管形成中發(fā)揮作用。高分子量透明質(zhì)酸也可以在早期接觸抑制中起作用，該早期接觸抑制是當細胞彼此接觸或與細胞外基質(zhì)接觸時停止細胞生長的過程。HAS3催化GlcNAc或GlcUA單糖朝新生透明質(zhì)酸聚合物的添加。

作為療法，可以用含有透明質(zhì)酸鈉作為活性成分的處方皮膚洗劑來治療干燥、鱗狀皮膚，其也稱為干燥病，例如由特應性皮炎或濕疹引起的干燥病。在本文所述的若干實施方案中，提供了編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或其部分的核酸。在若干實施方案中，細胞可以攜帶編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或其部分的核酸。在一些實施方案中，透明質(zhì)酸合酶包括HAS1(SEQ ID NO:1)、HAS2(SEQ ID NO:2)、HAS3同種型1(SEQ ID NO:3)或HAS3同種型2(SEQ ID NO:4)。透明質(zhì)酸可用于一般美容，使皮膚豐滿以減少皺紋。在一些實施方案中，攜帶編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶或其部分的核酸的細胞會導致透明質(zhì)酸的產(chǎn)生。在若干實施方案中，用于治療的肽可用于一般美容。由于細胞可以在孔和毛囊中增殖和定位，因此與局部施用的含有透明質(zhì)酸的洗劑相比，透明質(zhì)酸的吸收增加。在一些實施方案中，對有需要的患有干燥病的受試者施用包含具有編碼透明質(zhì)酸合酶或其部分的核酸的細胞的局部制劑。

彈性蛋白是例如主動脈和頸韌帶等組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其必須快速擴張并完全恢復。彈性蛋白是晚期動脈形態(tài)發(fā)生的分子決定因素，它還可以通過調(diào)節(jié)血管平滑肌的增殖和組織來穩(wěn)定動脈結(jié)構(gòu)。彈性蛋白可用于促進皮膚彈性，因為它可以容易地被皮膚吸收。在一些實施方案中，用于治療的肽包括彈性蛋白或其部分。由于微生物可以具有具備進入真皮的角質(zhì)層下并進入孔中的能力的益處，因此皮膚將具有從細菌吸收彈性蛋白的更好的和增加的機會，這是與通過洗劑或乳膏局部施用彈性蛋白相比而言的。

在一些實施方案中，彈性蛋白或其部分包括SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,或SEQ ID NO:17。

膠原是動物中各種結(jié)締組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白。膠原以細長原纖維的形式存在于纖維組織、肌腱、韌帶、皮膚中，并且在角膜、軟骨、骨、血管、腸和椎間盤中也是豐富的。膠原主要由成纖維細胞產(chǎn)生。膠原由三螺旋組成，該三螺旋由兩個相同的a1鏈和在化學組成上可以不同的額外的鏈組成。膠原的氨基酸組成可具有高羥脯氨酸含量。在一些實施方案中，用于治療的肽包括膠原或其部分。膠原蛋白可以被皮膚吸收以添加到細胞外基質(zhì)并增加真皮厚度。由于微生物可以具有具備進入真皮的角質(zhì)層下并進入孔中的能力的益處，因此皮膚將具有從細菌吸收膠原的更好的和增加的機會，這是與通過洗劑或乳膏局部施用這些分子本身相比而言的。在一些實施方案中，包括膠原或其部分的用于治療的肽包括SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23。

如本文所述的凝血因子是指可以導致血液凝固或凝結(jié)的化學和細胞成分。凝血因子可以通過有需要的患有血友病的受試者外部使用，或者由在血液稀釋劑治療下的受試者使用。血液稀釋劑可以包括魚油、阿司匹林、抗血小板藥物和其他類型的抗凝劑?？鼓齽┛梢园ǖ幌抻诳寡▌⒗w維蛋白溶解劑和溶栓劑。

凝血因子VIII是多銅氧化酶家族的成員。凝血因子VIII是因子IXa的輔因子，其在Ca⁺²和磷脂存在下將因子X轉(zhuǎn)化為活化形式Xa。凝血因子VIII是凝血輔因子，其循環(huán)結(jié)合于血管性血友病(von Willebrand)因子并且是內(nèi)在凝血途徑的一部分。它是由兩個獨立實體組成的大分子復合物，其中一個在缺乏時導致血友病A，另一個在缺乏時導致von Willebrand氏病。血友病A是血液凝固的病癥，其特征在于出現(xiàn)永久性出血傾向。在一些實施方案中，用于治療的肽包括凝血因子VIII。在一些實施方案中，凝血因子VIII包括SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30。在一些實施方案中，用于治療的肽包括200kDa的同種型中的凝血因子VIII重鏈。在一些實施方案中，200kDa的凝血因子VIII重鏈包括SEQ ID NO:31。在一些實施方案中，用于治療的肽包括92kDa的同種型中的凝血因子VIII重鏈。在一些實施方案中，92kDa的凝血因子VIII重鏈包括SEQ ID NO:32。在一些實施方案中，用于治療的肽包括凝血因子VIII B鏈。在一些實施方案中，凝血因子VIII B鏈包括SEQ ID NO:33。在一些實施方案中，用于治療的肽包括凝血因子VIIIa輕鏈。在一些實施方案中，凝血因子VIIIa輕鏈包括SEQ ID NO:34。

因子IX是維生素K依賴性血漿蛋白，其通過在Ca²⁺離子、磷脂和因子VIIIa的存在下將因子X轉(zhuǎn)化為其活性形式而參與血液凝固的內(nèi)在途徑。在一些實施方案中，用于治療的肽是因子IX。在一些實施方案中，因子IV包括SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39。

在皮膚中的黑色素由黑素細胞產(chǎn)生，黑素細胞存在于表皮的基底層。盡管通常人類在其皮膚中具有相似濃度的黑素細胞，但是一些個體和種族群體中的黑素細胞更頻繁或更不頻繁地表達產(chǎn)生黑色素的基因，從而賦予更大或更小濃度的皮膚黑色素。

酪氨酸酶是一種氧化酶，是控制黑色素產(chǎn)生的限速酶。酪氨酸酶參與單酚的羥基化和鄰二酚轉(zhuǎn)化成相應的鄰醌。鄰醌經(jīng)歷若干次反應，最終形成黑色素。在一些實施方案中，用于治療的肽通過酪氨酸酶或其片段產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述酪氨酸酶包括SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。在一些實施方案中，細胞可以包含例如編碼酪氨酸酶或其片段的核酸。在一些實施方案中，微生物產(chǎn)生用于酶促產(chǎn)生黑色素的酪氨酸酶。由于微生物可以具有具備進入真皮的角質(zhì)層下并進入孔中的能力的益處，因此皮膚將具有吸收這些局部用藥(topicals)的更好的和增加的機會，這是與通過洗劑或乳膏局部施用這些分子本身相比而言的。黑色素的產(chǎn)生可用于“無陽光”鞣制，以增加受試者的黑色素。

趨化因子是由細胞分泌的作為傳導信號分子的小細胞因子家族。歸類為趨化因子的蛋白質(zhì)尺寸小(尺寸為8-10KDa)，并且在保守位置具有四個保守的半胱氨酸殘基，它們在趨化因子中形成保守的三維形狀。趨化因子可以被認為是促炎性的，并且可以在免疫應答期間被誘導以將免疫系統(tǒng)的細胞募集到感染部位，而其他被認為是內(nèi)穩(wěn)態(tài)的，并且參與控制在組織維持或發(fā)育的正常過程期間的細胞遷移。趨化因子存在于所有脊椎動物、一些病毒和一些細菌中，但對于其他無脊椎動物沒有描述過。在一些實施方案中，用于治療的肽包括趨化因子。

血小板堿性蛋白(LA-PF4)屬于趨化因子家族。LA-PF4刺激DNA合成、有絲分裂、糖酵解、細胞內(nèi)cAMP積聚、前列腺素E2分泌、以及透明質(zhì)酸和硫酸化糖胺聚糖的合成。它還刺激人滑膜細胞形成和分泌纖溶酶原激活物。NAP-2是CXCR1和CXCR2的配體，并且NAP-2、NAP-2(73)、NAP-2(74)、NAP-2(1-66)和最有效的NAP-2(1-63)是中性粒細胞的化學引誘劑和活化劑。TC-1和TC-2是抗菌蛋白，在體外從活化的血小板α粒釋放。CTAP-III(1-81)比CTAP-III更有效地減弱趨化因子誘導的嗜中性粒細胞活化。LA-PF4可用于一般美容，以通過吸引成纖維細胞，并使它們產(chǎn)生細胞外基質(zhì)而引起更年輕的皮膚，且導致更厚、更年輕的皮膚。在一些實施方案中，用于治療的肽包括血小板堿性蛋白。在一些實施方案中，血小板堿性蛋白包括SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:62。

DNA修復酶用于修復被活性氧物質(zhì)損壞的DNA，復制錯誤，由諸如紫外線、毒素、誘變化學品、DNA插入劑和病毒等外部因素引起的外源損傷。有幾種類型的損傷，這些損傷可能是堿的氧化、堿的烷基化、脫氨、脫嘌呤、堿錯配、單加合物損傷和二加合物損傷。DNA修復酶可用于抗衰老，以及通過太陽損傷/輻射逆轉(zhuǎn)DNA損傷。

堿基切除修復(BER)是在細胞周期中修復受損DNA的機制，從基因組中去除小的非螺旋扭曲的堿基損傷。BER是非常重要的，因為其移除在復制期間可能通過錯配導致突變或?qū)е翫NA中斷的受損的堿基。該過程由DNA糖基化酶啟動，DNA糖基化酶可以識別和去除受損或不適當?shù)膲A基，形成AP位點。然后AP位點被AP內(nèi)切核酸酶切割，導致單鏈斷裂，然后可以通過短或長的修補過程進行處理。

在一些實施方案中，用于治療的肽包括堿基切除修復(BER)酶。在一些實施方案中，BER酶包括SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:147,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:149,SEQ ID NO:150,SEQ ID NO:151,SEQ ID NO:152,SEQ ID NO:153,SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:155。

DNA損傷的直接逆轉(zhuǎn)是恢復受損DNA的另一種修復機制。嘧啶二聚體的形成是由UV光引起的主要類型的損傷。損傷扭曲DNA雙螺旋并阻斷轉(zhuǎn)錄或復制通過受損部位。在一些實施方案中，用于治療的肽包括用于直接逆轉(zhuǎn)DNA損傷的酶。在一些實施方案中，用于直接逆轉(zhuǎn)DNA損傷的酶包括SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:157或SEQ ID NO:158。

DNA錯配修復蛋白涉及具有可能源自DNA復制和重組過程以及源自DNA損傷的錯誤插入、缺失和錯誤摻入堿基的核酸的識別和修復。在一些實施方案中，用于治療的肽包括用于DNA錯配修復的酶。在一些實施方案中，用于DNA錯配修復的酶包括SEQ ID NO:159,SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:162,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168。

核苷酸切除修復(NER)是去除由紫外光引起的DNA損傷的DNA修復機制。紫外線的損傷可導致DNA加合物，其可由胸腺嘧啶二聚體和6,4-光產(chǎn)物組成。NER蛋白識別導致包含損傷的短單鏈DNA片段的去除的損傷。然后通過DNA聚合酶將未損傷的互補序列用作模板，以合成短的互補序列，其隨后通過DNA連接酶連接。在一些實施方案中，用于治療的肽包括用于核苷酸切除修復的酶。在一些實施方案中，用于核苷酸切除修復的酶包括或SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:170,SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:174,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:180,SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:186,SEQ ID NO:187,SEQ ID NO:188,SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190,SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:192,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:196,或SEQ ID NO:197。

DNA編輯和加工涉及使用幾種類型的核酸酶并參與DNA復制和修復。例如，DNase(DNA酶)IV可以去除DNA修復中的5'端突出的襟翼，并在滯后鏈DNA合成中處理Okazaki片段的5'端。在長斑塊堿基切除修復期間，該蛋白質(zhì)與AP內(nèi)切核酸酶1之間的直接物理相互作用使蛋白質(zhì)協(xié)調(diào)加載到底物上，因此將底物從一種酶傳遞到另一種酶。該蛋白是XPG/RAD2核酸內(nèi)切酶家族的成員，并且是無細胞DNA復制所必需的十種蛋白質(zhì)之一。

MTMR15，也稱為肌管蛋白相關蛋白，是涉及修復由交聯(lián)劑引起的DNA損傷的DNA內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶。FAN1通過與蛋白質(zhì)復合物FANCI-FANCD2復合物相互作用而募集到鏈間交聯(lián)連接損傷的位點。這些蛋白質(zhì)一起以嚴格依賴于其在DNA損傷位點或其附近積聚的能力并且依賴于FANCI-FANCD2復合物的單泛素化的方式促進鏈間交聯(lián)修復。

DNase III或TREX1是廣泛分布在增殖和非增殖哺乳動物組織中的主要核DNA特異性3'-5'外切核酸酶。DNase III在DNA損傷后通過γ-照射或羥基脲在S期轉(zhuǎn)位到核。DNase III在修復中優(yōu)選單鏈DNA。

TREX2編碼3'核酸酶。所編碼的蛋白質(zhì)可以參與雙鏈DNA斷裂修復，并且可以與DNA聚合酶δ相互作用。TREX2可以去除錯配的、修飾的、片段化的和正常的核苷酸，以便為DNA代謝途徑中的后續(xù)步驟產(chǎn)生3'末端。

EXO1/HEX1是一種803個氨基酸的人類蛋白，其在DNA復制、修復和重組中起作用。EXO1/HEX1可以參與錯配引發(fā)的切除，該切除由位于錯配對的5'端或3'端的鏈斷裂引導。

Aprataxin(APTX)是涉及DNA的編輯和加工的另一種蛋白質(zhì)。APTX在單鏈DNA修復中通過在非同源末端連接期間連接DNA連接酶IV之后除去AMP形式的DNA末端而起作用。

SPO11是編輯和加工核酸酶的核酸內(nèi)切酶，其在減數(shù)分裂重組期間起作用。SPO11在DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)，這是減數(shù)分裂重組過程中的重要步驟。在不存在SPO11的情況下，不能啟動DSB的產(chǎn)生，這可導致染色體異常分離，進而可導致非整倍體配子。

核酸內(nèi)切酶V(ENDOV)是編輯和加工核酸酶的核酸酶，并且是在第二個磷酸二酯鍵3'到肌苷特異性切割含肌苷的RNA的內(nèi)切核糖核酸酶。ENDOV對單鏈RNA(ssRNA)向雙鏈RNA(dsRNA)具有強烈偏好。ENDOV切割含有肌苷的mRNA和tRNA。ENDOV還能夠切割含有特異位點5'-IIUI-3'和5'-UIUU-3'的結(jié)構(gòu)特異性dsRNA底物。肌苷在編輯后存在于許多RNA中；肌苷特異性內(nèi)切核糖核酸酶的功能仍不清楚。肌苷可以在經(jīng)編輯的RNA中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，或者其可以通過去除已經(jīng)歷A至I編輯的過度編輯的長病毒dsRNA基因組而參與抗病毒反應。

在一些實施方案中，用于治療的肽包括編輯和加工核酸酶。在一些實施方案中，用于編輯和加工的酶包括SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:199,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:201,SEQ ID NO:202,SEQ ID NO:203,SEQ ID NO:204,或SEQ ID NO:205。

端粒是在老化和在細胞分裂或有絲分裂期間變短的染色體末端的區(qū)域。為了修復染色體的末端，一種酶，端粒酶，修復可能具有修復年齡或疾病相關損傷的潛力的末端。端粒酶是一種核糖核蛋白，其將DNA序列重復序列添加到端粒區(qū)域(真核染色體的末端)中的DNA的3'端。在一些實施方案中，用于治療的肽包括端粒酶或其部分。在一些實施方案中，端粒酶或其部分包含SEQ ID NO:206，SEQ ID NO:207，SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209。

端粒蛋白1的保護由POT1編碼，POT1是凝血酶(telombin)家族的成員并且參與端粒的維持。POT1通過結(jié)合真核染色體末端的端粒重復序列，調(diào)節(jié)端粒長度并保護染色體末端不受不規(guī)則重組、不穩(wěn)定性和異常染色體不穩(wěn)定性的影響而起作用。在若干實施方案中，用于治療的肽包括端粒蛋白1或其部分的保護。在一些實施方案中，端粒蛋白1或其部分的保護包含SEQ ID NO:210或SEQ ID NO:211。

在一些實施方案中，描述了其中待治療的肽包含融合蛋白的方法。在一些實施方案中，融合蛋白可以包含第一蛋白序列，其包含彈性蛋白、膠原、抗炎劑、凝血因子、激素、血小板堿性蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、肝細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胎盤生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、DNA修復酶、端粒酶或端粒酶蛋白1的保護物的氨基酸序列。在一些實施方案中，融合蛋白與第二蛋白融合，第二蛋白包含彈性蛋白、膠原、抗炎劑、凝血因子、激素、血小板堿性蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、肝細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胎盤生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、DNA修復酶、端粒酶或端粒酶蛋白1的保護物的氨基酸序列，其中第二蛋白的氨基酸序列不是第一蛋白的氨基酸序列。融合蛋白可以具有將第二部分引入治療肽以治療有需要的受試者的附加益處。

在本文所述的若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌的群體由來自丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、棒狀桿菌葡萄球菌屬(Cornybacterium Staphyloccous)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)中的細菌成員產(chǎn)生和/或衍生的。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌源自丙酸桿菌屬(Propionibacterium)。丙酸桿菌屬的物種的非限制性實例包括產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidifaciens)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、澳大利亞丙酸桿菌(Propionibacterium australiense)、貪婪丙酸桿菌(Propionibacterium avidum)、環(huán)己酸丙酸桿菌(Propionibacterium cyclohexanicum)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum)、詹氏丙酸桿菌(Propionibacterium jensenii)、微嗜氧丙酸桿菌(Propionibacterium microaerophilum)、丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium propionicum)和特氏丙酸桿菌(Propionibacterium thoeniiand)。

在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌源自痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)物種。經(jīng)遺傳修飾的細菌可以源自P.acnes的致病性或非致病性菌株。最近的研究表明，存在P.acnes的與致病性相關的某些菌株和與健康皮膚相關的其它菌株(Fitz-Gibbon,S.,et al.,(2013)Invest.Dermatol.,133(9):2152-60；Lomholt HB and Kilian M.(2010)PLoS One,5(8):e12277；McDowell A,et al.,(2011)Microbiology157(Pt 7):1990-2003)。在被認為與健康皮膚相關的類型中，II型，核糖型6菌株似乎與痤瘡具有最低的相關性。II型P.acnes包含CRISPR陣列，其賦予免疫性給P.acnes特異性噬菌體和可移動遺傳元件(Bru¨ggemann H,et al.,(2012)PLoS ONE7(3):e34171)。這似乎解釋了為什么這些細菌在自然界可以是共生的，因為它不能從其他細菌獲得致病性狀。

經(jīng)遺傳修飾的細菌可衍生自P.acnes的任何合適的微生物組，其非限制性實例包括I型微生物組、II型微生物組、III型微生物組、IV型微生物組和V型微生物組。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌衍生自I型(例如，IA或IB型)表型的P.acnes菌株、II型表型的P.acnes菌株或III型表型的P.acnes菌株。經(jīng)遺傳修飾的細菌可以源自P.acnes的任何合適的核糖型，其非限制性實例包括核糖體RT1至RT30。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌衍生自核糖體型RT1、RT2、RT3、RT4、RT5、RT6、RT7、RT8、RT9或RT10的P.acnes。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌衍生自核糖體型RT2或RT6的P.acnes。在某些實施方案中，遺傳修飾的細菌衍生自II型菌株和核糖體RT2或RT6的P.acnes。

在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌源自包含CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat：成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列)基因座的細菌，CRISPR基因座有時稱為CRISPR陣列(例如，參見Horvath and Barrangou(2010)Science327:167–70；Makarova et al.,(2011)Nat Rev Microbiol9:467–77；以及Bru¨ggemann H,et al.,(2012)PLoS ONE 7(3):e34171)。不受限于理論，如P.acnes等細菌中的CRISPR陣列已經(jīng)顯示賦予對抗入侵遺傳元件(例如病毒、噬菌體和質(zhì)粒)的保護性“免疫”。不受限于理論，CRISPR陣列的存在可以保持經(jīng)遺傳修飾的細菌的基因組的完整性并防止從其它致病性細菌菌株引入外來遺傳元件。雖然認為CRISPR陣列保護細菌免于從其它細菌、噬菌體和/或病毒引入外來遺傳元件，但含有CRISPR陣列的細菌易于通過同源重組轉(zhuǎn)化、穩(wěn)定整合經(jīng)轉(zhuǎn)化的DNA并整合核酸。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌包含內(nèi)源性CRISPR陣列。例如，在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌衍生自P.acnes的RT2或RT6核糖型，其各自包含內(nèi)源性CRISPR陣列。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細菌包括通過遺傳操作引入的外源性CRISPR陣列。

在一些實施方案中，經(jīng)修飾的細菌群體由痤瘡丙酸桿菌或其菌株產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由紋帶棒狀桿菌(Corynebacterium striatum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由腸球菌(Enterrococci)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由微球菌(Micrococci)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由蠕形螨菌(Demodex)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由馬拉色霉菌(Malassezia)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由非致病性大腸桿菌(Eschericia coli)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由食酸菌(Acidovorax)屬產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化細菌群體由溫和食酸菌屬(Acidovorax temperans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由不動桿菌(Acinetobacter)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由溶血性不動桿菌(Acinetobacter haemolyticus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由烏爾新不動桿菌(Acinetobacter ursingii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由放線菌(Actinomyces)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由紐氏放線菌(Actinomyces neuii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由厭氧球菌(Anaerococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由奇異菌(Atopobium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由陰道奇異菌(Atopobium vaginae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由短桿菌(Brevibacterium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由包氏短桿菌(Brevibacterium paucivorans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由短波單胞菌(Brevundimonas aurantiaca)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由短波單胞菌(Brevundimonas aurantiaca)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由泡囊短波單胞菌(Brevundimonas vesicularis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由假絲酵母絲狀菌(Candidatus Nostocoida)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由假絲酵母絲狀細菌(Candidatus Nostocoida limicola)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由棒狀桿菌(Corynebacterium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由擁擠棒狀桿菌(Corynebacterium accolens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由非發(fā)酵棒狀桿菌(Corynebacterium afermentans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由無枝菌酸棒狀桿菌(Corynebacterium amycolatum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由闌尾炎棒狀桿菌(Corynebacterium appendicis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由粘金色棒狀桿菌(Corynebacterium aurimucosum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由科伊爾棒狀桿菌(Corynebacterium coyleae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由硬粒小麥棒狀桿菌(Corynebacterium durum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由玻璃狀棒狀桿菌(Corynebacterium glaucum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由葡萄糖棒狀桿菌(Corynebacterium glucuronolyticum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由模仿棒狀桿菌(Corynebacterium imitans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由杰氏棒狀桿菌(Corynebacterium jeikeium)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由克氏棒狀桿菌(Corynebacterium kroppenstedtii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由脂肪酸芽孢棒狀桿菌(Corynebacterium lipophiloflavum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由馬絲氏棒狀桿菌(Corynebacterium matruchotii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由微小棒狀桿菌(Corynebacterium minutissimum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體是從產(chǎn)粘棒狀桿菌(Corynebacterium mucifaciens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由假棒狀桿菌(Corynebacterium pseudodiphthericum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由黑色棒狀桿菌(Corynebacterium nigricans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由假棒狀桿菌(Corynebacterium pseudodiphthericum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由模擬棒狀桿菌(Corynebacterium simulans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由單棒狀桿菌(Corynebacterium singulare)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由桑氏棒狀桿菌(Corynebacterium sundsvallense)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由結(jié)核硬脂酸棒狀桿菌(Corynebacterium tuberculostearicum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由絮凝劑產(chǎn)生菌(Diaphorobacter)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由硝化絮凝劑產(chǎn)生菌(Diaphorobacter nitroreducens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由水棲菌(Enhydrobacter)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由氣囊水棲菌(Enhydrobacter aerosaccus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由腸桿菌(Enterobacter)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由腸球菌(Enterococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由糞腸球菌(Enterococcus faecalis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由埃里木氏菌(Eremococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由油菜埃里木氏菌(Eremococcus coleocola)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由費克藍姆菌(Facklamia)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由人費克藍姆菌(Facklamia hominis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由不活躍費克藍姆(Facklamia languida)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由加德納菌(Gardnerella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由陰道加德納菌(Gardnerella vaginalis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由孿生菌(Gemella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由溶血性孿生菌(Gemella haemolysans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體是由麻疹孿生菌(Gemella morbillorum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由血孿生菌(Gemella sanguinis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由戈登氏菌(Gordonia)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由支氣管戈登氏菌(Gordonia.Bronchialis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由痰唾戈登氏菌(Gordonia.sputi.)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由土地戈登氏菌(Gordonia.terrae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由顆粒鏈菌(Granulicatella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由苛養(yǎng)顆粒鏈菌(Granulicatella elegans)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由生絲微菌(Hyphomicrobium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由簡易生絲微菌(Hyphomicrobium facile)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由兩面神菌(Janibacter)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由檸檬兩面神菌(Janibacter melonis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由考克氏菌(Kocuria)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由?？伎耸暇?Kocuria marina)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由沼澤考克氏菌(Kocuria palustris)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由乳桿菌(Lactobacillus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由詹氏乳桿菌(Lactobacillus jensenii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由明串珠菌(Leuconostoc)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由阿根廷明串珠菌(Leuconostoc argentinum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由甲基桿菌(Methylobacterium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜溫甲基桿菌(Methylobacterium mesophilicum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由微球菌(Micrococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由藤黃微球菌(Micrococcus luteus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由小月菌(Microlunatus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由聚磷小月菌(Microlunatus phosphovorus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由柯氏動彎桿菌(Mobiluncus curtisii)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體柯氏動彎桿菌霍氏亞種(Mobiluncus curtisii subsp.holmesii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由分枝桿菌(Mycobacterium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由氯霉分枝桿菌(Mycobacterium chlorophenolicum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由奧氏分枝桿菌(Mycobacterium obuense)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由中草菌(Nakamurella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由多瓣中草菌(Nakamurella multipartita)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由土微菌(Pedomicrobium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由澳大利亞土微菌(Pedomicrobium australicum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜胨菌(Peptoniphilus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體從哈雷嗜胨菌(Peptoniphilus harei)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由消化鏈球菌(Peptostreptococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcus anaerobius)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由普雷沃氏菌(Prevotella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由人體普雷沃氏菌(Prevotella corporis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由黑色素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由丙酸桿菌(Propionibacterium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由顆粒丙酸桿菌(Propionibacterium granulosum)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由假單胞菌(Pseudomonas)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜糖假單胞菌(Pseudomonas saccharophila)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由山黃麻假單胞菌(Pseudomonas tremae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由紅球菌(Rhodococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由類棒菌狀紅球菌(Rhodococcus corynebacterioides)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由羅伊氏菌(Rothia)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由空間羅伊氏菌(Rothia aeria)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由齲齒羅伊氏菌(Rothia dentocariosa)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由粘滑羅伊氏菌(Rothia mucilaginosa)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由鼠鼻羅伊氏菌(Rothia nasimurium)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由沙雷氏菌(Serratia)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由脂肪酶產(chǎn)生菌(Serratia liquefaciens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由粘質(zhì)沙雷氏菌薩庫氏亞種(Serratia marcescens subsp.Sakuensis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由鞘脂菌(Sphingobium)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由鞘脂單胞菌(Sphingobium amiens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由葡萄球菌(Staphylococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由頭孢葡萄球菌(Staphylococcus capitis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由孔氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)屬生成。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由鏈球菌(Streptococcus)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嵴鏈球菌(Streptococcus cristatus)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由格氏葡萄球菌(Streptococcus gordonii)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嬰兒鏈球菌(Streptococcus infantis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由緩癥鏈球菌(Streptococcus mitis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由副溶血鏈球菌(Streptococcus parasanguinis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由副溶血鏈球菌(Streptococcus parasanguinis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由血鏈球菌(Streptococcus sanguinis)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由四角球菌(Tetrasphaera)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由長四角球菌(Tetrasphaera elongata)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由束村氏菌(Tsukamurella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由耐酪酸束村氏菌(Tsukamurella tyrosinosolvens)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由束村氏菌(Tsukamurella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由韋榮氏球菌(Veillonella)屬產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由極小韋榮氏球菌(Veillonella parvula)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由極小韋榮氏球菌(Veillonella parvula)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由慢生根瘤菌科U8776(Bradyrhizobiaceae U8776)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由肉食桿菌AJ427446(Carnobacterium AJ427446)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由棒狀桿菌AY581888(Corynebacterium AY581888)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由棒狀桿菌AF543288(Corynebacterium AF543288)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由棒狀桿菌X81872(Corynebacterium X81872)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由棒狀桿菌X84253(Corynebacterium X84253)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由皮膚球菌AF409025(Dermacoccus AF409025)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由芬戈爾德菌AB109769(Finegoldia AB109769)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由嗜血桿菌AF224309(Haemophilus AF224309)產(chǎn)生。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由甲基桿菌AY741717奈瑟菌DQ409137(Methylobacterium AY741717.Neisseria DQ409137)產(chǎn)生。

細菌菌株經(jīng)修飾以避免發(fā)生反應，炎癥，用于容易地去除細菌、減弱細菌的方法，并防止可能對宿主有害的有害細菌生物分子的釋放。

在一些細菌中，存在會參與裂解和發(fā)炎的毒性蛋白質(zhì)。細菌例如可以分泌毒素，例如內(nèi)毒素和外毒素。內(nèi)毒素是細胞相關物質(zhì)，其是細菌的結(jié)構(gòu)組分并且從細菌或從根據(jù)宿主防御機制裂解所導致的細菌細胞釋放的。外毒素由細菌分泌，并且可以是小生物分子，蛋白質(zhì)，并且也可以是能起酶促作用的最小肽。細菌毒素的幾個實例包括但不限于溶血素(E.coli)、α毒素(金黃色葡萄球菌(S.aureus))、殺白細胞素(S.aureus)、CAMP因子(丙酸桿菌(Priopionibacterium))、透明質(zhì)酸酶(Priopionibacterium)、神經(jīng)氨酸酶(Priopionibacterium)、腸毒素B(S.aureus)、vero毒素(E.coli)。例如痤瘡丙酸桿菌天然產(chǎn)生生物分子CAMP因子，其與鞘磷脂酶具有共溶血活性，其可賦予細胞毒性給角質(zhì)形成細胞和巨噬細胞。CAMP因子與來自宿主細胞的酸性鞘磷脂酶一起可導致宿主中的裂解和炎癥。在另一個實例中，溶血是由許多細菌病原體使用的機制，細菌病原體起作用以降解、侵入宿主細胞并抵抗宿主的免疫系統(tǒng)。痤瘡丙酸桿菌在其基因組內(nèi)攜帶5種不同的CAMP同源物(CAMP1、CAMP2、CAMP3、CAMP4和CAMP5)。許多其他類型的細菌也可分泌細胞毒素。例如，金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生多種毒力因子，包括但不限于酶、毒素、超抗原、剝脫性毒素、α毒素、β毒素、δ毒素和若干種類型的雙組分毒素。

在一些細菌中，可使用脂肪酶以得到有益效果。在一些微生物中，用于脂肪酶的基因不被敲除，因為脂肪酶可用于分解患有腋窩氣味或腳底氣味的受試者的油。在一些實施方案中，丙酸桿菌被工程化以釋放脂肪酶，從而減少皮脂分泌。

為了防止毒力因子的有害影響，可以進行修飾以敲除參與細菌毒性因子分泌的有關特異性基因以產(chǎn)生條件突變體。條件突變體可以描述為在某些允許的環(huán)境條件下具有野生型表型，在其他限制性條件下具有突變表型。在一些實施方案中，編碼毒性蛋白的基因會突變或被敲除以防止宿主中的醫(yī)院感染或疾病癥狀。在一些實施方案中，編碼引起宿主炎癥的酶的基因會突變或被敲除以防止宿主中疾病的表現(xiàn)。在一些實施方案中，編碼參與宿主病毒因子合成的蛋白質(zhì)的基因會在細菌中突變或被敲除。在一些實施方案中，所述基因用于CAMP因子。在一些實施方案中，所述基因用于脂肪酶。然而，在一些微生物中，用于脂肪酶的基因不被敲除，因為脂肪酶可用于分解患有腋窩氣味或腳底氣味的受試者的油。在一些實施方案中，丙酸桿菌被工程化以釋放脂肪酶，從而減少皮脂分泌。在一些實施方案中，所述基因用于α毒素。在一些實施方案中，所述基因用于β毒素。在一些實施方案中，所述基因用于δ毒素。在一些實施方案中，所述基因用于雙組分毒素的類型。在一些實施方案中，所述基因用于溶血素。

幾種微生物不需要任何生長因子，并且可以合成必需的嘌呤，嘧啶、氨基酸和維生素，其中它們可以從作為其自身代謝的一部分的碳源開始。然而，一些類型的微生物將需要嘌呤、嘧啶、氨基酸和維生素以便生長，并且必須在培養(yǎng)基中添加以使這些微生物生長。通過遺傳修飾微生物使得它們需要野生型不需要的生長因子，本領域技術(shù)人員可以產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的“營養(yǎng)缺陷型”或具有不為親本生物體所共有的營養(yǎng)需求的突變生物體。

經(jīng)遺傳修飾的微生物可以被修飾，使得它們是營養(yǎng)缺陷型。為了產(chǎn)生對其周圍環(huán)境的依賴性以便存活，可以控制在微環(huán)境中的微生物的量，或者可以通過耗盡環(huán)境中的必需營養(yǎng)物來消除微生物群。在若干實施方案中，微生物包含具有突變的基因組或敲除編碼谷氨酰胺合成酶的基因。在若干實施方案中，微生物包含具有突變的基因組或敲除編碼天冬酰胺合成酶的基因。在若干實施方案中，微生物包含具有突變的基因組或敲除編碼天冬氨酸激酶的基因。在若干實施方案中，微生物包含具有突變的基因組或敲除編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因。

毒素也由許多真菌分泌，從而使得它們在誘導條件下能成功地定居和感染宿主。分泌的蛋白會涉及幾種真菌物種的毒力。例如，水解酶產(chǎn)生(其在細菌和酵母的致病性中也起作用)通常與毒力相關。真菌的幾種毒素包括但不限于分泌的阿斯匹林蛋白酶(Sap)(白色念珠菌(C.albicans))，磷脂酶B酶(C.albicans)，脂肪酶(C.albicans)。為了防止被真菌感染，可以使特異性基因突變或?qū)⑵淝贸苑乐苟拘砸蜃釉谒拗髦幸鸺膊　?/p>

真菌細胞可以被遺傳工程化以分泌生物分子。在本文所述的若干實施方案中，轉(zhuǎn)化真菌細胞群體由來自由屬組成的組的成員產(chǎn)生。在本文所述的若干實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由來自由假絲酵母(Candida)屬組成的組的細菌成員產(chǎn)生。在本文所述的若干實施方案中，轉(zhuǎn)化細菌群體由來自白色假絲酵菌(Candida albicans)，光滑假絲酵母(Candida glabrata)，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)和克勞斯假絲酵母(Candida krusei)中的細菌成員產(chǎn)生。

在某些實施方案中，組合物包含一種或多種經(jīng)遺傳修飾的微生物。在一些實施方案中，組合物包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種經(jīng)遺傳修飾的微生物。在一些實施方案中，組合物包含2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種或10種或更多種經(jīng)遺傳修飾的微生物。在某些實施方案中，組合物中的經(jīng)遺傳修飾的微生物被配置成表達一種或多種目標基因。在某些實施方案中，組合物包含經(jīng)遺傳修飾的微生物，從而顯著減少或消除致病性分子(例如，對微生物是內(nèi)源性的致病性蛋白)的表達。在一些實施方案中，組合物包含經(jīng)遺傳修飾的微生物，其中微生物的一種或多種基因(例如，內(nèi)源性必需基因)被敲除。在一些實施方案中，組合物包含經(jīng)遺傳修飾的微生物，其被配置為在誘導型啟動子的指導下表達一種或多種必需基因。

在某些實施方案中，組合物包含藥學上可接受的賦形劑或載體?？紤]用于本文的藥學上可接受的賦形劑或載體通常對經(jīng)遺傳修飾的微生物無毒。因此，根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可以使用一種或多種生理學上可接受的載體以合適的方式配制，所述載體包括可以藥學上使用的賦形劑和助劑。適當?shù)闹苿┛梢愿鶕?jù)所選擇的給藥途徑而定。特別地，可以與本文所述的組合物一起使用如在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA,18th edition,1990中列出的合適的制劑、成分、賦形劑等或其組合。本文的組合物可以并入在Remington's中描述的適當材料中或與在Remington's中描述的適當材料一起使用。

如本文所用，術(shù)語“藥學上可接受的”和“生理學上可接受的”是指適于一種或多種給藥途徑(體內(nèi)遞送或接觸)的生物學上可接受的制劑，其是氣態(tài)的、液態(tài)的或固態(tài)的或它們的混合狀態(tài)。這樣的制劑包括溶劑(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如水包油或油包水)、懸浮液、糖漿劑、酏劑、分散體和懸浮介質(zhì)、涂敷劑、與藥物施用或體內(nèi)接觸或遞送相容的等滲的且吸收促進的或延遲的試劑。水性和非水性的溶劑、溶液和懸浮液可以包括懸浮劑和增稠劑。這種藥學上可接受的載體包括片劑(包衣或未包衣)、膠囊(硬或軟)、微珠、粉末、顆粒和晶體。補充的活性化合物(例如防腐劑、抗菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑)也可以摻入組合物中。

經(jīng)遺傳工程改造的微生物可以放置在對于細菌或真菌的存活最佳的賦形劑中。在本文所述的若干實施方案中，描述了包含幫助維持細菌的完整性和存活力的載體或賦形劑的組合物。本文所述的載體可以指用于輸送供施用的活性藥物的沒有治療價值的物質(zhì)。本文所述的藥物載體可以指用作溶劑的載體或惰性介質(zhì)，在該溶劑中配制藥物活性劑和/或施用在該溶劑中的藥物活性劑。載體可以包括本領域技術(shù)人員已知的聚合物膠束、脂質(zhì)體、基于脂蛋白的載體、納米顆粒載體、樹枝狀聚合物和其他細菌載體。理想的載體可以是無毒的、生物相容的、非免疫原性的、可生物降解的，并且可以避免被宿主的防御機制識別。在本文所述的若干實施方案中，描述了包含幫助維持真菌完整性的載體或賦形劑的組合物。在一些實施方案中，載體是藥物載體。在一些實施方案中，藥物載體包括藥物組合物。在一些實施方案中，載體是聚合膠束。在一些實施方案中，載體是脂質(zhì)體。在一些實施方案中，載體是基于脂蛋白的載體。在一些實施方案中，載體是納米顆粒載體。在一些實施方案中，載體是樹枝狀聚合物。

藥物組合物可以配制成與特定的給藥途徑相容。因此，藥物組合物包括適于通過各種途徑給藥的載體、稀釋劑或賦形劑。

在一些實施方案中，組合物配制為例如局部(例如，皮膚)制劑。在一些實施方案中，將組合物配制成例如用于向哺乳動物局部給藥。局部制劑可包括例凝膠制劑、乳膏制劑、洗劑制劑、糊劑制劑、軟膏制劑、油制劑和泡沫制劑等制劑。組合物還可以包括例如吸收軟化劑。

組合物的其它實例可以任選地配制成遞送到粘膜，或通過吸入、呼吸、鼻內(nèi)、口服、口腔或舌下遞送。

可以加入鹽。鹽的非限制性實例包括乙酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、重酒石酸鹽、溴化物、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、乙二磺酸鹽、依托酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、碘化物、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、巴莫酸鹽(雙羥萘酸鹽)、磷酸鹽、二磷酸鹽、水楊酸鹽和二水楊酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、三乙基碘、戊酸鹽、鋁、芐星、鈣、乙二胺、賴氨酸、鎂、甲葡胺(megluminie)、鉀、普魯卡因(procaine)、鈉、氨基丁三醇(tromethyamine)或鋅。

可以加入螯合劑。螯合劑的非限制性實例包括乙二胺、乙二醇四乙酸、1,2-雙(鄰氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸、青霉胺、地拉羅司(Deferasirox)、去鐵酮(Deferiprone)、去鐵胺(Deferoxamine)、2,3-二硫烷基丙-1-醇、右丙亞胺(Dexrazoxane)、六氰合亞鐵酸(II,III)鐵(II,III)、(R)-5-(1,2-二硫戊環(huán)-3-基)戊酸、2,3-二巰基-1-丙磺酸、二巰基琥珀酸或二亞乙基三胺五乙酸。

可以加入緩沖劑。緩沖劑的非限制性實例包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、TAPS、N-二(羥乙基)甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(tris)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲砷酸鹽、SSC、MES或琥珀酸。

可以加入助溶劑。助溶劑的非限制性實例包含羥基或其它極性基團，例如醇，例如異丙醇；二醇，例如丙二醇，聚乙二醇，聚丙二醇，二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。助溶劑的非限制性實例包含羥基或其它極性基團，例如醇，例如異丙醇；二醇，例如丙二醇，聚乙二醇，聚丙二醇，二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。

也可以加入補充化合物(例如防腐劑，抗氧化劑，抗微生物劑，包括殺菌劑和生物穩(wěn)定劑，例如抗菌劑，抗病毒劑和抗真菌劑)。因此，藥物組合物可包括防腐劑、抗氧化劑和抗微生物劑。

防腐劑可用于抑制不希望有的微生物生長或增加成分的穩(wěn)定性，從而延長保質(zhì)期。合適的防腐劑是本技術(shù)領域已知的，包括例如EDTA，EGTA，苯扎氯銨或苯甲酸或苯甲酸鹽，例如苯甲酸鈉?？寡趸瘎┌ɡ缈箟难帷⒕S生素A、維生素E、生育酚和類似的維生素或前維生素。

在本文的若干實施方案中，描述了低溫保存遺傳工程細菌以供將來使用的方法。在本文的若干實施方案中，描述了通過冷凍干燥遺傳工程細菌來保存細菌以供將來使用的方法。在本文的若干實施方案中，描述了低溫保存遺傳工程真菌以供將來使用的方法。在本文的若干實施方案中，描述了通過冷凍干燥細菌以供將來使用來保護遺傳工程真菌的方法。

特定的非限制性類型的抗病毒劑包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑；蛋白酶抑制劑；胸苷激酶抑制劑；糖或糖蛋白合成抑制劑；結(jié)構(gòu)蛋白合成抑制劑；核苷類似物；和病毒成熟抑制劑。抗病毒劑的具體的非限制性實例包括奈韋拉平(nevirapine)，地拉韋定(delavirdine)，依非韋侖(efavirenz)，沙奎那韋(saquinavir)，利托那韋(ritonavir)，茚地那韋(indinavir)，奈非那韋(nelfinavir)，安潑那韋(amprenavir)，齊多夫定(AZT)，司他夫定(d4T)，拉米夫定(3TC)，去羥肌苷(DDI)，扎西他濱(ddC)，阿巴卡韋(abacavir)，阿昔洛韋(acyclovir)，噴昔洛韋(penciclovir)，利巴韋林(ribavirin)，伐昔洛韋(valacyclovir)，更昔洛韋(ganciclovir)，1-D-呋喃核糖基-1,2,4-三唑-3-甲酰胺，9->2-羥基-乙氧基甲基鳥嘌呤，金剛烷胺(adamantanamine)，5-碘-2'-脫氧尿苷，三氟胸苷，干擾素和腺嘌呤阿糖胞苷。

適用于本發(fā)明的組合物和方法的藥物制劑和遞送系統(tǒng)在現(xiàn)有技術(shù)(參見例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)20^th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)18^th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA；The Merck Index(1996)12^th ed.,Merck Publishing Group,Whitehouse,NJ；Pharmaceutical Principles of Solid DosageForms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel ad Soklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)11^th ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD；以及Poznansky et al.,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano,ed.,Oxford,N.Y.,pp.253-315)中是已知的。

在某些實施方案中，組合物包含被配置為直接或間接接合誘導型啟動子的分子。在一些實施方案中，配置成與誘導型啟動子接合的分子被配置成激活誘導型啟動子(例如激活基因轉(zhuǎn)錄/翻譯)。在一些實施方案中，配置成與誘導型啟動子接合的分子被配置為抑制誘導型啟動子對基因表達的激活。在一些實施方案中，配置成與誘導型啟動子接合的分子包含化合物，醇、營養(yǎng)物、金屬、氨基酸(例如，諸如合成氨基酸之類的氨基酸)、糖或糖類似物(例如乳糖、阿拉伯糖、IPTG)、肽或蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，組合物包含乳糖、阿拉伯糖、IPTG、色氨酸或四環(huán)素。

在本文的某些實施方案中，描述了制備用于轉(zhuǎn)化或整合到微生物基因組內(nèi)的核酸的方法。方法可包括提供編碼肽的核酸序列，并將所述核酸序列與編碼調(diào)節(jié)元件的核酸序列或編碼分泌肽的核酸連接。在一些實施方案中，核酸包含編碼肽的序列，其中所述肽包含分泌肽的氨基酸序列。在一些實施方案中，核酸包含用于分泌的信號序列。在一些實施方案中，核酸包含序列，或編碼被細胞分泌途徑識別的多肽序列。在一些實施方案中，核酸編碼用于生產(chǎn)目標生物分子的非分泌蛋白(例如，酶)。在一些實施方案中，用于分泌的信號序列包含序列SEQ ID NO:212，SEQ ID NO:213，SEQ ID NO:214，SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:216。

本領域技術(shù)人員應理解，基因表達水平依賴于許多因子，例如啟動子序列和調(diào)節(jié)元件。用于最大蛋白質(zhì)選擇的另一個因素是轉(zhuǎn)錄物基因的密碼子與宿主的典型密碼子使用的匹配。如對大多數(shù)細菌所指出的，小的密碼子子集被tRNA物質(zhì)識別而導致翻譯選擇，并且在蛋白質(zhì)表達的限制中是重要的。在這方面，可以設計許多合成基因以提高它們的蛋白質(zhì)表達水平。密碼子優(yōu)化的設計過程可以將稀有密碼子改變?yōu)橐阎糜诘鞍踪|(zhì)表達效率的密碼子。在一些實施方案中，描述了密碼子選擇，其中可以通過使用本領域技術(shù)人員已知的算法來進行密碼子選擇，以產(chǎn)生針對高蛋白質(zhì)產(chǎn)量優(yōu)化的合成遺傳轉(zhuǎn)錄物。包含用于密碼子優(yōu)化的算法的程序是本領域技術(shù)人員已知的。程序可以包括例如OptimumGene^TM，算法等。此外，合成的密碼子優(yōu)化的序列可以例如從Integrated DNA Technologies和其他商業(yè)上可獲得的DNA測序服務機構(gòu)商購獲得。在一些實施方案中，描述了用于分泌的肽，其中用于用于分泌的肽的基因是被優(yōu)化用于在人中的表達的密碼子。在一些實施方案中，描述了用于分泌的肽，其中完整基因轉(zhuǎn)錄物的基因是被優(yōu)化用于表達細菌的密碼子，其可以包括分泌肽和已知提高表達水平的其它肽的基因轉(zhuǎn)錄物。在一些實施方案中，描述了肽，其中優(yōu)化用于分泌肽的基因以選擇特異性用于細菌和真菌細胞中蛋白質(zhì)表達的密碼子。

術(shù)語“受試者”包括但不限于患有將從受益于接觸或施用本文所述的經(jīng)遺傳修飾的微生物的疾病或具有該疾病的風險的受試者。受試者包括哺乳類動物(哺乳動物)，例如人，非人靈長類動物(猿，長臂猿，大猩猩，黑猩猩，猩猩，獼猴)，家養(yǎng)或伴侶動物(狗和貓)，農(nóng)場動物(例如雞和鴨之類的禽類，馬，牛，山羊，綿羊，豬)，以及實驗動物(小鼠，大鼠，兔，豚鼠)。受試者包括獸醫(yī)動物，以及動物疾病模型，例如，患有皮膚病的小鼠和其他動物模型。

本發(fā)明的經(jīng)遺傳修飾的微生物和包含經(jīng)遺傳修飾的微生物的組合物可用于各種方法和用途以及藥物中。這樣的方法和用途以及藥物包括，例如，離體和體內(nèi)施用。在各種實施方案中，所提供的方法和用途以及藥物包括用于治療皮膚病的方法和用途以及藥物。

皮膚病可以由對皮膚病癥的遺傳傾向性以及可以駐留在皮膚上的天然菌叢或天然細菌的擾亂引起。存在幾種類型的皮膚病癥，例如但不限于痤瘡、光化性角化病、斑禿、運動員腳、甲真菌病(onchomychosis)、特應性皮炎、腋臭、濕疹、指甲真菌感染、牛皮癬、玫瑰痤瘡、慢性傷口愈合、毛囊炎、毛發(fā)角化病、口周皮炎、血管纖維瘤、皮膚炎癥、美容術(shù)(cosmesis)、老化損傷、皮膚變色、過早變白毛發(fā)或皮脂溢。在本文所述的若干實施方案中，描述了治療皮膚病癥的方法。在若干實施方案中，描述了治療玫瑰痤瘡的方法。在若干實施方案中，描述了治療脫發(fā)的方法。在若干實施方案中，描述了甲真菌病的方法。在若干實施方案中，描述了治療腋臭的方法。在若干實施方案中，描述了治療慢性傷口愈合的方法。在若干實施方案中，描述了治療過早變白頭發(fā)的方法。在若干實施方案中，描述了治療皮膚炎癥的方法。在若干實施方案中，描述了治療皮膚變色的方法。

痤瘡或?qū)こｐ畀徥浅Ｒ姷钠つw疾病，可以影響面部、頸部、胸部和背部。其特征在于皮膚上具有皮脂溢的區(qū)域。具有痤瘡的皮膚區(qū)域也可能具有粉刺、丘疹、結(jié)節(jié)、囊腫，癤、囊性痤瘡和丘疹。痤瘡可以由激素(例如睪酮)引起，并且可以被相關的皮脂腺影響。造成痤瘡的原因可能來自激素性影響、遺傳性影響和感染性影響。痤瘡的治療可以是使用局部藥物，例如過氧化苯甲酰，水楊酸和激素。更常見的可以是使用抗生素治療痤瘡，然而，在能發(fā)展細菌耐藥性的情況下，許多類型的抗生素變得不太有效。

痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)是廣泛推斷導致痤瘡的厭氧細菌物種。金黃色葡萄球菌，一種天然的植物性皮膚細菌，也被認為是感染皮膚的條件致病菌，即使它在健康和感染的皮膚中都可見。然而，在研究中已經(jīng)表明，痤瘡丙酸桿菌以及金黃色葡萄球菌已經(jīng)正在形成抗生素抗性，由此針對通常用抗生素治療的皮膚病癥增加了開發(fā)新的療法的需要。在本文所述的若干實施方案中，分泌生物分子的經(jīng)遺傳修飾的細菌用于治療痤瘡。在本文所述的若干實施方案中，分泌生物分子的經(jīng)遺傳修飾的真菌用于治療痤瘡。

本文所述的玫瑰痤瘡是指以面部紅斑以及有時粉刺為特征的慢性病癥。玫瑰痤瘡有四種亞型，三種影響皮膚，第四種影響眼睛(眼肌型)。早期治療是使用局部類固醇，然而，以局部類固醇形式的治療會因長期使用而加重病癥。因此，目前已經(jīng)研究了新的治療方法。玫瑰痤瘡對兩種性別都有影響，但在女性中幾乎是常見的三倍。

玫瑰痤瘡在中央面部的臉頰、鼻子或前額上開始發(fā)紅，但也可能不太常見地感染頸部、胸部、耳朵和頭皮。在某些情況下，其他癥狀，如半永久性紅腫，毛細血管擴張(面部表層血管擴張)，紅色圓頂丘疹(小突起)和膿皰，紅色粗糙的眼睛，灼熱和刺痛感覺，以及在一些晚期的病例中，紅色的鱗狀鼻，鼻贅(thinophyma)，可能形成。引起潮紅和發(fā)紅的觸發(fā)因素在玫瑰痤瘡的形成中起作用。暴露于極端溫度可能導致面部變得潮紅，劇烈的運動，來自陽光的熱量，嚴重的曬傷，壓力，焦慮，冷風，以及在冬天從冷的環(huán)境移動到例如加熱的商店和辦公室等溫暖或熱的環(huán)境也是這樣。還有一些可以觸發(fā)潮紅的食物和飲料，包括酒精、食物和含有咖啡因(特別是熱茶和咖啡)的飲料、組胺含量高的食物和辛辣食物。

某些藥物和局部刺激物可以快速引發(fā)玫瑰痤瘡。已報道導致玫瑰痤瘡的一些痤瘡和皺紋治療包括微晶磨皮和化學換膚，以及高劑量的異維A酸、過氧化苯甲酰和維甲酸。類固醇誘發(fā)的玫瑰痤瘡(Steroid induced rosacea)是給予由使用局部或鼻部類固醇引起的玫瑰痤瘡的術(shù)語。這些類固醇通常被開處方以用于脂溢性皮炎。劑量應緩慢減少，不應立即停止，以避免發(fā)作。腸道菌群在引起該疾病中會起作用。

口服四環(huán)素抗生素(四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素)和局部抗生素(如甲硝唑)通常是醫(yī)生開出以減輕丘疹、膿皰、炎癥和一些發(fā)紅的第一道防線。

口服抗生素可以幫助緩解眼部玫瑰痤瘡的癥狀。如果丘疹和膿皰持續(xù)，則有時處方可以開出異維A酸。異維甲酸具有許多副作用，通常用于治療嚴重的痤瘡，但是以低劑量被證明對于丘疹膿皰性和增生肉芽腫玫瑰痤瘡是有效的。一些個體對在受感染區(qū)域的局部施用檀香油反應良好，特別是在減少膿皰和紅斑的流行方面。口服抗生素可以是對抗皮膚上可觸發(fā)玫瑰痤瘡的細菌的第一道防線，然而由于抗生素抗性的上升，已經(jīng)尋求新的發(fā)展以治療皮膚的細菌性疾病以及玫瑰痤瘡。在本文所述的若干實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物用于治療玫瑰痤瘡。

本文所述的斑禿(Alopecia areata：AA)是指其中毛發(fā)從身體的一些或所有區(qū)域(通常來自頭皮)損失的病癥。因為它導致頭皮上的禿斑，特別是在第一階段，所以它有時被稱為斑狀禿。在1-2％的病例中，該病癥會蔓延到整個頭皮(全禿)或整個表皮(普禿)。類似AA并且具有相似的病因的條件，也發(fā)生在其他物種中。

該病癥被認為是系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其中身體攻擊其自身的抗原毛囊并抑制或阻止毛發(fā)生長。T細胞淋巴細胞群集在受感染的毛囊周圍，引起炎癥和隨后的脫發(fā)。已經(jīng)報道了一些嬰兒出生時患有先天性AA的情況，但這些不是自身免疫疾病的病例，因為嬰兒出生時沒有已明確發(fā)育的免疫系統(tǒng)。內(nèi)源性類視黃醇代謝缺陷是AA發(fā)病機理的關鍵部分。此外，一些證據(jù)表明AA影響與毛發(fā)顏色相關的毛囊部分。變灰的頭發(fā)不會受到影響。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的微生物用于治療免疫疾病。

甲真菌病是指指甲的真菌感染。該感染可以由甲真菌病的病原體引起，其包括皮膚真菌、假絲酵母(Candida)和非皮膚真菌霉菌。皮膚真菌是在溫帶西方國家中最常引起甲真菌病的真菌；而假絲酵母和非皮膚真菌霉菌更經(jīng)常地出現(xiàn)在具有熱和潮濕的氣候的熱帶和亞熱帶地區(qū)。病原體可以包括假絲酵母和非皮膚真菌霉菌，特別是霉菌生成的柱頂孢霉(新柱頂孢霉)(Scytalidium(Neoscytalidium))，帚霉屬(Scopulariopsis)和曲霉屬(Aspergillus)的成員。假絲酵母菌屬主要在手經(jīng)常淹沒在水中的人中引起指甲甲真菌病。柱頂孢霉主要感染在熱帶地區(qū)的人們，雖然如果他們后來遷移到溫帶氣候地區(qū)，它仍然存在。治療主要包括局部或抗真菌藥物，例如特比萘芬、伊曲康唑和氟康唑。

腋臭是指身體臭味，其中皮脂腺和頂分泌腺會發(fā)揮作用。醫(yī)學病癥可以稱為臭汗癥、頂分泌性臭汗癥、腋臭、皮臭癥、臭汗和惡臭出汗。由于富含水的環(huán)境支持細菌生長，而細菌生長也是由汗水異常增加引起的，所以腋臭或臭汗癥由惡臭定義。在一些實施方案中，使用治療腋臭的方法。

“較差的傷口愈合”可由免疫系統(tǒng)差、糖尿病、低人促生長素、類風濕性關節(jié)炎、血管或動脈疾病的循環(huán)不良、鋅缺乏、維生素缺乏、狼瘡等引起。在幾種情況下，較差的傷口愈合會導致由正常菌群引起的條件性感染。在若干實施方案中，描述了使用經(jīng)遺傳修飾的微生物的用于傷口愈合的療法。

“皮膚炎癥”和“慢性皮膚炎癥”可以通過真皮區(qū)域的巨噬細胞浸潤來標記。在感染期間，巨噬細胞反應將介導慢性炎癥，其在幾種炎性皮膚病中可見，炎性皮膚病包括但不限于牛皮癬、特應性皮炎和慢性接觸性皮炎。為了減少炎癥反應，已經(jīng)描述了尋求在炎癥部位消除巨噬細胞的療法。一種方式是阻斷巨噬細胞產(chǎn)生的效應分子或細胞因子的活性。另一種方式是通過工程化免疫毒素在發(fā)炎過程中靶向巨噬細胞以局部地凋亡消除。療法可以是由皮膚炎癥或慢性皮膚炎癥引起的其它皮膚病癥，皮膚炎癥如皮膚移植物抗宿主病、苔癬樣、施萊皮膚病(schlerodermatous)、環(huán)狀肉芽腫、慢性接觸性皮炎、牛皮癬、UV皮膚損傷、特應性皮炎和皮膚T-淋巴瘤。然而，消除局部響應的大多數(shù)方式是耗時的。在這方面，讓遺傳工程微生物群體來局部消除在慢性皮膚炎癥的部位的巨噬細胞可以為皮膚炎癥或慢性皮膚炎癥提供快速治療。

本發(fā)明提供了包括包裝在合適的包裝材料中的經(jīng)遺傳修飾的微生物(例如丙酸桿菌屬細菌)、其組合物和藥物制劑的試劑盒。試劑盒可以用于各種體外、離體和體內(nèi)的方法和用途，例如本文公開的治療方法或用途。

試劑盒通常包括標簽或包裝插頁，其包括對其中組分的說明或者其中的組分的體外，體內(nèi)或離體使用的描述。試劑盒可以包含這樣的組分的集合，這樣的組分如經(jīng)遺傳修飾的微生物，例如單獨的丙酸桿菌屬細菌，或與另一種治療上有用的組合物(例如抗炎劑)組合。

術(shù)語“包裝材料”是指容納試劑盒的組分的物理結(jié)構(gòu)。包裝材料可以無菌地保持組分，并且可以由通常用于這種目的的材料(例如，紙、波紋纖維、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。

本發(fā)明的試劑盒可以包括標簽或插頁。標簽或插頁包括“印刷品”，例如紙或紙板，其與組分、試劑盒或包裝材料(例如盒子)分離或固定，或附接到包含試劑盒組分的安瓿、管或小瓶。標簽或插頁可另外包括計算機可讀介質(zhì)，諸如盤(例如，硬盤)，諸如CD或DVD-ROM/RAM之類的光盤，DVD，MP3，磁帶或諸如RAM和ROM之類的電存儲介質(zhì)或這些的混合物，例如磁/光存儲介質(zhì)，F(xiàn)LASH介質(zhì)或存儲器類型的卡。

標簽或插頁可包括其中一種或多種組分的識別信息，劑量，活性成分的臨床藥理學，包括作用機制、藥代動力學和藥效動力學。標簽或插頁可以包括標識制造商信息、批號、制造商位置和日期的信息。

標簽或插頁可以包括關于可以使用試劑盒組分的病況、病癥、疾病或癥狀的信息。標簽或插頁可以包括臨床醫(yī)生或受試者在方法、用途、治療方案或診療方案中使用一種或多種試劑盒組分的說明書。說明書可以包括劑量的量、頻率或持續(xù)時間，以及用于實施本文所述的任何方法和用途，治療方案或診療方案的說明。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然與本文所述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試中，但是本文描述了合適的方法和材料。

本文引用的所有申請、出版物、專利和其他參考文獻、GenBank引文和ATCC引文以其整體通過引用并入。在沖突的情況下，將以說明書(包括定義)為準。

關于本文中使用的基本上任何復數(shù)和/或單數(shù)術(shù)語，本領域技術(shù)人員可以根據(jù)上下文和/或應用從復數(shù)轉(zhuǎn)換為單數(shù)和/或從單數(shù)轉(zhuǎn)換為復數(shù)。因此，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)形式“一”，“一個”和“該”包括復數(shù)指代物。為了清楚起見，本文中可以明確地闡述各種單數(shù)/復數(shù)置換。因此，提及“蛋白質(zhì)”或“基因”例如包括多個蛋白質(zhì)或多個基因。

本領域技術(shù)人員應理解，一般來說，本文中，特別是所附權(quán)利要求(例如，所附權(quán)利要求的主體)中使用的術(shù)語通常意指作為“開放式”術(shù)語(例如，術(shù)語“包括“應當被解釋為“包括但不限于”，術(shù)語“具有”應當被解釋為“至少具有”，術(shù)語“包含”應解釋為“包含但不限于”，等等)。本領域技術(shù)人員應當進一步理解，如果所引入的權(quán)利要求陳述的特定數(shù)量是有益的，則這樣的意圖將在權(quán)利要求被明確地陳述，并且在不存在這樣的陳述的情況下，就不存在這樣的意圖。例如，為了幫助理解，下面的所附權(quán)利要求可包含引導性短語“至少一個”和“一個或多個”的用法，以引入權(quán)利要求陳述。然而，使用這樣的短語不應被理解為意味著通過不定冠詞“一”或“一個”引入的權(quán)利要求陳述限定含有這樣引入的權(quán)利要求陳述的任何特定權(quán)利要求為僅包含一個這種陳述的權(quán)利要求，即使當相同的權(quán)利要求包括引導短語“一個或多個”或“至少一個”和不定冠詞例如“一”或“一個”時也如此(例如，“一”和/或“一個”通常應被解釋為是指“至少一個“或”一個或多個”)；這同樣適用于被用來引入權(quán)利要求陳述的定冠詞。此外，即使所引入的權(quán)利要求陳述的特定數(shù)量被明確記載，但是本領域技術(shù)人員應當認識到，這樣的陳述應通常被解釋為意指至少所列舉的數(shù)量(例如，沒有其它修飾語的無修飾的陳述“兩個陳述”意指至少兩個陳述或兩個或更多個陳述)。此外，在類似于“A、B和C中的至少一個等”的慣用語被使用的情況下，通常這樣的結(jié)構(gòu)意指本領域的技術(shù)人員將理解該慣用語(例如，“具有A、B和C中的至少一個的系統(tǒng)”將包括但不局限于具有單獨的A，單獨的B，單獨的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A，B和C一起等的系統(tǒng))。在類似于“A、B或C中的至少一個等”的慣用語被使用的那些情況下，通常這樣的結(jié)構(gòu)意指本領域的技術(shù)人員將理解該慣用語(例如，“具有A、B或C中的至少一個的系統(tǒng)”將包括但不局限于具有單獨的A，單獨的B，單獨的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系統(tǒng)。本領域的技術(shù)人員應進一步理解，無論在說明書、權(quán)利要求書或附圖中的通常表示兩個或多個可選術(shù)語的轉(zhuǎn)折詞和/或短語應該被理解為設想包括術(shù)語中的一個、術(shù)語中任意一個或術(shù)語兩者的可能性。例如，短語“A或B”應被理解為包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，在按照馬庫什組描述本公開的特征或方面的情況下，本領域技術(shù)人員應認識到，因此也根據(jù)馬庫什組的任何單獨成員或成員的子組來描述本公開。

如本文所使用的，數(shù)字值通常在整個本文檔中以范圍格式呈現(xiàn)。但范圍格式的使用僅僅是為了方便和簡潔，并且不應被解釋為對本發(fā)明的范圍的固定的限制。因此，范圍的使用明確地包括所有可能的子范圍，在該范圍內(nèi)的所有單獨的數(shù)值，并且所有數(shù)值或數(shù)值范圍包括在這樣的范圍內(nèi)的整數(shù)和這樣的范圍內(nèi)的值或整數(shù)的分數(shù)，除非上下文另有明確指示。不管該范圍的寬度如何，在本專利文件中的所有上下文中都適用這種結(jié)構(gòu)。因此，本文公開的所有范圍還包括任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。任何列出的范圍可以容易地被認為是充分地描述以及使得相同的范圍能被分解為至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。舉非限制性示例而言，本文討論的每個范圍可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本領域技術(shù)人員應理解，所有的語言，例如“多至”，“至少”，“大于”，“少于”等包括所列舉的數(shù)字，并且是指可以隨后分解成如上所述的子范圍的范圍。最后，如本領域技術(shù)人員將理解的，范圍包括每個單獨的成員。因此，例如，具有1-3個物品的組是指具有1個、2個或3個物品的組。類似地，具有1-5個物品的組是指具有1個、2個、3個、4個或5個物品的組，等等。

雖然本文已公開了多種方面和實施方式，但是其他方面和實施方式對于本領域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。本文公開的各個方面和實施方式是為了說明的目的，而不意指是限制性的，真正的范圍和精神由所附權(quán)利要求指明。

本領域技術(shù)人員應理解，對于本文公開的這個和其他過程和方法，可以以不同的順序?qū)崿F(xiàn)在過程和方法中執(zhí)行的功能。此外，所概述的步驟和操作僅作為示例提供，并且一些步驟和操作可以是任選的，組合成更少的步驟和操作，或者擴展到附加的步驟和操作中，而不偏離所公開的實施方式的本質(zhì)。

本領域技術(shù)人員應理解，對于本文公開的這個和其他過程和方法，可以以不同的順序?qū)崿F(xiàn)在過程和方法中執(zhí)行的功能。此外，所概述的步驟和操作僅作為示例提供，并且一些步驟和操作可以是任選的，組合成更少的步驟和操作，或者擴展到附加的步驟和操作中，而不偏離所公開的實施方式的本質(zhì)。

以下闡述的示例說明了某些實施方式，并且不限制本技術(shù)。

實施例

實施例1：RT6P.acnes菌株的分離

使用E-swab(Fisher)如下所述從人皮膚收集細菌：要求志愿受試者用肥皂和水清洗他們的臉，并且在它們的臉頰和前額上應用E-swab之前用乙醇擦拭物清潔臉。接下來將施加器轉(zhuǎn)移到具有轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的管中。將管渦旋以將細菌釋放到培養(yǎng)基中。將100倍稀釋的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基涂布在RIC平板上。在厭氧生長一周后，在每個平板上觀察到菌落。這些菌落在BHI培養(yǎng)基中生長，直到它們達到用于DNA分離的合適密度。基因組DNA使用商業(yè)試劑盒(Epicentre)制備，并使用P.acnes特異性16S rDNA引物Pas9/Pas11(表1)進行PCR擴增。凝膠純化PCR片段并使用引物16SFseq進行測序。將序列與來自ATCC 11828(II型)和ATCC 6919(I型)的16S rDNA基因(NC_017550，

SEQ ID NO:290)進行比對。在核苷酸1315處顯示C轉(zhuǎn)換至T的菌落被歸類為II型RT6。還測試了RecA基因的菌落以確認它們屬于II型菌株。用引物RecAF/RecAR進行PCR擴增后，將片段凝膠純化并用引物RecAFseq和RecARseq測序。用兩種引物獲得的序列的組合覆蓋超過90％的RecA基因。將測序的RecA片段與來自ATCC11828和ATCC6919菌株的RecA基因進行參考序列比對。

表1.用于分離RT6P.acnes菌株的引物

實施例2.分子克隆

使用Q5高保真DNA聚合酶(New England Biolab)和PCR機(Eppendorf)根據(jù)制造商的建議進行PCR擴增。對于基因裝配反應，根據(jù)制造商的建議使用Gibson裝配方法(NEBuilder HiFi DNA裝配克隆試劑盒，New England Biolab)和Golden Gate裝配方法(NEB Golden Gate裝配試劑盒，New England Biolab)。

實施例3.基因組DNA的分離。

對Rhee(2011)所描述的程序進行微小的改變，通過酚-氯仿提取，從細菌菌株中分離總基因組DNA。P.acnes菌株在腦心浸液肉湯(BHI)中在37℃下培養(yǎng)直至晚對數(shù)期。收獲細胞后，將細胞沉淀用10mM Tris-Cl pH8.0,10mM Na 2EDTA再懸浮，并加入溶菌酶(最終濃度＝1mg/mL)。在37℃下孵育20分鐘后，加入10％的SDS(最終濃度＝1.4％)，并在冰上孵育10分鐘。裂解物用等體積的苯酚-氯仿混合物(25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇)提取3次，然后用乙醇沉淀DNA并干燥。

實施例4.P.acnes的電穿孔。

根據(jù)Cheong(2008)和Rhee等(2007)所述的方法轉(zhuǎn)化P.acnes。使細胞在13×100螺旋蓋管中，在含有用于液體培養(yǎng)基(broth)的Oxyrase(Oxyrase)的9mL的BHI中生長，直到OD 600nm達到約0.5。通過離心(4℃；4300g；10分鐘)收集細胞，并用冰冷的SG培養(yǎng)基(甘油，10％；蔗糖，0.5M)洗滌三次。使細胞重懸于SG培養(yǎng)基(約5×109-1010CFU/ml)中。立即使用這些電感受態(tài)細胞。將75微升細胞懸浮液與DNA混合并轉(zhuǎn)移至冷凍電穿孔杯(1mm間隙)。使用Bio-Rad電穿孔儀的電穿孔條件為1.5KV，25μF和600Ω。時間常數(shù)設定在8.5ms和10ms之間。電穿孔后，將細胞轉(zhuǎn)移到2ml預熱的(37℃)含有用于液體培養(yǎng)基的Oxyrase的BHI中。將這些細胞在37℃下孵育10小時。在室溫下通過離心(2000×g，10分鐘)收集細胞，并鋪在具有抗生素的加強的梭菌瓊脂平板上。將平板在37℃下在厭氧條件下孵育。

實施例5.枯草芽孢桿菌生長抑制菌株的構(gòu)建

將枯草芽孢桿菌菌株168的基因組DNA作為模板，使用引物(d-B_F:aggaaggaTCCATGGAAAATATATTAGACCTG(SEQ ID NO:224),d-B_R:ctatgaccatgattacgCGCATGAATAACGGTCGTATG(SEQ ID NO:225))，通過PCR擴增枯草芽孢桿菌的截短的dnaA基因。用引物(125_F:gcctgcaggtcgactTTAAGTTATTGGTATGACTGGTTTTAAG(SEQ ID NO:226),125_R:tccatggaTCCTTCCTCCTTTAATTGG(SEQ ID NO:227))通過PCR擴增具有氯霉素基因和IPTG誘導型啟動子的DNA區(qū)。這些PCR產(chǎn)物由 HiFi DNA裝配克隆試劑盒裝配。產(chǎn)物用HindIII消化，并且3,257bp片段是自身連接的。自身連接的DNA被轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌菌株中，并在具有Cm(5μg/mL)和不同濃度(0,0.05,0.1和0.25mM)的IPTG的LB上選擇轉(zhuǎn)化體。

實施例6.P.acnes的生長抑制菌株的構(gòu)建。

阿拉伯糖誘導型fts操縱子。使用枯草芽孢桿菌菌株168的基因組DNA作為模板，使用引物(araRE F:TGCAGTTCTAGACGACACAGGCTGACGAAATTA(SEQ ID NO:228),araRER:CGTAGCGAATTCCATTTCCCTGCCCTCCCGAA(SEQ ID NO:229))通過PCR擴增枯草芽孢桿菌的阿拉伯糖誘導型啟動子和調(diào)節(jié)子。將1468bp的PCR產(chǎn)物連接到通過XbaI和EcoRI水解的pUC18中。痤瘡丙酸桿菌的截短fts操縱子通過PCR用痤瘡丙酸桿菌菌株ATCC11828的基因組DNA作為模板，使用引物(ftzope F:CTGACTGAATTCGCTTCCCAACGGGGCCGTTT(SEQ ID NO:230),ftzope R:GACTGCGAATTCCTGAAGAGCCGTCACCGACA(SEQ ID NO:231))擴增。將EcoRI水解的1332bp的PCR產(chǎn)物連接到也通過EcoRI水解的具有阿拉伯糖啟動子的pUC18中。在插入具有紅霉素基因的1236bp的DNA后，將該質(zhì)粒導入痤瘡丙酸桿菌菌株中，并且在具有L-阿拉伯糖(1.5％w/v)的經(jīng)修飾的增強的梭菌培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。

實施例7.乳糖誘導型dnaA基因。

通過PCR使用痤瘡丙酸桿菌菌株ATCC11828的基因組DNA作為模板，使用引物(0410-1F:GGCTTCTGGTCTCGAGTGTTGTGGAACGACAACA(SEQ ID NO:232),0410-1R:GGCTTCTGGTCTCGATGGCACCAACCTTAGAGAG(SEQ ID NO:233),0410-2F:GGCTTCTGGTCTCGCCATGTCCGACACACCGTTC(SEQ ID NO:234),0410-2R:GGCTTCTGGTCTCGGGTAGAGACTGGGTAGAGACG(SEQ ID NO:235))擴增痤瘡丙酸桿菌的β-半乳糖啟動子區(qū)和截短的dnaA基因。將這些PCR產(chǎn)物和具有抗生素基因、紅霉素和氯霉素基因的DNA片段通過Golden Gate裝配法(NEB Golden Gate裝配試劑盒，New England Biolab)連接到pUC18中。將該質(zhì)粒導入痤瘡丙酸桿菌菌株中，并在具有乳糖(1.0％w/v)的經(jīng)修飾的增強的梭菌培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。

表2.引物列表

實施例8.CAMPII突變痤瘡丙酸桿菌菌株的構(gòu)建。

從痤瘡丙酸桿菌的CAMPII基因的起始密碼子，通過PCR用痤瘡丙酸桿菌ATCC11828菌株的基因組DNA作為模板，使用引物(0422NB-1F:AGTAAACTTGGTCTGACATGAAGAAGACCCATCTTG(SEQ ID NO:242),0422NB-1R:TATATATATTTATTATCCGATGGACCTTGTTTTGGAGAG(SEQ ID NO:243))擴增400bp的截短的ORF。將438bp的PCR產(chǎn)物和具有紅霉素和氯霉素抗性基因的DNA片段通過NEBuilder HiFi DNA裝配克隆試劑盒與pUC18連接，并且在具有amp(100μg/mL)和cm(20mg/mL)的LB平板上選擇該連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dcm-dam-菌株后，將質(zhì)粒導入痤瘡丙酸桿菌中，并在具有erm(5μg/mL)或cm(5μg/mL)的增強的梭菌培養(yǎng)基平板上厭氧選擇。通過PCR檢查CAMPII突變菌落。

實施例9.無標記突變痤瘡丙酸桿菌菌株的構(gòu)建(圖9)。

通過PCR擴增靶基因的上游和下游區(qū)域。這些區(qū)域應大于500bp。將這些DNA片段與具有抗生素標記并且不具有痤瘡丙酸桿菌的復制起點的質(zhì)粒連接。將該自殺載體引入痤瘡丙酸桿菌中，并且通過抗生素選擇轉(zhuǎn)化體。在確認這些之后，將細胞在不含抗生素的增強的梭菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)以允許第二同源重組。在平板上劃線后，通過PCR篩選無標記突變菌落。

實施例10.乳糖誘導型IL10分泌痤瘡丙酸桿菌菌株的構(gòu)建。

通過PCR，用痤瘡丙酸桿菌菌株ATCC11828的基因組DNA作為模板，使用引物(0505-1F:TAAACTTGGTCTGACAGTGCGCACCGATGAGCGGCAGA(SEQ ID NO:244),0505-1_R:TTGCAAACATGGCACCAACCTTAGAGAGTCATG(SEQ ID NO:245))擴增痤瘡丙酸桿菌的1037bp的β-半乳糖啟動子區(qū)。對于IL10的分泌，通過PCR使用枯草芽孢桿菌菌株168的基因組DNA作為模板，使用引物(0505-2_F:GGTTGGTGCCATGTTTGCAAAACGATTCAAAAC(SEQ ID NO:246),0505-2_R:AGGAGTGCATATGATAAATAGACATGGTTCCG(SEQ ID NO:247))擴增188bp的信號肽區(qū)。通過PCR(0505-3_F:CTATTTATCATATGCACTCCTCCGCTCTG(SEQ ID NO:248),0505-3_R:TTATCCGATTCATGAGACTGTCAGTTGCGGATCTTCATGG(SEQ ID NO:249))擴增568bp的人IL10ORF。這些PCR產(chǎn)物和具有紅霉素和氯霉素抗性基因的DNA片段通過NEBuilder HiFi DNA裝配克隆試劑盒與pUC18連接，并且在具有amp(100μg/mL)和cm(20mg/mL)的LB平板上選擇該連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dcm-dam-菌株后，質(zhì)粒被導入痤瘡丙酸桿菌中，并在具有erm(5μg/mL)或cm(5μg/mL)的增強的梭菌培養(yǎng)基平板上被厭氧選擇。通過PCR檢查轉(zhuǎn)化體后，通過ELISA分析乳糖的誘導和IL10的分泌。

實施例11.MC/9細胞培養(yǎng)。

鼠MC/9細胞從ATCC(CRL-8306)獲得，并在補充有10％FBS(Gibco)、10％大鼠T-STIM(BD)、2mM谷氨酸、0.05mM 2-巰基乙醇和青霉素/鏈霉素(pen/strep)的DMEM中繁殖。將細胞在5％CO₂培養(yǎng)箱中在37℃下以2×10⁵個細胞/ml的密度保持。

實施例12.IL-10的功能測定。

使用用于人IL-10的商業(yè)ELISA(Biolegend)對純化的重組人IL-10進行定量。通過使用MC/9細胞增殖的劑量依賴性共刺激(用人IL-4)測試表達的IL-10的生物活性。簡言之，將細胞離心并用RPMI1640(Gibco)洗滌兩次以除去生長培養(yǎng)基中所有痕量的Rat-T-STIM。接下來，將細胞重懸于補充有10％的FBS、2mM的谷氨酸、青霉素/鏈霉素、2-巰基乙醇和200pg/ml人IL-4(Peprotech)的DMEM中，并以20,000細胞/孔的密度涂布在96孔板中。使用商業(yè)重組人IL-10(Peprotech)產(chǎn)生標準曲線。細胞生長82小時，并使用XTT試驗(Biotium)測定細胞增殖。

實施例13.R6II型P.acnes的分離。

檢查分離的痤瘡丙酸桿菌菌株以確定它們是什么核糖型，目的是分離II型的RT6痤瘡丙酸桿菌。從來自II型和I型菌株的RecA基因的比對(圖10)，我們可以看到10個核苷酸差異。這些變異用于鑒定痤瘡丙酸桿菌的亞型。ATCC菌株11828用作II型痤瘡丙酸桿菌的陽性對照。

從推定的RT6克隆測序的RecA基因與來自ATTCC11828菌株的RecA基因的區(qū)域720-1191比對(圖11)。與I型菌株NCTC 737的比對顯示5bp的變異，從而表明菌落是II型菌株。

另外，從推定的RT6克隆測序的RecA基因與來自ATTCC11828菌株(SEQ ID NO:276)的RecA基因的區(qū)域64-325進行比對。與I型菌株NCTC 737(SEQ ID NO:277)的比對顯示3bp的變異，從而表明菌落是II型菌株。

ATCC11828的SNP序列與來自文獻的RT6SNP序列和9個分離株(1315處的C→T)比對(圖12)。來自我們研究的9個分離的菌株與公開的RT6SNP序列匹配(例如,Fitz-Gibbon,S.,et al.,(2013)Invest.Dermatol.,133(9):2152-60)。

實施例14.將人IL-10、EGF和HGH基因敲入RT6痤瘡丙酸桿菌菌株。

人IL-10、人EGF和人GH的基因都在誘導型LacZ啟動子下克隆到單獨的痤瘡丙酸桿菌菌株中。當用0.1mM IPTG孵育細胞時，我們開始看到在生長培養(yǎng)基中的相應基因的表達和分泌(圖13)。

實施例15.通過將誘導型啟動子引入管家基因使痤瘡丙酸桿菌生長停滯。

痤瘡丙酸桿菌的生長僅在通過IPTG誘導時可實現(xiàn)(表3)。用阿拉伯糖誘導型啟動子制備相同的構(gòu)建體，使得可以通過單獨的營養(yǎng)物控制人基因分泌和生長停滯。

表3.

實施例16.痤瘡丙酸桿菌的CAMPII突變體和IL-10表達菌株的構(gòu)建。

通過PCR用痤瘡ATCC 11828菌株的基因組DNA擴增來自痤瘡丙酸桿菌的CAMPII ORF的上游的1100bp的區(qū)域(引物Up-C F和Up-C R)和400bp的截短的CAMPII ORF(引物CAMPII F和CAMPII R)。對于IL10的分泌，通過PCR用枯草芽孢桿菌菌株168的基因組DNA作為模板(引物Sig-C F和Sig-C R)產(chǎn)生168bp的信號肽區(qū)。通過PCR(引物I10-C F和I10-C R)擴增568bp的人IL10ORF。這些PCR產(chǎn)物和具有紅霉素抗性基因的DNA片段通過NEBuilder HiFi DNA裝配克隆試劑盒與pUC19連接，并且在具有amp(100μg/mL)的LB平板上選擇該連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dcm-dam-菌株后，質(zhì)粒被導入痤瘡丙酸桿菌中，并在具有erm(5μg/mL)的增強的梭菌培養(yǎng)基(RCM)平板上被厭氧選擇。通過PCR檢查具有CAMPII啟動子和信號肽的IL-10基因的轉(zhuǎn)化體。對于CAMPII突變菌株的構(gòu)建，將該轉(zhuǎn)化體在無紅霉素的RCM中培養(yǎng)，以允許第二次同源重組。在平板上劃線后，通過PCR篩選CAMPII突變體菌落。

表4.引物列表

實施例17.痤瘡丙酸桿菌的GAPDH突變體和IL-10表達菌株的構(gòu)建。

通過PCR利用痤瘡ATCC 11828菌株的基因組DNA擴增痤瘡丙酸桿菌的GAPDH ORF(引物Up-G F和Up-G R)的1000bp的上游區(qū)域和400bp的截短的GAPDH ORF(引物Gapdh F和gapdh R)。對于IL10的分泌，使用枯草芽孢桿菌菌株168的基因組DNA作為模板(引物Sig-G F和Sig-G R)通過PCR產(chǎn)生168bp的信號肽區(qū)。通過PCR擴增568bp的人IL10ORF(引物I10-G F和I10-G R)。這些PCR產(chǎn)物和具有紅霉素抗性基因的DNA片段通過NEBuilder HiFi DNA裝配克隆試劑盒與pUC19連接，并且在具有amp(100μg/mL)的LB平板上選擇該連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dcm-dam-菌株后，質(zhì)粒被導入痤瘡丙酸桿菌中，并在具有erm(5μg/mL)的增強的梭菌培養(yǎng)基(RCM)平板上被厭氧選擇。通過PCR檢查具有帶有GAPDH啟動子和信號肽的IL-10基因的轉(zhuǎn)化體。為了構(gòu)建GAPDH突變菌株，將該轉(zhuǎn)化體在含有乳酸鹽和無紅霉素的經(jīng)修飾的RCM(m-RCM)中培養(yǎng)，以允許第二同源重組。在含乳酸鹽的m-RCM和RCM平板上劃線后，挑選僅在含乳酸鹽的m-RCM上生長的菌落，并通過PCR檢查這些突變體。

表5.引物列表

實施例18.參考文獻

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Rhee MS,Moritz BE,Xie G,Glavina Del Rio T,Dalin E,Tice H,Bruce D,Goodwin L,Chertkov O,Brettin T,Han C,Detter C,Pitluck S,Land ML,Patel M,Ou M,Harbrucker R,Ingram LO,Shanmugam KT.(2011).Complete Genome Sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium,Bacillus coagulans strain.Standards in Genomic Sciences 5,331-340.

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實施例19.代表性的非限制性實施方案。

A1.一種制備用于治療的肽的受控表達的核酸的方法，其包括提供編碼用于受控表達的操縱子序列的第一核酸序列；

將所述第一核酸序列與編碼第一肽的第二核酸序列連接；以及

優(yōu)化用于治療的肽的受控表達的核酸以用于蛋白質(zhì)表達。

A2.根據(jù)實施方案A1所述的方法，其中所述操縱子是原核生物操縱子。

A3.根據(jù)實施方案A2所述的方法，其中所述操縱子是lac操縱子。

A4.根據(jù)實施方案A2所述的方法，其中所述操縱子是Trp操縱子。

A5.根據(jù)實施方案A1所述的方法，其中所述操縱子是真核生物操縱子。

A6.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含透明質(zhì)酸合酶或其部分。

A7.根據(jù)實施方案A6所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸合酶或其部分包含序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

A8.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含彈性蛋白或其部分。

A9.根據(jù)實施方案A8所述的方法，其中所述彈性蛋白或其部分包含序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,或SEQ ID NO:17。

A10.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含膠原或其部分。

A11.根據(jù)實施方案A10所述的方法，其中所述膠原或其部分包含序列SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:23。

A12.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含抗炎劑或其部分。

A13.根據(jù)實施方案A12所述的方法，其中所述抗炎劑是白介素或其一部分。

A14.根據(jù)實施方案A12或A13所述的方法，其中所述抗炎劑或其部分包含序列SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,或SEQ ID NO:28。

A15.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含凝血因子或其部分。

A16.根據(jù)實施方案A15所述的方法，其中所述凝血因子或其部分包含序列SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,或SEQ ID NO:39。

A17.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含用于黑色素合成的酶或其部分。

A18.根據(jù)實施方案A17所述的方法，其中所述用于黑色素合成的酶或其部分包含序列SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,或SEQ ID NO:44。

A19.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含激素或其部分。

A20.根據(jù)實施方案A19所述的方法，其中所述激素或其部分包含序列SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49。

A21.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含血小板堿性蛋白或其部分。

A22.根據(jù)實施方案A21所述的方法，其中所述血小板堿性蛋白或其部分包含序列SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,或SEQ ID NO:62。

A23.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含轉(zhuǎn)化生長因子或其部分。

A24.根據(jù)實施方案A23所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,或SEQ ID NO:69。

A25.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含肝細胞生長因子或其部分。

A26.根據(jù)實施方案A25所述的方法，其中所述肝細胞生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:70。

A27.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含血管內(nèi)皮生長因子或其部分。

A28.根據(jù)實施方案A27所述的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,或SEQ ID NO:91。

A29.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含胎盤生長因子或其部分。

A30.根據(jù)實施方案A29所述的方法，其中所述胎盤生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:92。

A31.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含血小板衍生生長因子或其部分。

A32.根據(jù)實施方案A31所述的方法，其中所述血小板衍生生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,或SEQ ID NO:102。

A33.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含表皮生長因子或其部分。

A34.根據(jù)實施方案A33所述的方法，其中所述表皮生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:106。

A35.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含成纖維細胞生長因子或其部分。

A36.根據(jù)實施方案A35所述的方法，其中所述成纖維細胞生長因子或其部分包含序列SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:117,SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121,SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:124,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:127,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:133,SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:135,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:137,SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:142,SEQ ID NO:143,或SEQ ID NO:144。

A37.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含DNA修復酶或其部分。

A38.根據(jù)實施方案A37所述的方法，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自堿基切除修復酶。

A39.根據(jù)實施方案A37或A38中任一項所述的方法，其中所述DNA修復酶或其部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:147,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:149,SEQ ID NO:150,SEQ ID NO:151,SEQ ID NO:152,SEQ ID NO:153,SEQ ID NO:154,或SEQ ID NO:155。

A40.根據(jù)實施方案A37所述的方法，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自用于直接逆轉(zhuǎn)損傷的酶。

A41.根據(jù)實施方案A37或A40所述的方法，其中所述用于直接逆轉(zhuǎn)損傷的酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:157或SEQ ID NO:158。

A42.根據(jù)實施方案A37所述的方法，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自錯配切除修復酶。

A43.根據(jù)實施方案A37或A42所述的方法，其中所述錯配切除修復酶包含氨基酸序列EQ ID NO:159,SEQ ID NO:160SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:162,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:167或SEQ ID NO:168。

A44.根據(jù)實施方案A37所述的方法，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自核苷酸切除修復酶。

A45.根據(jù)實施方案A37或A44所述的方法，其中所述核苷酸切除修復酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:170SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:174,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:180SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:186,SEQ ID NO:187,SEQ ID NO:188,SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:192,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:196,或SEQ ID NO:197。

A46.根據(jù)實施方案A37所述的方法，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自編輯或加工核酸酶。

A47.根據(jù)實施方案A37或A46所述的方法，其中所述編輯或加工核酸酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:198，SEQ ID NO:199，SEQ ID NO:200，SEQ ID NO:201，SEQ ID NO:202，SEQ ID NO:203，SEQ ID NO:204或SEQ ID NO:205。

A48.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含端粒酶或其部分。

A49.根據(jù)實施方案A48所述的方法，其中所述端粒酶或其部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:206，SEQ ID NO:207，SEQ ID NO:208或SEQ ID NO:209。

A50.根據(jù)實施方案A1-A5中任一項所述的方法，其中所述第一肽包含端粒酶蛋白1的保護物或其部分。

A51.根據(jù)實施方案A50所述的方法，其中所述端粒酶蛋白1的保護物或其部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:210或SEQ ID NO:211。

A52.根據(jù)實施方案A1-A5、A8-A16或A19-A51中任一項所述的方法，其還包括提供編碼第二肽的第三核酸序列，并在一端將所述第三核酸序列連接至編碼所述第一肽的所述第二核酸序列，其中所述第三核酸序列位于編碼所述操縱子序列的所述第一核酸序列和編碼所述第一肽的所述第二核酸序列之間。

A53.根據(jù)實施方案A1-A5、A8-A16或A19-A51中任一項所述所述的方法，還包括提供編碼第二肽的第三核酸序列，并將所述第三核酸序列在一端連接至編碼所述第一肽的所述第二核酸序列端，其中所述第三核酸序列位于所述第二核酸序列的與編碼所述操縱子序列的第一核酸序列相對的末端。

A54.根據(jù)實施方案A52或A53所述的方法，其中所述第二肽包含SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121,SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:124,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:127 SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:133,SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:135,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:137 SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:142,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:149,SEQ ID NO:150,SEQ ID NO:151,SEQ ID NO:152,SEQ ID NO:153,SEQ ID NO:154,SEQ ID NO:155,SEQ ID NO:156,SEQ ID NO:157 SEQ ID NO:158,SEQ ID NO:159,SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:162,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:167SEQ ID NO:168,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:170,SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:174,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:180,SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:187SEQ ID NO:188,SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190,SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:192,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:196,SEQ ID NO:197SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:199,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:201,SEQ ID NO:202,SEQ ID NO:203,SEQ ID NO:204,SEQ ID NO:205,SEQ ID NO:206,SEQ ID NO:207SEQ ID NO:208,SEQ ID NO:209,SEQ ID NO:210,或SEQ ID NO:211，并且其中所述第二肽不包含所述第一肽的所述氨基酸序列。

A55.根據(jù)實施方案A1-A5、A8-A16或A19-A51中任一項所述所述的方法，還包括提供編碼分泌肽的核酸序列，并將編碼所述分泌肽的所述核酸序列在一端連接到編碼所述操縱子的所述核酸序列，其中所述編碼分泌肽的所述核酸位于操縱子序列和編碼第一肽的第二核酸序列之間。

A56.根據(jù)實施方案A1-A5、A8-A16或A19-A51中任一項所述的方法，其還包括提供編碼分泌肽的核酸序列，并將所述核酸序列與編碼所述編碼第一肽的第二核酸序列的所述核酸序列在一端連接，其中所述編碼分泌肽的核酸序列位于編碼所述操縱子的所述核酸序列的相對端。

A57.根據(jù)實施方案A52-A54中任一項所述的方法，其還包括提供編碼分泌肽的核酸序列，并將所述編碼分泌肽的核酸序列在一端連接到所述編碼操縱子的核酸序列，其中所述編碼分泌肽的核酸位于操縱子序列和編碼所述第一肽的第二核酸序列或編碼所述第二肽的第三核酸序列之間。

A58.根據(jù)實施方案A52-A54中任一項所述的方法，其還包括提供編碼分泌肽的核酸序列，并在一端將所述編碼分泌肽的核酸序列連接至編碼所述編碼第一肽的第二核酸序列的核酸序列，或?qū)⑺鼍幋a分泌肽的核酸序列連接至編碼所述編碼第二肽的第三核酸序列的核酸序列，其中所述編碼分泌肽的核酸序列位于操縱子序列的相對端。

A59.根據(jù)實施方案A55-A58中任一項所述的方法，其中所述分泌肽包含序列SEQ ID NO:212，SEQ ID NO:213，SEQ ID NO:214，SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:216。

A60.根據(jù)實施方案A1-A59中任一項所述的方法，其中所述優(yōu)化通過計算方法進行。

A61.一種用于用于治療的肽的受控表達的核酸核酸，其包含編碼用于受控表達的操縱子序列的第一核酸序列；編碼第一肽的第二核酸序列；并且其中所述用于用于治療的肽的受控表達的核酸核酸針對蛋白質(zhì)表達進行優(yōu)化。

A62.根據(jù)實施方案A61的核酸，其中所述操縱子是原核生物操縱子。

A63.根據(jù)實施方案A61或A62所述的核酸，其中所述操縱子是lac操縱子。

A64.根據(jù)實施方案A61或A62所述的核酸，其中所述操縱子是Trp操縱子。

A65.根據(jù)實施方案A61所述的核酸，其中所述操縱子是真核生物操縱子。

A66.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含透明質(zhì)酸合酶或其部分。

A67.根據(jù)實施方案A66所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

A68.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含彈性蛋白或其部分。

A69.根據(jù)實施方案A68所述的核酸，其中第一肽包含序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,或SEQ ID NO:17。

A70.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含膠原或其部分。

A71.根據(jù)實施方案A70所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，或SEQ ID NO:23。

A72.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含抗炎劑或其部分。

A73.根據(jù)實施方案A72所述的核酸，其中所述抗炎劑是白介素或其一部分。

A74.根據(jù)實施方案A72或A73中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28。

A75.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含凝血因子或其部分。

A76.根據(jù)實施方案A75所述的核酸，其中第一肽包含序列SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ IDNO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38，或SEQ ID NO:39。

A77.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含用于黑色素合成的酶或其部分。

A78.根據(jù)實施方案A77所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:40，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44。

A79.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含激素或其部分。

A80.根據(jù)實施方案A79所述的核酸，其中用于治療的第一肽包含序列SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:48，或SEQ ID NO:49。

A81.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含血小板堿性蛋白或其部分。

A82.根據(jù)實施方案A81所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,或SEQ ID NO:62。

A83.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含轉(zhuǎn)化生長因子或其部分。

A84.根據(jù)實施方案A83所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,或SEQ ID NO:69。

A85.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含肝細胞生長因子或其部分。

A86.根據(jù)實施方案A85所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:70。

A87.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含血管內(nèi)皮生長因子或其部分。

A88.根據(jù)實施方案A87所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,或SEQ ID NO:91。

A89.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含胎盤生長因子或其部分。

A90.根據(jù)實施方案A89所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:92。

A91.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含血小板衍生生長因子或其部分。

A92.根據(jù)實施方案A91所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102。

A93.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含表皮生長因子或其部分。

A94.根據(jù)實施方案A93所述的核酸，其中所述第一肽包含序列SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:104，SEQ ID NO:105，或SEQ ID NO:106。

A95.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含成纖維細胞生長因子或其部分。

A96.根據(jù)實施方案A96所述的核酸，其中第一肽包含序列SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:117,SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121,SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:124,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:127,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:133,SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:135,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:137,SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:142,或SEQ ID NO:144。

A97.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含DNA修復酶或其部分。

A98.根據(jù)實施方案A97所述的核酸，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自堿基切除修復酶。

A99.根據(jù)實施方案A97或A98中任一項所述的核酸，其中所述DNA修復酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:147,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:149,SEQ ID NO:150,SEQ ID NO:151,SEQ ID NO:152,SEQ ID NO:153,SEQ ID NO:154,或SEQ ID NO:155。

A100.根據(jù)實施方案A97所述的核酸，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自用于直接逆轉(zhuǎn)損傷的酶。

A101.根據(jù)實施方案A97或A100所述的核酸，其中所述DNA修復酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:156，SEQ ID NO:157，或SEQ ID NO:158。

A102.根據(jù)實施方案A97所述的核酸，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自錯配切除修復酶。

A103.根據(jù)實施方案A97或A103所述的核酸，其中所述DNA修復酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:159,SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:162,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:167,或SEQ ID NO:168。

A104.根據(jù)實施方案A97所述的核酸，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自核苷酸切除修復酶。

A105.根據(jù)實施方案A97或A104所述的核酸，其中所述DNA修復酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:170SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:174,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:180SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:186,SEQ ID NO:187,SEQ ID NO:188,SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:192,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:196,或SEQ ID NO:197。

A106.根據(jù)實施方案A97所述的核酸，其中所述DNA修復酶或其部分衍生自編輯或加工核酸酶。

A107.根據(jù)實施方案A97或A106所述的核酸，其中所述DNA修復酶包含氨基酸序列SEQ NO:198,SEQ ID NO:199,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:201,SEQ ID NO:202,SEQ ID NO:203,SEQ ID NO:204,或SEQ IDNO:205。

A108.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含端粒酶或其部分。

A109.根據(jù)實施方案A108所述的核酸，其中所述端粒酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:206，SEQ ID NO:207，SEQ ID NO:208，或SEQ ID NO:209。

A110.根據(jù)實施方案A61-A65中任一項所述的核酸，其中所述第一肽包含端粒酶蛋白1的保護物或其部分。

A111.根據(jù)實施方案A110所述的核酸，其中所述端粒酶蛋白1的保護物包含氨基酸序列SEQ ID NO:210或SEQ ID NO:211。

A112.根據(jù)實施方案A61-A65、A68-A76或A79-A111中任一項所述的核酸，其還包含編碼第二肽的第三核酸序列，并且其中所述第三核酸序列位于所述編碼操縱子序列的第一核酸序列和所述編碼第一肽的第二核酸序列之間。

A113.根據(jù)實施方案A61-A65、A68-A76或A79-A111中任一項所述的核酸，其還包含編碼第二肽的第三核酸序列，并且其中所述第三核酸序列在所述編碼操縱子序列的第一核酸序列的相對端連接于所述編碼第一肽的第二核酸序列。

A114.根據(jù)實施方案A112或A113所述的核酸，其中所述第二肽包含SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:121,SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:124,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:127 SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:133,SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:135,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:137 SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:142,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:149,SEQ ID NO:150,SEQ ID NO:151,SEQ ID NO:152,SEQ ID NO:153,SEQ ID NO:154,SEQ ID NO:155,SEQ ID NO:156,SEQ ID NO:157 SEQ ID NO:158,SEQ ID NO:159,SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:162,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:167SEQ ID NO:168,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:170,SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:174,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:177 SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:180,SEQ ID NO:181,SEQ ID NO:182,SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:184,SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:187 SEQ ID NO:188,SEQ ID NO:189,SEQ ID NO:190,SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:192,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:196,SEQ ID NO:197 SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:199,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:201,SEQ ID NO:202,SEQ ID NO:203,SEQ ID NO:204,SEQ ID NO:205,SEQ ID NO:206,SEQ ID NO:207SEQ ID NO:208,SEQ ID NO:209,SEQ ID NO:210,或SEQ ID NO:211，并且其中所述第二肽不包含所述第一肽的氨基酸序列。

A115.根據(jù)實施方案A61-A65、A68-A76或A79-A111中任一項所述的核酸，其還包含編碼分泌肽的核酸序列，并且其中所述編碼分泌肽的核酸序列位于所述操縱子序列和所述編碼第一肽的第二核酸序列之間。

A116.根據(jù)實施方案A61-A65、A68-A76或A79-A111中任一項所述的核酸，其還包含編碼分泌肽的核酸序列，并且其中所述編碼分泌肽的核酸序列在一端連接于所述編碼第一肽的第二核酸序列并且在所述操縱子序列的相對端。

A117.根據(jù)實施方案A112-A114中任一項所述的核酸，其還包含編碼分泌肽的核酸序列，并且其中所述編碼分泌肽的核酸序列連接于所述編碼第一肽的第二核酸序列或所述編碼第二肽的第三核酸序列，并且其中所述編碼分泌肽的核酸序列位于所述編碼操縱子的核酸和所述編碼第一肽的第二核酸序列或所述編碼第二肽的第三核酸序列之間。

A118.根據(jù)實施方案A112-A114中任一項所述的核酸，其還包含編碼分泌肽的核酸序列，并且其中所述編碼分泌肽的核酸序列連接于所述編碼第一肽的第二核酸序列或所述編碼第二肽的第三核酸序列，并且其中所述編碼分泌肽的核酸序列位于所述編碼操縱子的核酸的相對端。

A119.根據(jù)實施方案A115-A118中任一項所述的核酸，其中所述用于分泌的信號序列包含序列SEQ ID NO:212，SEQ ID NO:213，SEQ ID NO:214，SEQ ID NO:215，或SEQ ID NO:216。

A120.根據(jù)實施方案A57-A119中任一項所述的核酸，其中通過計算方法優(yōu)化所述核酸以用于蛋白質(zhì)表達。

A121.一種包含在任一實施方案或?qū)嵤┓桨窤57-A120所述的核酸中的任一種的細胞。

A122.根據(jù)實施方案A121所述的細胞，其中所述細胞包含具有突變或基因敲除的基因組。

A123.根據(jù)實施方案A121或A122所述的細胞，其中所述細胞是細菌細胞。

A124.根據(jù)實施方案A121或A122所述的細胞，其中所述細胞是真菌細胞。

A125.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自丙酸桿菌屬。

A126.根據(jù)實施方案A121-A122或A125中任一項所述的細胞，其中所述細胞是痤瘡丙酸桿菌。

A127.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自棒狀桿菌屬。

A128.根據(jù)實施方案A121-A122或A127中任一項所述的細胞，其中所述細胞是紋帶棒狀桿菌。

A129.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自葡萄球菌屬。

A130.根據(jù)實施方案A121-A122或A129中任一項所述的細胞，其中所述細胞是表皮葡萄球菌。

A131.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自鏈球菌屬。

A132.根據(jù)實施方案A121-A122或A131中任一項所述的細胞，其中所述細胞是嗜熱鏈球菌。

A133.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述所述的細胞，其中所述細胞來自乳桿菌屬。

A134.根據(jù)實施方案A121-A122或A133中任一項所述的細胞，其中所述細胞是嗜酸乳桿菌。

A135.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自乳球菌屬。

A136.根據(jù)實施方案A121-A122或A135中任一項所述的細胞，其中所述細胞是乳酸乳球菌。

A137.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自放線菌(Actinobacteria)屬。

A138.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自微球菌屬。

A139.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述所述的細胞，其中所述細胞來自蠕形螨菌屬。

A140.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自馬拉色霉菌屬。

A141.根據(jù)實施方案A121-A122中任一項所述的細胞，其中所述細胞來自埃希氏菌屬。

A142.根據(jù)實施方案A121-A122或A142中任一項所述的細胞，其中所述細胞是大腸桿菌。

A143.根據(jù)實施方案A121-A142中任一項所述的細胞，其中所述細胞是非致病性的。

A144.根據(jù)實施方案A121、A122或A124所述的細胞，其中所述細胞來自假絲酵母屬。

A145.根據(jù)實施方案A121、A122、A124或A144中任一項所述的細胞，其中所述細胞是白色念珠菌。

A146.根據(jù)實施方案A121、A122、A124或A144中任一項所述的細胞，其中所述細胞是光滑念珠菌。

A147.根據(jù)實施方案A121、A122、A124或A144中任一項所述的細胞，其中所述細胞是熱帶假絲酵母。

A148.根據(jù)實施方案A121、A122、A124或A144中任一項所述的細胞，其中所述細胞是近平滑假絲酵母。

A149.根據(jù)實施方案A121、A122、A124或A144中任一項所述的細胞，其中所述細胞是克勞斯假絲酵母。

A150.根據(jù)實施方案A121-A149中任一項所述的細胞，其中所述突變或敲除是在脂肪酶基因中。

A151.根據(jù)實施方案A121-A149中任一項所述的細胞，其中所述突變或敲除在編碼以進行營養(yǎng)物合成的基因中。

A152.根據(jù)實施方案A121-A149中任一項所述的細胞，其中所述突變或敲除在編碼致病生物分子的基因中。

A153.根據(jù)實施方案A121-A123、A125-A126或A152中任一項所述的細胞，其中所述細胞包含具有在編碼谷氨酰胺合成酶的基因中的突變或敲除的基因組。

A154.根據(jù)實施方案A121-A123、A125-A126或A152中任一項所述的細胞，其中所述細胞包含在編碼天冬酰胺合成酶的基因中具有突變或敲除的基因組。

A155.根據(jù)實施方案A121-A123、A125-A126或A152中任一項所述的細胞，其中所述細胞包含在編碼天冬氨酸激酶的基因中具有突變或敲除的基因組。

A156.根據(jù)實施方案A121-A123、A125-A126或A152中任一項所述的細胞，其中所述細胞包含在編碼天冬氨酸半醛脫氫酶的基因中具有突變或敲除的基因組。

A157.根據(jù)實施方案A121-A123、A125-A126或A152中任一項所述的細胞，其中所述細胞包含在編碼用于甲硫氨酸合成的基因中具有突變或敲除的基因組。

A158.一種包含實施方案A121-A157中任一項所述的細胞和用于所述細胞的載體的局部制劑。

A159.一種通過遞送受控表達的肽來治療、抑制或改善受試者中的病癥的方法，其包括向受試者施用實施方案A158中的局部制劑以用于肽的受控遞送。

A160.根據(jù)實施方案A159所述的方法，其中所述疾病是痤瘡、玫瑰痤瘡、脫發(fā)、甲真菌病、腋臭、變白毛發(fā)、皮膚炎癥、皮膚變色、老化損傷、慢性皮膚傷口、皮膚炎癥、指甲真菌、自身免疫疾病或血友病。

A161.根據(jù)實施方案A159或A160所述的方法，其中所述施用包括將所述組合物置于表皮上。

A162.根據(jù)實施方案A159-A161中任一項所述的方法，還包括控制所述肽的表達，其中控制通過施用第二化合物進行。

A163.根據(jù)實施方案A162所述的方法，其中所述第二化合物是乳糖。

A164.根據(jù)實施方案A162所述的方法，其中所述第二化合物是色氨酸。

A165.根據(jù)實施方案A159-A164中任一項所述的方法，還包括控制細胞的增殖，其中控制增殖通過施用第三化合物進行。

A166.根據(jù)實施方案A165所述的方法，其中所述第三化合物為營養(yǎng)物。

A167.根據(jù)實施方案A165或A166所述的方法，其中所述第三化合物是氨基酸。

A168.根據(jù)實施方案A165-A67中任一項所述的方法，其中所述第三化合物是谷氨酰胺。

A169.根據(jù)實施方案A165-A67任一項所述的方法，其中所述第三化合物是天冬酰胺。

A170.根據(jù)實施方案A165-A67任一項所述的方法，其中所述第三化合物是天冬氨酸。

A171.根據(jù)實施方案A165-A67任一項所述的方法，其中所述第三化合物是甲硫氨酸。

B1.包含本文公開的丙酸桿菌屬的經(jīng)遺傳修飾的細菌的組合物的用于治療哺乳動物的皮膚或指甲疾病的用途，其中所述細菌包含編碼一種或多種哺乳動物生長因子和/或一種或多種哺乳動物細胞因子的核酸。

B2.根據(jù)實施方案B1所述的細菌的用途，其中所述哺乳動物是人、狗或貓。

B3.根據(jù)實施方案B1或B2所述的細菌的用途，其中所述皮膚或指甲病癥包括痤瘡、光化性角化病、斑禿、運動員腳、甲真菌病、特應性皮炎、腋臭、濕疹、指甲真菌感染、牛皮癬、玫瑰痤瘡、慢性傷口愈合、毛囊炎、毛發(fā)角化病、口周皮炎、血管纖維瘤、皮膚炎癥、老化損傷、皮膚變色、過早變白毛發(fā)或皮脂溢。