在分析或治療使用欠豐富細(xì)胞，例如白血細(xì)胞或干細(xì)胞之前，通常需要從全血中分離紅血細(xì)胞(RBC)。許多常規(guī)血細(xì)胞分離程序需要初步消除紅血細(xì)胞和減少樣本體積。這些步驟通常在長(zhǎng)期細(xì)胞庫(kù)和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中實(shí)施，其中在減少體積中需要最大產(chǎn)量的核血細(xì)胞以用于直接移植或存儲(chǔ)以便未來(lái)使用。

這些方法經(jīng)常使用葡聚糖作為聚集劑以增強(qiáng)紅血細(xì)胞從全血中的沉積。該制造方法的關(guān)鍵部分是試劑盒的殺菌，其通過(guò)暴露于劑量為20到50kGy之間的伽馬輻照中完成，該劑量足夠確保殺菌?？上У氖?，水中的葡聚糖對(duì)伽馬輻照是不穩(wěn)定的，會(huì)引起葡聚糖的嚴(yán)重的分子量分解。例如，3,300kD分子量的葡聚糖在暴露于僅20kGy劑量的伽馬輻照的情況下將分解到小于20kD。另外，加入的葡聚糖的RBC沉積增強(qiáng)性能是它的分子量的函數(shù)，并且該性能在分子量低于200kD時(shí)是無(wú)效的。結(jié)果，葡聚糖溶液必須通過(guò)高壓蒸汽或過(guò)濾的方法對(duì)溶液?jiǎn)为?dú)殺菌，接著用伽馬消毒過(guò)的試劑盒重新裝配，這增加了成本和制造期間潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。

因此需要伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液，其允許葡聚糖更直接地參與到處置和制造過(guò)程中，以確保穩(wěn)定性，同時(shí)也減少處置錯(cuò)誤和成本。

概述

通常，本發(fā)明的方法和試劑盒提供了伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液，其可以通過(guò)伽馬輻照殺菌，同時(shí)保持足夠的分子量以隨后充當(dāng)紅血細(xì)胞(RBC)聚集劑。這增加了血液分離的效率，因?yàn)槠暇厶侨芤嚎梢灾苯訁⑴c到處置和制造過(guò)程中。

一個(gè)實(shí)施方案提供了一種葡聚糖水溶液，其對(duì)伽馬輻照穩(wěn)定。所述溶液包含1到10wt/v％的葡聚糖，其中所述葡聚糖具有大于500kD的初始平均分子量，和2.0到20.0wt％的加到所述葡聚糖的抗壞血酸或它的無(wú)機(jī)鹽。

在另一實(shí)施方案中，提供一種用于產(chǎn)生伽馬穩(wěn)定的葡聚糖水溶液的試劑盒，包含具有大于500kD初始平均分子量的葡聚糖，和2.0到20.0wt％的加到所述葡聚糖的抗壞血酸或它的無(wú)機(jī)鹽。

在另一實(shí)施方案中，提供一種用于將伽馬穩(wěn)定的水溶液加到血樣本(外周血、臍帶血)中的方法，導(dǎo)致提高的紅血細(xì)胞(RBC)聚集和沉積，同時(shí)回收大百分比的總有核細(xì)胞(total nucleated cells，TNC)。所述方法包括以下步驟：使包含抗壞血酸或抗壞血酸的無(wú)機(jī)鹽的葡聚糖溶液經(jīng)受伽馬輻照，加到血樣本中，孵育以使RBC聚集，并且回收TNC。

附圖說(shuō)明

當(dāng)參考附圖閱讀以下的詳述章節(jié)時(shí)，本發(fā)明的這些和其他特征、方面和益處將變得更好地理解。

圖1是使用伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液沉積細(xì)胞的過(guò)程的流程圖，所述伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液通過(guò)暴露到伽馬輻照進(jìn)行殺菌。

詳述

以下詳述是示例性的，并且不是意在限制所申請(qǐng)的發(fā)明和本發(fā)明的應(yīng)用。另外，在以下詳細(xì)說(shuō)明中不打算通過(guò)本發(fā)明的

背景技術(shù)：
中介紹的任何理論進(jìn)行限制。為了更清楚地和簡(jiǎn)明地描述和指明所要求保護(hù)的發(fā)明的主題，提供用于以下的說(shuō)明和隨附權(quán)利要求的特定術(shù)語(yǔ)的下列定義。

除非另外指明，冠詞“一個(gè)/種”指的是一個(gè)或多于一個(gè)被冠詞“一個(gè)/種”修飾的詞語(yǔ)。除非另外指明，表示用于說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中的成分的量、性質(zhì)例如分子量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)該被理解為在所有情況下均被詞語(yǔ)“約”修飾。因此，除非指明是相反情況，在以下說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中描述的數(shù)字參數(shù)是近似值，其可以取決于試圖通過(guò)本發(fā)明獲得的期望的性質(zhì)而變化。最起碼是，并且不試圖限制權(quán)利要求的范圍的等同原則的應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)依據(jù)所報(bào)道的有效數(shù)字的數(shù)目和通過(guò)應(yīng)用普通的舍入技術(shù)來(lái)至少解釋每個(gè)數(shù)字參數(shù)。

“葡聚糖”指的是分子量≥1000道爾頓(Da)的多糖，其具有α-鏈接的D-吡喃葡萄糖基重復(fù)單元的線(xiàn)性骨架并且通常具有從3,000Da到2,000,000Da范圍的分子量。經(jīng)常根據(jù)分子量分類(lèi)。例如，葡聚糖500指的是平均分子量為500kDa。葡聚糖1230指的是平均分子量為1230kDa。

“試劑盒”在本文中稱(chēng)為對(duì)給定的測(cè)定、試驗(yàn)或方法必要的一種或多種反應(yīng)劑或添加劑。所述試劑盒也可以包括使用試劑盒中存在的反應(yīng)劑或添加劑的一套指示、對(duì)保持處理?xiàng)l件必要的任何緩沖液或其他供使用的任選的材料。在某些情況中，所述試劑盒可以包含用于給定測(cè)定、試驗(yàn)或方法的預(yù)先測(cè)定量的反應(yīng)劑或添加劑。

在某些實(shí)施方案中，提供了伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液，所述溶液包含葡聚糖、抗壞血酸或抗壞血酸的無(wú)機(jī)鹽的水溶液。在某些實(shí)施方案中，所述葡聚糖溶液是約1到10wt％葡聚糖的水溶液。優(yōu)選水溶液中的葡聚糖為1到5wt％并且更優(yōu)選地為2到4wt％葡聚糖。在某些實(shí)施方案中，加入的葡聚糖的紅血細(xì)胞沉積增強(qiáng)性能是分子量的函數(shù)，并且它在低于200kD分子量時(shí)是無(wú)效的。因此在某些實(shí)施方案中，在伽馬輻照之后葡聚糖具有大于約200kDa的分子量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，伽馬輻照之后分子量的范圍是約200-800kDa，且最優(yōu)選地葡聚糖具有約400-600kDa范圍的分子量。在某些實(shí)施方案中，伽馬輻照的劑量為20到50kGy之間，并且更優(yōu)選劑量為25到45kGy之間。

在某些實(shí)施方案中，抗壞血酸是無(wú)機(jī)鹽，包括但不限于抗壞血酸鈉、抗壞血酸鈣、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鎂、抗壞血酸鋅或它們的組合。在某些實(shí)施方案中，無(wú)機(jī)鹽是抗壞血酸鈉。

在某些實(shí)施方案中，葡聚糖水溶液中加入的抗壞血酸或其無(wú)機(jī)鹽的量為約2到20wt％，在優(yōu)選實(shí)施方案中為4到15wt％，并且更優(yōu)選為4到10wt％。在某些其他實(shí)施方案中，無(wú)機(jī)鹽被直接加到葡聚糖中，量為約2到20wt％，在優(yōu)選實(shí)施方案中為4到15wt％，并且更優(yōu)選為4到10wt％?？箟难峄蛩臒o(wú)機(jī)鹽可以充當(dāng)輻照穩(wěn)定劑，將葡聚糖的分子量保持在足夠充當(dāng)聚集劑以增強(qiáng)RBC沉積的水平下。

在某些實(shí)施方案中，伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液可以進(jìn)一步包含緩沖液。所述緩沖液包含有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽，其保持4.0到8.0的pH，例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。所述溶液也可以包含其他無(wú)毒的增強(qiáng)劑，例如檸檬酸鈉、琥珀酸鈉和它們的組合。無(wú)毒增強(qiáng)劑的用途、使紅血細(xì)胞聚集的方法和它關(guān)于系統(tǒng)和方法的用途進(jìn)一步在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/325672，題目為“SYSTEMS AND METHODS FOR PROCESSING COMPLEX BIOLOGICAL MATERIALS”的申請(qǐng)中描述，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。

如圖1中所示，在某些實(shí)施方案中，一種沉積細(xì)胞的方法改善了回收結(jié)果，提高了從包含紅血細(xì)胞(RBC)的樣本中回收總有核細(xì)胞(TNC)的百分比，其中所述方法包括以下步驟：將RBC樣本加到包含抗壞血酸或抗壞血酸的無(wú)機(jī)鹽的前述的伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液中(步驟A)。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將樣本孵育以使多個(gè)RBC聚集和沉積(步驟C)，和/或最后回收TNC(步驟D)。例如，步驟C和D通常在長(zhǎng)期細(xì)胞庫(kù)和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中進(jìn)行，其中在減少的體積中需要最大產(chǎn)量的核血細(xì)胞以用于直接移植或存儲(chǔ)以便未來(lái)使用(步驟D)。在某些實(shí)施方案中，回收TNC的方法可以包括在收集之前濃縮液相。所述液相包含血漿和葡聚糖，并且因此濃縮可以通過(guò)包括離心、膜過(guò)濾或方法的組合的許多方法完成。

在某些實(shí)施方案中，包含RBC的樣本是全血，在某些其他實(shí)施方案中包含RBC的樣本是血組分，例如但不限于包括骨髓和移動(dòng)的外周血的分離的血成分。

在某些實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，其包含對(duì)產(chǎn)生伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液必要的反應(yīng)劑和添加劑。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含葡聚糖、抗壞血酸或抗壞血酸的無(wú)機(jī)鹽。在某些實(shí)施方案中，所述葡聚糖具有在暴露于伽馬輻照后足夠保持大于約200kD的MW的分子量(MW)。在某些實(shí)施方案中，葡聚糖的初始分子量為大于500kD，在優(yōu)選實(shí)施方案中為大于750kD并且最優(yōu)選為大于1000kD。在某些其他實(shí)施方案中，葡聚糖的初始分子量為1000kD和2000kD之間，在優(yōu)選實(shí)施方案中葡聚糖的初始分子量為約1000-1500kD。

在某些實(shí)施方案中，試劑盒的組分以一定量干混，當(dāng)加到水溶液中時(shí)，產(chǎn)生約1到10wt％葡聚糖的水溶液的伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液。當(dāng)在水溶液中使用時(shí)優(yōu)選葡聚糖為1到5wt％并且更優(yōu)選地為2到4wt％葡聚糖。

在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水(PBS)、鹽水和/或其他無(wú)毒增強(qiáng)劑，例如檸檬酸鈉、琥珀酸鈉和它們的組合。所述添加劑可以以這樣的方式組合，當(dāng)一起加到水溶液中時(shí)，得到了伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒以分開(kāi)提供單個(gè)組分的方式制備。在其他實(shí)施方案中，制備所述試劑盒，使得固體形式的組分可以被一起預(yù)先混合和供應(yīng)。還在其他實(shí)施方案中，制備所述試劑盒，使得某些組分在溶液中提供。

用于沉積血細(xì)胞的本發(fā)明的方法和試劑盒通常包括加入伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液以加速RBC的沉積。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含紅血細(xì)胞的樣本通過(guò)加入被輻照的伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液進(jìn)行處理，接著孵育所述樣本，并且最終回收總有核細(xì)胞(TNC)。

從包含紅血細(xì)胞的樣本中回收一定百分比的TNC的一種或多種方法包括加入預(yù)定濃度的已經(jīng)被輻照過(guò)的伽馬穩(wěn)定的葡聚糖溶液，孵育所述樣本，并且最終回收總有核細(xì)胞。

實(shí)施例

本發(fā)明的實(shí)施將從以下實(shí)施例中得到更全面的理解，其在本文中僅以展示的目的提供，并且不應(yīng)認(rèn)為是以任何方式限制本發(fā)明。

材料：人臍帶血用于實(shí)驗(yàn)。用于該實(shí)施例的葡聚糖1230從GE Healthcare(烏普薩拉，瑞典)獲得。甲酸銨和抗壞血酸鈉從Sigma-Aldrich(圣路易斯，密蘇里州)獲得。檸檬酸鈉從Thermo Fisher Scientific(沃爾瑟姆，馬塞諸瑟州)獲得。純葡聚糖樣本通過(guò)將約37.5mM的抗壞血酸鈉和2.25％(w/v)的葡聚糖溶解在40％(v/v)的鹽水(Baxter，Deerfield IL)和31.6％(v/v)注射用水(Baxter IL)中制備。允許葡聚糖和檸檬酸鈉溶解2小時(shí)，之后加入剩下的鹽水以達(dá)到期望的體積。允許所有的樣本在分析之前溶解至少2小時(shí)。

葡聚糖的分析使用凝膠滲透色譜法與多角度激光光散射組合完成。

靜態(tài)光散射分析與水相凝膠滲透色譜法的組合使用Agilent 1100系列HPLC與串聯(lián)到Wyatt Optilab DSP干涉折射率檢測(cè)器的Wyatt Technologies Dawn EOS多角度光散射檢測(cè)器組合實(shí)現(xiàn)。光散射檢測(cè)器在折射率(DRI)數(shù)據(jù)采集的上游在18個(gè)角度下收集散射光。DRI檢測(cè)器的功能在于從具有已知折射率增量值(DN/DC)的給定分析物的RI響應(yīng)中提供濃度項(xiàng)，以用于摩爾質(zhì)量的第一原理計(jì)算方程式。使用2.0mM甲酸銨(pH 4-5)的等度洗脫實(shí)施色譜法。摩爾質(zhì)量值使用如從Zimm形式體系(formalism)推導(dǎo)的第一原理計(jì)算而獲得。

在1ml/min運(yùn)行的流速下在如表1中簡(jiǎn)述的環(huán)境溫度下使用2個(gè)串聯(lián)的Tosoh PW柱(1-G6000和1-G3000水性SEC柱(7.5×300mm))實(shí)施GPC分離。

表1.用于葡聚糖的凝膠滲透色譜法與多角度激光光散射/差分折射率檢測(cè)的組合的方法參數(shù)

表2顯示了將1.0到10.0wt％的抗壞血酸或它的鈉鹽加到葡聚糖水溶液中接著暴露到40kGy劑量的伽馬輻照(鈷60)的作用。

表2.暴露到40kGy劑量的伽馬輻照的葡聚糖溶液

如可以從表3中的數(shù)據(jù)中看到，甚至在低的20kGy劑量的伽馬輻照下注意到嚴(yán)重的Mw降低。然而，明顯觀(guān)察到加入wt％抗壞血酸相對(duì)于分子量保持的顯著響應(yīng)為約4wt％。

表3. 20kGy實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在20kGy的較低的劑量下(表3)，需要顯著較少的抗壞血酸鹽以保持分子量。

具有大于200kD的Mw的葡聚糖對(duì)于理想的沉積性能來(lái)說(shuō)是合乎需要的。使用開(kāi)始的高分子量葡聚糖與抗壞血酸的存在的組合可以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)。然而因?yàn)榭箟难岬拇嬖?，仍然需要確保臍帶血的沉積性能。

紅血細(xì)胞聚集的程度通過(guò)在20ml試管(來(lái)自Globe Scienfific)中將5ml臍帶血(來(lái)自紐約血液中心)與10ml葡聚糖水溶液(來(lái)自表4)混合來(lái)體外測(cè)量。還在沒(méi)有抗壞血酸鈉的情況下制備對(duì)照樣本。試管被蓋上蓋子并且通過(guò)反復(fù)上下倒置試管使內(nèi)容物混合良好。讓內(nèi)容物在重力下靜置并且在0、10、20、40和60分鐘時(shí)測(cè)量RBC丸料的高度。

如表4中所示，將許多上述樣本加到臍帶血中以評(píng)估RBC沉積性能。

表4.沉積性能

表4顯示了在抗壞血酸鈉存在下伽馬輻照過(guò)的葡聚糖使RBC聚集到與具有或不具有抗壞血酸鈉的未輻照過(guò)的葡聚糖類(lèi)似的程度。

雖然僅有本發(fā)明的某些特征已經(jīng)在本文中展示和描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可以進(jìn)行許多修飾和改變。因此，應(yīng)該理解當(dāng)它們落入本發(fā)明的真實(shí)精神內(nèi)時(shí)，隨附權(quán)利要求旨在涵蓋所有的這樣的修改和改變。