發(fā)明背景。

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)異丁醇的方法，其中乳酸催化轉(zhuǎn)化為異丁醇。

背景

4-碳醇化合物例如正丁醇和異丁醇是重要的工業(yè)化學(xué)品，可用作燃料添加劑、塑料工業(yè)中的原料以及作為食品級(jí)提取的試劑。由于需求增加，石化行業(yè)每年都會(huì)生產(chǎn)更多量的這類醇。

通常，這些醇通過化學(xué)合成或通過生物方法生產(chǎn)。正丁醇和異丁醇二者可以通過丙烯的加氫甲?；曰瘜W(xué)方式生產(chǎn)，在該方法中丙烯與包含銠的催化劑接觸，導(dǎo)致丙烯的加氫甲?；?，形成丁醛和異丁醛。之后，醛被氫化，形成相應(yīng)的醇(丁醇或異丁醇)，如歐洲專利ep1733003b1(其內(nèi)容通過整體引用并入本文)所述。此外，正丁醇可以通過稱作abe發(fā)酵的眾所周知的代謝途徑以生物學(xué)方式生產(chǎn)(jonesandwoods,1986；berezina等人,2012)。這種使用丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)(一種廣泛使用的微生物)的發(fā)酵廣泛應(yīng)用于工業(yè)中。

關(guān)于異丁醇，不存在能夠?yàn)楣I(yè)過程生產(chǎn)足夠量的該化合物的遺傳未修飾的微生物。盡管已知，當(dāng)?shù)礊槔i氨酸時(shí)，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)能夠生產(chǎn)異丁醇(dickinson等人，1998)，使用該氨基酸作為氮源的培養(yǎng)基在經(jīng)濟(jì)上是不可行的。

因此，異丁醇已經(jīng)常規(guī)地通過使用遺傳修飾過的生物體發(fā)酵來生產(chǎn)。通常已知遺傳修飾過的生物體例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和大腸桿菌(escherichiacoli)增加異丁醇的生產(chǎn)，如專利us7851188、us7910342、us7993889、us8017375、us8017376、us8071358、us8097440、us8133715、us8153415、us8158404、us8178328、us8232089、us8241878、us8273558、us8273565和us8283144中所述(其內(nèi)容通過整體引用并入本文)。這些專利中描述的原料通常是糖，例如葡萄糖、蔗糖或果糖，如專利us7851188、us8017375、us8178328和us8283144所強(qiáng)調(diào)。雖然這種技術(shù)已經(jīng)有進(jìn)展，但重要的是，請(qǐng)注意，存在與使用遺傳修飾過的生物體生產(chǎn)異丁醇有關(guān)的各種缺點(diǎn)，例如：

1.必須存在大量的活細(xì)胞以有效地進(jìn)行該過程。如果存在少量細(xì)胞，則發(fā)酵過程變得非常緩慢。這個(gè)事實(shí)在本領(lǐng)域是眾所周知的。

2.將外源代謝途徑引入生物體意味著其自身代謝途徑之間競爭的增加，因?yàn)樘剂髟谖⑸锷L和異丁醇生產(chǎn)之間分配。它阻止了過程達(dá)到接近理論產(chǎn)率的值(例如，對(duì)于葡萄糖的情況，從1g葡萄糖獲得0.411克異丁醇)。因此，為了達(dá)到可接受的產(chǎn)率，表達(dá)生產(chǎn)異丁醇的代謝途徑是不夠的；還需要從代謝途徑除去基因以減少與異丁醇生產(chǎn)的競爭。例如，專利us7993889、us8017375、us8133715、us8153415、us8178328和us8273565中描述了已經(jīng)去除了編碼丙酮酸脫羧酶的基因。此外，如在專利us8071358、us8097440、us8133715、us8153415和us8273565中所述，已經(jīng)去除了編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。類似地，如專利us8158404中所述，已經(jīng)去除了編碼醛脫氫酶的基因。

3.此外，為了增加異丁醇的產(chǎn)率，還需要過表達(dá)內(nèi)源和/或外源基因以建立異丁醇生產(chǎn)的生物化學(xué)途徑。例如，如專利us8017376、us8071358和us8273565中所述，aft基因的過表達(dá)增加了參與異丁醇合成的酶的活性。

4.本領(lǐng)域中通常已知的是，如上述2和3中所述的去除基因和/或過表達(dá)基因常常使生物體代謝不穩(wěn)定。

因此，期望有不發(fā)生各種底物的相互作用或競爭并且不發(fā)生與該方法相關(guān)聯(lián)的微生物生長的方法。

鑒于這種需要，歐洲專利ep2204453描述了一種酶促異丁醇生產(chǎn)(其內(nèi)容通過引用整體并入本文)。然而，為了進(jìn)行該方法，使用葡萄糖作為原料，其需要至少5種酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸。除了使用若干酶來生產(chǎn)丙酮酸之外，專利ep2204453b1還描述了體系的操作溫度高于50℃。這是由于在較低溫度下催化從葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸的酶的效率降低。另一方面，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的一些酶在20℃至37℃的溫度下有效地工作。因此，如專利ep2204453的實(shí)施例特別是實(shí)施例10所提到，由于酶體系的不相容性，這些酶中的一些可能在短時(shí)間內(nèi)喪失其催化活性。

另一方面，專利申請(qǐng)公開ep2700714a1(其內(nèi)容通過整體引用并入本文)描述了與專利ep2204453b1非常相似的方案，但是使用至少13種酶來進(jìn)行該方法。

除了與常規(guī)生產(chǎn)異丁醇的方法相關(guān)聯(lián)的上述缺點(diǎn)之外，還應(yīng)當(dāng)注意，在現(xiàn)有技術(shù)中不存在其中由乳酸生產(chǎn)異丁醇且異丁醇的生產(chǎn)酶促進(jìn)行的方法。此外，在現(xiàn)有技術(shù)中不存在其中那些酶的作用以連續(xù)和穩(wěn)定的方式長時(shí)間再生電子受體和供體分子的方法。

概述

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供由乳酸生產(chǎn)異丁醇的酶促方法，其中將異丁醇的生產(chǎn)與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生相關(guān)聯(lián)并且其中該方法可不與微生物的生長相關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是將由乳酸生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh再生體系相關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是將由乳酸生產(chǎn)異丁醇與nadp⁺/nadph再生體系相關(guān)聯(lián)。

同時(shí)，本發(fā)明的另一個(gè)目的是將由乳酸生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh和nadp⁺/nadph的混合物的再生體系相關(guān)聯(lián)。

類似地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方法，其中將由乳酸生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系相關(guān)聯(lián)，并且其中可以在受控環(huán)境中進(jìn)行，其中反應(yīng)混合物中的任一種成分可以再循環(huán)到該方法中。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)一種方法，其中在間歇過程中將nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系與由乳酸生產(chǎn)異丁醇相關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)一種方法，其中在半連續(xù)過程中將nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系與由乳酸生產(chǎn)異丁醇相關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)一種方法，其中在連續(xù)過程中將nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系與由乳酸生產(chǎn)異丁醇相關(guān)聯(lián)。

已經(jīng)通過發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)異丁醇的方法來滿足單獨(dú)或組合的這些和其它目的，所述方法包括：混合水、乳酸、酶混合物以制備反應(yīng)混合物，所述酶混合物包含至少一種酶、至少一種輔因子和至少一種輔酶；讓乳酸在反應(yīng)混合物中催化轉(zhuǎn)化足夠量的時(shí)間以生產(chǎn)異丁醇；并從b)中通過催化轉(zhuǎn)化得到的反應(yīng)物中分離異丁醇。將b)中乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系相關(guān)聯(lián)。

附圖簡述

圖1顯示了與由乳酸生產(chǎn)異丁醇相關(guān)聯(lián)的nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系的方案。

圖2顯示了說明間歇生產(chǎn)異丁醇的方法的行為模式的圖表。

圖3顯示了說明在cstr反應(yīng)器中連續(xù)生產(chǎn)異丁醇的方法的行為模式的圖表。

圖4顯示了說明沿著pbr反應(yīng)器的z軸連續(xù)生產(chǎn)異丁醇的方法的行為模式的圖表。

詳述

為了理解本發(fā)明的目的，提供以下定義和縮寫：

術(shù)語“乳酸(lacticacid)”、“乳酸(lactate)”、“2-羥基丙酸”和“α-羥基丙酸”是指相同的分子，其中該分子具有三個(gè)碳并具有以下分子式：h3c-choh-cooh(c3h6o3)。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“乳酸”是指在國際數(shù)據(jù)庫中記錄的標(biāo)識(shí)號(hào)為cas50-21-5、79-33-4、10326-41-7、598-82-3的任何異構(gòu)體或異構(gòu)體混合物，其可以是l-乳酸或d-乳酸或兩者的任何比例的混合物。此外，為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“乳酸(乳酸根)(lactate)”等同于“乳酸(lacticacid)”，因?yàn)樵谌芤褐胁⑶腋鶕?jù)ph，“乳酸”可以以其離子形式存在?！叭樗帷笨梢砸圆煌姆绞将@得，無論是生物學(xué)方式還是化學(xué)方式。在生物學(xué)方式中，“乳酸”可以例如通過有機(jī)化合物的發(fā)酵來獲得。一些產(chǎn)“乳酸”生物體包括大腸桿菌(escherichiacoli)、干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)、德氏乳酸桿菌(lactobacillusdelbrueckii)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)等。在化學(xué)方式中，“乳酸”可以從乙醇、氰化鈉和硫酸得到；用氰化物對(duì)醛羰基的親核攻擊終止該過程以形成外消旋形式的乳酸的腈。該腈在水和過量的硫酸存在下水解以得到游離的“乳酸”。

術(shù)語“丙酮酸(pyruvate)”、“丙酮酸(pyruvicacid)”、“2-氧代丙酸”、“α-酮基丙酸(ketopropionicacid)”、“丙酮酸(pyroracemicacid)”和“乙酰甲酸”是指相同的分子；該分子具有三個(gè)碳，并具有以下分子式：ch3cocooh(c3h4o3,cas：127-17-3)。

術(shù)語“2-乙酰乳酸(acetolacticacid)”、“2-乙酰乳酸(acetolactate)”、“2-羥基-2-甲基-3-氧代丁酸”和“2-乙?；樗帷笔侵赶嗤姆肿樱贿@種分子具有五個(gè)碳，并具有以下分子式：ch3coc(ch3)ohcooh(c5h8o4,cas：未得到)。

術(shù)語“2,3-二羥基戊酸(dihydroxyvalerate)”、“2,3-二羥基-3-甲基丁酸(methylbutanoate)”、“2,3-二羥基-異戊酸(isovalerate)”、“2,3-二羥基-異戊酸(isovalericacid)”是指相同的分子；該分子具有五個(gè)碳，并具有以下分子式(ch3)2cohchohcooh(c5h10o4,cas：1756-18-9)。

術(shù)語“酮異戊酸”、“酮異戊酸”、“3-甲基-2-氧代丁酸”、“2-氧代異戊酸(2-oxoisovalerate)”、“2-氧代異戊酸(2-oxoisopentanoate)”和“2-酮基纈氨酸(2-ketovaline)”是指相同的分子；這種分子具有五個(gè)碳，并具有以下分子式(ch3)2chcocooh(c5h8o3,cas：759-05-7)。

術(shù)語“異丁醛”、“2-甲基丙醛(2-methylpropanal)”和“2-甲基丙醛(2-methylpropionaldehyde)”是指相同的分子；這種分子具有四個(gè)碳，并具有以下分子式(ch3)2chcho(c4h8o，cas：78-84-2)。

術(shù)語“異丁醇(isobutanol)”、“異丁醇(isobutylalcohol)”和“2-甲基-1-丙醇”是指相同的分子；這種分子具有四個(gè)碳，并具有以下分子式(ch3)2chch2oh(c4h10o,cas：78-83-1)。

術(shù)語“還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)”和“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad⁺)”是指將電子從一個(gè)分子傳輸?shù)搅硪粋€(gè)分子并進(jìn)行氧化-還原反應(yīng)或氧化還原反應(yīng)的細(xì)胞代謝的分子。

術(shù)語“還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)”和“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp⁺)”是指將電子從一個(gè)分子傳輸?shù)搅硪粋€(gè)分子并進(jìn)行氧化-還原反應(yīng)或氧化還原反應(yīng)的細(xì)胞代謝的分子。

為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“nad(p)⁺”等同于術(shù)語“nad⁺”和/或“nadp⁺”，并且術(shù)語“nad(p)h”的使用等同于術(shù)語“nadh”和/或“nadph”。

術(shù)語“理論產(chǎn)率”是指通過反應(yīng)可以獲得的產(chǎn)物的最大量，并且通過化學(xué)計(jì)量方程計(jì)算。理論產(chǎn)率可以與通過基于反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量計(jì)算的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)獲得的產(chǎn)物的理論量進(jìn)行比較。

術(shù)語“實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率”是指相對(duì)于消耗的底物量而言通過化學(xué)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)上獲得的產(chǎn)物的量。

術(shù)語“轉(zhuǎn)化效率”是指從實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率和理論產(chǎn)率之間的比率獲得的百分比，其值可以在0至100％之間變化。

術(shù)語“氧化還原反應(yīng)”和“多個(gè)氧化還原反應(yīng)”是指由酶作用介導(dǎo)的生物化學(xué)反應(yīng)，其中一種化合物被還原，另一種被氧化。由于nadh或nadph(氧化劑)和nad⁺或nadp⁺(還原劑)的存在，這些反應(yīng)可能在細(xì)胞中發(fā)生。

術(shù)語“多肽”和“酶”是指能夠進(jìn)行從起始化合物到最終化合物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的包括氨基酸殘基的有機(jī)分子，其中起始和最終化合物可以在分子上和/或空間上不同。

術(shù)語“基因”或“多個(gè)基因”是指生物分子，其由現(xiàn)有技術(shù)中已知的作為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的氮化合物或堿基組成。這些基因是在細(xì)胞中傳遞用于合成生物酶的信息的分子。

術(shù)語“反應(yīng)器”是指由合適的材料構(gòu)建的物理容器，其中可以以受控的方式發(fā)生化學(xué)、生物化學(xué)、生物反應(yīng)或其組合。在現(xiàn)有技術(shù)中可以找到不同類型的反應(yīng)器。作為實(shí)例，提及連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器(cstr)、活塞流反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器(pbr)。反應(yīng)器的一些特性可以包括：a)耐歸因于反應(yīng)的腐蝕性；b)監(jiān)測和控制例如溫度、攪拌、ph、溶解氣體的濃度、壓力等操作變量的能力；c)其操作模式，可以是連續(xù)的、半連續(xù)的或間歇的(反應(yīng)器可以操作的各種操作模式在本領(lǐng)域中可能是已知的)；d)其使用不同類型催化劑進(jìn)行反應(yīng)的能力；例如，催化劑可以被溶解，或可被捕獲或固定(催化劑可以催化反應(yīng)的各種模式可能在本領(lǐng)域中是已知的)。

術(shù)語“輔因子”是指酶的作用所需的無機(jī)化合物，例如mg²⁺、fe²⁺、zn²⁺、na⁺、k⁺、co²⁺、ni²⁺、mn²⁺等。

術(shù)語“底物”是指酶在其上反應(yīng)的分子。酶對(duì)于底物可以是特異性的和選擇性的。

術(shù)語“酶混合物”和“酶的混合物”是指在相同溶液中發(fā)現(xiàn)的一組酶，其能夠確保由乳酸生產(chǎn)異丁醇。酶混合物和酶的混合物可以在與本發(fā)明方法中使用的乳酸或其它組分混合之前制備。在一個(gè)方面，在與乳酸或其它組分混合之前，酶可以在諸如管、罐或反應(yīng)器的容器中混合。

酶混合物中酶的濃度可以大于0.001g/l、大于0.01g/l或優(yōu)選大于0.1g/l。

當(dāng)酶如下定義固定時(shí)，酶混合物中的酶的濃度可以大于0.001g/g載體、大于0.01g/g載體或優(yōu)選大于0.1g/g載體。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，酶混合物可包括以下酶中的至少一種：乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27和/或ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.1y/oec1.1.1.2)及其類似物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，酶混合物可包括乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27和/或ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.1y/oec1.1.1.2)。

術(shù)語“輔酶”是指對(duì)于一些酶的活性必需的有機(jī)和非蛋白化合物。輔酶的實(shí)例包括“黃素腺嘌呤二核苷酸(fad)”、“焦磷酸硫胺素(thpp)”、“黃素單核苷酸(fmn)”等。

術(shù)語“反應(yīng)混合物”是指在水相、油相、氣相或固相中的化合物集合，其可以經(jīng)歷多肽或多肽混合物的催化反應(yīng)。反應(yīng)混合物可以包括酶混合物、輔因子、輔酶、nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph和乳酸，或可以由這些組成。反應(yīng)混合物可以通過將化合物在適于制備混合物的容器中混合來制備。例如，可以使用管、罐或反應(yīng)器來制備反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物可以通過用合適的方法混合化合物來促進(jìn)一酶和底物之間的相互作用來制備。

當(dāng)反應(yīng)混合物包括乳酸時(shí)，反應(yīng)混合物中乳酸的濃度可以至少為1g/l、20g/l、100g/l、200g/l，或優(yōu)選300g/l。

術(shù)語“順次”是指以下有序轉(zhuǎn)化：通過乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27和/或ec1.1.1.28)將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，通過乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸，通過酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸，通過二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)將2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸，通過酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛，通過醇脫氫酶(ec1.1.1.1和/或ec1.1.1.2)將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇。

術(shù)語“多酶體系”是指將乳酸順次轉(zhuǎn)化為異丁醇的一組酶。

術(shù)語“基因刪除”是指刪除編碼蛋白的dna區(qū)的過程。

術(shù)語“外源基因”是指生物體外編碼蛋白的dna區(qū)域。

術(shù)語“內(nèi)源基因”是指編碼生物體內(nèi)天然蛋白的dna區(qū)域。

術(shù)語“過表達(dá)”是指由內(nèi)源或外源基因編碼的蛋白的增加的表達(dá)水平。

術(shù)語“nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph的再生”是指：由可能催化這些轉(zhuǎn)化的任何酶的作用產(chǎn)生的nad⁺和/或nadp⁺分子向nadh和/或nadph分子的轉(zhuǎn)化；以及由可能催化這些轉(zhuǎn)化的任何酶的作用產(chǎn)生的nadh和/或nadph分子向nad⁺和/或nadp⁺的轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)換可以在相同的反應(yīng)體系中找到。

術(shù)語“游離酶”是指分布在溶液中的酶。

術(shù)語“多種游離酶”是指分布在溶液中的一組酶。

術(shù)語“載體”是指固體或半固體的惰性基質(zhì)，其優(yōu)選不改變其蛋白結(jié)構(gòu)。載體可以是可適合于固定酶的任何種類的載體。載體的實(shí)例可包括但不限于沸石、活性炭、丙烯酰胺、二氧化硅凝膠、瓊脂糖、藻酸鹽、砂或其任何組合。

術(shù)語“固定化的酶”是指通過任何物理或化學(xué)方法在“載體”上或在“載體”中附著的、捕獲的、包埋的、粘附的、吸附的、結(jié)合的、固著等的酶。

術(shù)語“多種固定化的酶”是指通過任何物理或化學(xué)方法在“載體”中或在“載體”上附著的、捕獲的、包埋的、粘附的、吸附的、結(jié)合的、固著等的一組酶。

術(shù)語“l(fā)-乳酸脫氫酶”、“l(fā)(+)-nldh”、“l(fā)-(+)-乳酸脫氫酶”、“l(fā)-乳酸脫氫酶(l-lacticdehydrogenase)”、“l(fā)-乳酸脫氫酶(l-lacticaciddehydrogenase)”、“nad⁺-依賴性l-乳酸脫氫酶”和“l(fā)-乳酸脫氫酶(l-lacticdehydrogenase)”(ec1.1.1.27)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括將化合物l-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化l-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是l-乳酸脫氫酶的類似物?？梢源呋痩-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的酶的實(shí)例描述于表1中。表1中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表1.可用于將l-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的l-乳酸脫氫酶的實(shí)例

術(shù)語“d-乳酸脫氫酶”、“d-特異性乳酸脫氫酶”、“d-(-)-乳酸脫氫酶(nad⁺)”、“d-乳酸脫氫酶(lacticaciddehydrogenase)”、“d-乳酸脫氫酶(d-lacticdehydrogenase)”(ec1.1.1.28)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括將化合物d-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化d-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是d-乳酸脫氫酶的類似物?？梢源呋痙-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的酶的實(shí)例描述于表2中。表2中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表2.可用于將d-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的d-乳酸脫氫酶的實(shí)例

術(shù)語“乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase)”、“乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase)”、“α-乙酰羥基酸合成酶(alpha-acetohydroxyacidsynthetase)”、“α-乙酰羥基酸合成酶(alpha-acetohydroxyacidsynthase)”、“α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactatesynthase)”、“α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactatesynthetase)”、“乙酰羥基酸合成酶(acetohydroxyacidsynthase)”、“乙酰羥基酸合成酶(acetohydroxyacidsynthase)”、“乙酰乳酸丙酮酸裂解酶(羧化)”、“乙酰乳酸合成酶(acetolacticsynthetase)”(ec2.2.1.6)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括將化合物丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是乙酰乳酸合成酶的類似物?？梢源呋徂D(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸的酶的實(shí)例描述于表3中。表3中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表3.可用于將丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸的乙酰乳酸合成酶的實(shí)例

術(shù)語“酮酸還原異構(gòu)酶(ketoacidreductoisomerase)”、“酮酸還原異構(gòu)酶(ketolacidreductoisomerase)”、“二羥基異戊酸脫氫酶(異構(gòu)化)”、“乙酰羥基酸異構(gòu)還原酶”、“α-酮基-β-羥基?；€原異構(gòu)酶”、“2-羥基-3-酮酸還原異構(gòu)酶”、“乙酰羥基酸還原異構(gòu)酶”、“乙酰乳酸還原異構(gòu)酶”和“二羥基異戊酸(異構(gòu)化)脫氫酶”(ec1.1.1.86)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是酮酸還原異構(gòu)酶的類似物。可以催化2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸的酶的實(shí)例描述于表4中。表4中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表4.可用于將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸的酮酸還原異構(gòu)酶的實(shí)例

術(shù)語“二羥基酸脫水酶(dihydroxyaciddehydratase)”、“二羥基酸脫水酶(dihydroxy-aciddehydratase)”、“乙酰羥基酸脫水酶”、“α,β-二羥基酸脫水酶”、“dhad”、“2,3-二羥基異戊酸脫水酶”、“α,β-二羥基異戊酸脫水酶”和“2,3-二羥基酸水解酶(hydro-lyase)”(ec4.2.1.9)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括將2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化將2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是二羥基酸脫水酶的類似物。可以催化2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸的酶的實(shí)例描述于表5中。表5中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表5.可用于將2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸的二羥基酸脫水酶的實(shí)例

術(shù)語“酮酸脫羧酶”、“支鏈2-氧代酸脫羧酶”、“支鏈氧代酸脫羧酶”、“支鏈α-酮酸脫羧酶”、“支鏈酮酸脫羧酶”(ec4.1.1.72)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是酮酸脫羧酶的類似物?？梢源呋愇焖徂D(zhuǎn)化為異丁醛的酶的實(shí)例描述于表6中。表6中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表6.可用于將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛的酮酸脫羧酶的實(shí)例

術(shù)語“醇脫氫酶”、“醛還原酶”、“adh”、“醇脫氫酶(nad)”、“脂族醇脫氫酶”、“nad-依賴性醇脫氫酶”、“nadh-醇脫氫酶”和“nadh-醛脫氫酶”(ec1.1.1.1)是指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括使用nadh將化合物異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是醇脫氫酶的類似物?？梢源呋惗∪┺D(zhuǎn)化為異丁醇的酶的實(shí)例描述于表7中。表7中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表7.可用于使用nadh將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的醇脫氫酶的實(shí)例

術(shù)語“醇脫氫酶”、“醇脫氫酶(nadp⁺)”、“醛還原酶(nadph)”、“nadp-醇脫氫酶”、“nadp⁺-醛還原酶”、“nadp⁺-依賴性醛還原酶”、“nadph-醛還原酶”、“nadph-依賴性醛還原酶”和“醇脫氫酶(nadp)”(ec1.1.1.2)也指具有催化活性的多肽，其中催化活性包括使用nadh將化合物異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇。然而，可能存在不被分類在這組酶中的催化將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的其它酶。這樣的酶將被認(rèn)為是醇脫氫酶的類似物?？梢允褂胣adh催化異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的酶的實(shí)例描述于表8中。表8中描述的酶僅用于參考，因?yàn)榇嬖谠S多數(shù)據(jù)庫，在這些數(shù)據(jù)庫中可以發(fā)現(xiàn)這些酶的更多實(shí)例，例如genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)、braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)等。

表8.可用于使用nadph將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇的醇脫氫酶的實(shí)例

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種方法，在該方法中多酶體系順次地從乳酸產(chǎn)生異丁醇，并且在該方法中將異丁醇的產(chǎn)生與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系相關(guān)聯(lián)(圖1)。這種轉(zhuǎn)化可以在容器或反應(yīng)器中進(jìn)行，在此整個(gè)過程可以連續(xù)、半連續(xù)或以間歇方式進(jìn)行。

此外，優(yōu)選地，本發(fā)明通過提供將乳酸順次地轉(zhuǎn)化為異丁醇的多肽來克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率小于或等于理論產(chǎn)率。

此外，本發(fā)明可能不需要由nad⁺和/或nadp⁺和nadh和/或nadph的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量來執(zhí)行上述方法；因?yàn)楸景l(fā)明的方法可以在將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和將乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸以及將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇期間允許nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph的再生。

類似地，本發(fā)明的方法可以采用使nad⁺、nadp⁺、nadh和/或nadph體系再循環(huán)的單元操作，使得可能需要比通過化學(xué)計(jì)量確定的化合物更少量的那些化合物來將更高的量的乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇。

本發(fā)明可以使用以下酶：l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.1)及其類似物將l-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇，其中加入到體系中的nad⁺的量可以小于由l-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量。在l-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇中獲得的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率可以小于或等于理論產(chǎn)率(每克l-乳酸0.411克異丁醇)。

在另一方面，本發(fā)明可以使用以下酶：d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.1)及其類似物將d-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇，其中加入到體系中的nad⁺的量可以小于由d-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量。在d-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇中獲得的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率可以小于或等于理論產(chǎn)率(每克d-乳酸0.411克異丁醇)。

在另一方面，本發(fā)明可以使用以下酶：l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和/或其類似物以將l-乳酸和d-乳酸的混合物轉(zhuǎn)化為異丁醇，其中加入到體系中的nad⁺的量可以小于由l-乳酸和d-乳酸的混合溶液轉(zhuǎn)化為異丁醇的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量。在l-乳酸和d-乳酸的混合物轉(zhuǎn)化為異丁醇中獲得的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率可以小于或等于理論產(chǎn)率(每克l-乳酸和d-乳酸的混合物0.411克異丁醇)。

此外，本發(fā)明可以使用以下酶：l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其類似物將l-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇，其中加入到體系中的nadp⁺的量可以小于由l-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量。在l-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇中獲得的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率可以小于或等于理論產(chǎn)率(每克l-乳酸0.411克異丁醇)。

類似地，本發(fā)明可以使用以下酶：d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其類似物將d-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇，其中加入到體系中的nadp⁺的量可以小于通過由d-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量。在d-乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇中獲得的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率可以小于或等于理論產(chǎn)率(每克d-乳酸0.411克異丁醇)。

另一方面，本發(fā)明可以使用以下酶：l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其類似物以將l-乳酸和d-乳酸的混合物轉(zhuǎn)化為異丁醇，其中加入到體系中的nadp⁺的量可以小于通過由l-乳酸和d-乳酸的混合物轉(zhuǎn)化為異丁醇的化學(xué)計(jì)量反應(yīng)確定的量。在l-乳酸和d-乳酸的混合物轉(zhuǎn)化為異丁醇中獲得的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)率可以小于或等于理論產(chǎn)率(每克l-乳酸和d-乳酸的混合物0.411克異丁醇)。

本發(fā)明的其它方面涉及順次地進(jìn)行一系列反應(yīng)從乳酸生產(chǎn)異丁醇的酶的混合物。繼而，用于將乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的優(yōu)選的酶混合物如下：

a)當(dāng)起始底物是l-乳酸并且氧化還原反應(yīng)使用nad⁺/nadh以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和/或其任何類似物；

b)當(dāng)起始底物是d-乳酸并且氧化還原反應(yīng)使用nad⁺/nadh以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和/或其任何類似物；

c)當(dāng)起始底物是l-乳酸和d-乳酸的混合物并且氧化還原反應(yīng)使用nad⁺/nadh以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和/或其任何類似物；

d)當(dāng)起始底物是l-乳酸并且氧化還原反應(yīng)使用nadp⁺/nadph以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其任何類似物；

e)當(dāng)起始底物是d-乳酸并且氧化還原反應(yīng)使用nadp⁺/nadph以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其任何類似物；

f)當(dāng)起始底物是l-乳酸和d-乳酸的混合物并且氧化還原反應(yīng)使用nadp⁺/nadph以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)和醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其任何類似物；

g)當(dāng)起始底物是l-乳酸并且氧化還原反應(yīng)使用nad⁺/nadh和nadp⁺/nadph的混合物以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其任何類似物；

h)當(dāng)起始底物是d-乳酸并且氧化還原反應(yīng)使用nad⁺/nadh和nadp⁺/nadph以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其任何類似物；和

i)當(dāng)起始底物是l-乳酸和d-乳酸的混合物并且氧化還原反應(yīng)使用nad⁺/nadh和nadp⁺/nadph以獲得作為最終產(chǎn)物的異丁醇時(shí)，酶混合物可包括l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)、d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)、乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)、酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)、二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)、酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)、醇脫氫酶(ec1.1.1.1)和醇脫氫酶(ec1.1.1.2)和/或其任何類似物。

在本發(fā)明的另一方面中，提供了與nad(p)⁺/nad(p)h再生體系相關(guān)聯(lián)的使用游離酶由乳酸生產(chǎn)異丁醇的方法，其中操作模式優(yōu)選以連續(xù)方式進(jìn)行。酶的混合物可以是上述那些中的任何一種。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，所述方法可以包括以下描述的幾個(gè)階段：

i.在混合罐中，水、乳酸、酶的混合物、nad(p)⁺/nad(p)h、被酶用于進(jìn)行催化的輔因子和輔酶混合在一起。被每種酶用于進(jìn)行催化的所述輔助因子和輔酶可能與每種酶的性質(zhì)有關(guān)。表9顯示了優(yōu)選用在本發(fā)明中的一些輔因子和不同的酶。表9中所示的輔因子和輔酶僅用于示例性的目的，并且不排除本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)的其它輔因子或輔酶。

上述成分可以在管、反應(yīng)器或適合混合成分的任何其它容器中混合。

可以通過任何促進(jìn)酶和底物之間的相互作用的適當(dāng)方法將成分混合。此外，混合可以機(jī)械地、氣動(dòng)地或液力地進(jìn)行。可以使用單一的混合方法，或者可以組合兩種或更多種不同的混合方法來混合成分。

ii.使在i中制備的混合物進(jìn)行催化反應(yīng)。混合罐的流出物流連續(xù)地通過反應(yīng)器，使得反應(yīng)條件包括催化反應(yīng)條件保持穩(wěn)定，ph在2和12之間、4和10之間、優(yōu)選6和8之間，溫度在5℃和50℃之間，優(yōu)選在15℃至40℃之間，更優(yōu)選在25℃至37℃之間。當(dāng)流出物流進(jìn)入反應(yīng)器時(shí)，可以由乳酸生產(chǎn)異丁醇，轉(zhuǎn)化效率等于或小于100％。優(yōu)選地，催化反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間足夠長以將乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇。

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，在這樣的過程期間，乳酸可以催化轉(zhuǎn)化為異丁醇。乳酸的催化轉(zhuǎn)化可以在適于進(jìn)行該催化轉(zhuǎn)化的容器中進(jìn)行。例如，可以單獨(dú)或組合地使用攪拌罐反應(yīng)器、活塞流反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器或填充床反應(yīng)器。

iii.異丁醇從ii中得到的反應(yīng)物中分離?？梢愿缓惗〈疾⑶邑毴樗岬姆磻?yīng)器出口物流通過分離體系，其中輔因子、輔酶和酶可以與異丁醇和水中分離。酶、輔酶和輔因子可以形成濃縮物流，濃縮物流可以再循環(huán)到i中的混合罐或ii中的反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^適合于基于例如其物理化學(xué)性質(zhì)分離分子的任何方法進(jìn)行分離。

iv.另一方面，水-異丁醇混合物可以被另一體系分離。可以使用適合于分離分子的任何分離方法。分離可以基于分子的大小進(jìn)行。分離體系可以是：膜體系(反滲透、滲透蒸發(fā)、納濾、超濾等)、蒸餾、蒸發(fā)或允許通過尺寸或其任何物理化學(xué)性質(zhì)分離分子的任何其它體系。

當(dāng)分離異丁醇時(shí)，通過催化轉(zhuǎn)化獲得的反應(yīng)物可以分離成包含異丁醇和水的物流，以及包含非異丁醇和水的成分的物流。包含異丁醇和水的物流可進(jìn)一步分離成包含異丁醇的物流和包含水的物流。包含非異丁醇和水的成分的物流可以通過混合到混合罐或反應(yīng)器中進(jìn)行再循環(huán)。

表9.構(gòu)成酶混合物的被酶使用的輔因子和輔酶

在本發(fā)明的一個(gè)不同的方面，提供了由乳酸生產(chǎn)異丁醇的方法，其中將異丙醇的生產(chǎn)與nad(p)⁺/nad(p)h的再生體系相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，操作模式以連續(xù)方式，并使用固定化的酶的混合物。固定化的酶的混合物可以包括上述那些中的任何一種?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域通常已知的不同方法進(jìn)行固定。表10示出了可用于固定化酶的一些載體。表10中列出的載體僅出于示例目的，并不排除本領(lǐng)域技術(shù)人員找到的任何其他載體(即使未在表10中提到)。

表10.用于固定化的酶的載體

所述方法可以包括如下所述的幾個(gè)階段：

i.在罐中，將酶固定在載體中/載體上。一種或多種酶可以固定在相同或不同的載體中/載體上。此外，載體可以是具有不同數(shù)量的酶的相同類型的，或者載體可以是不同類型的，具有不同的大小，或具有不同的化學(xué)組成。每種載體可以包含一種或多種酶。輔酶和輔因子可能或可能不存在于載體中/載體上。一旦酶被固定，將這些酶加入反應(yīng)器中。

ii.在單獨(dú)的混合罐中，混合水、乳酸和nad(p)⁺/nad(p)h。每種酶可以使用輔因子和輔酶以進(jìn)行催化，取決于酶的性質(zhì)。表9顯示了在本發(fā)明中優(yōu)選與各種酶一起使用的一些輔酶和輔因子。表9中描述的輔因子和輔酶僅用于示例性目的，并且不排除本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)的其它輔因子和輔酶。

上述成分可以在管、反應(yīng)器或適于混合成分的任何其它容器中混合。

可以通過任何促進(jìn)酶和底物之間的相互作用的適當(dāng)方法將成分混合。此外，混合可以機(jī)械地、氣動(dòng)地或液力地進(jìn)行?？梢允褂脝我坏幕旌戏椒?，或者可以組合兩種或更多種不同的混合方法來混合成分。

iii.離開階段ii的物流連續(xù)地流過包含固定化的酶的反應(yīng)器。反應(yīng)器保持穩(wěn)定的反應(yīng)條件，ph值在2和12之間、4和10之間、優(yōu)選在6和8之間，溫度在5℃和50℃之間、優(yōu)選在15℃和40℃之間、更優(yōu)選在25℃和37℃之間。當(dāng)物流進(jìn)入反應(yīng)器時(shí)，異丁醇可以由乳酸產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化效率等于或小于100％。優(yōu)選地，載體應(yīng)保持在反應(yīng)器內(nèi)。然而，載體可以從反應(yīng)器中除去并且可以再循環(huán)用于進(jìn)一步的使用。

iv.來自階段iii的富含異丁醇且貧乳酸的輸出物可以通過分離體系，其中輔酶和輔因子與異丁醇和水分離。輔酶和輔因子可能會(huì)導(dǎo)致濃縮的物流，可以將該物流再循環(huán)到混合罐或酶反應(yīng)器。

v.離開iv中描述的分離體系的異丁醇-水混合物可以用其它分離體系分離。該體系可以產(chǎn)生兩個(gè)物流，一方面是異丁醇流，另一方面是水流。

iv和v中提到的分離體系可以包括：膜體系(反滲透、滲透蒸發(fā)、納濾、超濾等)、蒸餾、蒸發(fā)或允許通過尺寸或通過其任一物理化學(xué)性質(zhì)分離的任何其它體系。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過上述方法制備的生物燃料或生物燃料前體。生物燃料或生物燃料前體優(yōu)選滿足astmd7862的要求。

本發(fā)明的另一方面涉及通過共混烴的混合物和上述生物燃料前體制備的汽車燃料。

實(shí)施例

以下實(shí)施例旨在闡明本發(fā)明的新穎性。應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。根據(jù)本發(fā)明的描述和以下實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行一些修改，這些修改認(rèn)為在權(quán)利要求中描述的本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。

實(shí)施例1.酶活性的定量

為了確定各種酶的酶活性，通過遵循greenandsambrook,2010中所述的方案，將不同的酶基因克隆到市售表達(dá)載體如duet(merck，usa)系列中。隨后，根據(jù)greenandsambrook,2010中描述的方案將酶純化。被測酶的列表顯示在表11中。

表11.用于說明本發(fā)明的酶

酶測定和結(jié)果如下所述：

a)l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)：

使用nad⁺和/或nadp⁺，l-乳酸脫氫酶將l-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，因此遵循在文獻(xiàn)(cetinel等，2013)中所述的方案通過改變l-乳酸、nad⁺和/或nadp⁺的初始濃度、ph和溫度來進(jìn)行測定。以來自不同微生物的三種酶為例。通過使用rezex-roa有機(jī)酸h⁺柱用帶折光指數(shù)檢測器的hplc監(jiān)測l-乳酸消耗動(dòng)力學(xué)。使用具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)在波長340nm下監(jiān)測nadh和/或nadph的產(chǎn)生。測試條件如表12中所示。

表12.測定l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)的反應(yīng)條件

在所有測定中，均觀察到l-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸以及nadh和/或nadph的產(chǎn)生。表13中顯示的結(jié)果表示在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表13.通過l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)將l-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸

b)d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)

使用nad⁺和/或nadp⁺，d-乳酸脫氫酶將d-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，因此通過遵循在文獻(xiàn)(kim等人，2014)中所述的方案改變d-乳酸、nad⁺和/或nadp⁺的初始濃度、ph和溫度來進(jìn)行測定。以來自不同微生物的三種酶為例。通過使用rezex-roa有機(jī)酸h⁺柱用帶折光指數(shù)檢測器的hplc監(jiān)測d-乳酸消耗動(dòng)力學(xué)。使用具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)在波長340nm下監(jiān)測nadh和/或nadph的產(chǎn)生。測試條件如表14中所示。

表14.測定d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)的反應(yīng)條件

在所有進(jìn)行的測定中，觀察到d-乳酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化以及nadh和/或nadph的產(chǎn)生。表15顯示的結(jié)果表示在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表15.通過d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)將d-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸

c)乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)

乙酰乳酸合成酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸，因此通過遵循在文獻(xiàn)(holtzclaw和chapman，1975；barak等人，1987；atsumi等人，2009)中所述的方案改變丙酮酸的初始濃度、ph和溫度來進(jìn)行測定。以來自不同微生物的三種酶為例。通過使用acclaim有機(jī)酸柱用帶uv檢測器的uhplc在210nm的波長下監(jiān)測丙酮酸消耗動(dòng)力學(xué)，還使用波長320nm的具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)。測試條件如表16中所示。

表16.測定乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)的反應(yīng)條件

表17顯示了在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率的結(jié)果，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表17.通過乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰乳酸

d)酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)和二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)

一方面，酮酸還原異構(gòu)酶將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸，而二羥基酸脫水酶將2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸。由于2-乙酰乳酸的非商業(yè)可得性和2,3-二羥基戊酸的不穩(wěn)定性，這兩種酶的活性通過其中將乙酰乳酸合成酶與酮酸還原異構(gòu)酶和二羥基酸脫水酶聯(lián)用的測定來間接測定。這通過使用文獻(xiàn)(flint等人,1993;bastian等人,2011;li等人,2011)中描述的方案改變丙酮酸、nadh和/或nadph的初始濃度，例如ph和溫度來完成。使用來自不同微生物的兩種還原異構(gòu)酶和兩種二羥基酮酸脫水酶的組合作為實(shí)例。使用acclaim有機(jī)酸柱用帶有uv檢測器的uhplc在波長210nm下監(jiān)測丙酮酸消耗動(dòng)力學(xué)和酮異戊酸產(chǎn)生(二羥基脫水酶活性)；使用具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)在波長340nm下監(jiān)測nadh和/或nadph消耗(酮酸還原異構(gòu)酶的底物)。測定條件示于表18。

表18.測定酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)和二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)的反應(yīng)條件

表19顯示了在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率的結(jié)果，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表19.通過酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)和二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸

e)酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)

酮酸脫羧酶將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛，因此通過遵循文獻(xiàn)(plaza等人，2004)中描述的方案改變酮異戊酸的初始濃度、ph和溫度來進(jìn)行測定。以來自不同微生物的三種酶為例。使用acclaim有機(jī)酸柱用帶有紫外檢測器的uhplc在波長210nm下監(jiān)測酮異戊酸消耗動(dòng)力學(xué)，并使用波長318nm的具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)。測定條件示于表20中。

表20.測定酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)的反應(yīng)條件

表21顯示了在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率的結(jié)果，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表21.通過酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)將酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛

f)醇脫氫酶(ec1.1.1.1)

使用nadh，該醇脫氫酶將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇，因此通過遵循文獻(xiàn)(atsumi等人，2010)中描述的方案改變異丁醛和nadh的初始濃度、ph和溫度來進(jìn)行測定。以來自不同微生物的三種酶為例。使用rezex-roa有機(jī)酸h⁺柱用帶有折光指數(shù)檢測器的hplc監(jiān)測異丁醇產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)，使用具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)在340nm波長下監(jiān)測nadh的消耗。測定條件示于表22。

表22.測定醇脫氫酶(ec1.1.1.1)的反應(yīng)條件

在所有進(jìn)行的測定中，觀察到異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇以及nadhd消耗。表23所示的結(jié)果表示在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表23.通過醇脫氫酶(ec1.1.1.1)將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇

g)醇脫氫酶(ec1.1.1.2)

使用nadph，醇脫氫酶將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇，因此通過遵循文獻(xiàn)(atsumi等人，2010)中描述的方案改變異丁醛和nadph的初始濃度、ph和溫度進(jìn)行測定。以來自不同微生物的三種酶為例。使用rezex-roa有機(jī)酸h⁺柱用帶有折光指數(shù)檢測器的hplc監(jiān)測異丁醇產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)，使用具有溫度控制的cary-60分光光度計(jì)在340nm波長下監(jiān)測nadh的消耗。測試條件如表24所示。

表24.測定醇脫氫酶(ec1.1.1.2)的反應(yīng)條件

在所有進(jìn)行的測定中，觀察到異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇以及nadhd消耗。表25所示的結(jié)果表示在1小時(shí)反應(yīng)時(shí)間之后獲得的轉(zhuǎn)化效率，考慮了不同的國際數(shù)據(jù)庫(例如kyotoencyclopediaofgenesandgenomes(http://www.kegg.jp)和braunschweigenzymedatabase(http://www.brenda-enzymes.org)報(bào)道的反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

表25.通過醇脫氫酶(ec1.1.1.1)將異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇

實(shí)施例2.在一個(gè)間歇過程中結(jié)合nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系由乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇

本實(shí)施例旨在說明nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生概念：

a)nad⁺/nadh，根據(jù)以下反應(yīng)通過結(jié)合催化nadh產(chǎn)生的一種酶和催化nad⁺產(chǎn)生的兩種酶：

-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。在該反應(yīng)中，從兩個(gè)nad⁺分子獲得兩個(gè)nadh分子，以及將兩個(gè)乳酸分子轉(zhuǎn)化為兩個(gè)丙酮酸分子。該反應(yīng)可以通過l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)和/或通過d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)進(jìn)行：

-丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸。在該反應(yīng)中，從兩個(gè)丙酮酸分子獲得一個(gè)2-乙酰乳酸分子。該反應(yīng)可以通過乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)進(jìn)行：

-2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸。在該反應(yīng)中，從一個(gè)2-乙酰乳酸分子獲得一個(gè)2,3-二羥基戊酸分子，以及從一個(gè)nadh分子形成一個(gè)nad⁺分子。該反應(yīng)可以通過酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)催化。天然酶對(duì)nadh具有非常低的親和力。然而，可能存在可在文獻(xiàn)(rane等，1997)中已知的使用nadh作為底物的突變體。那些突變體可以進(jìn)行以下反應(yīng)：

-2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸。在該反應(yīng)中，從一個(gè)2,3-二羥基戊酸分子獲得一個(gè)酮異戊酸分子。該反應(yīng)可以通過二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)催化：

-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛。在該反應(yīng)中，從一個(gè)酮異戊酸分子獲得一個(gè)異丁醛分子。該反應(yīng)可以通過酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)催化：

-異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇。在該反應(yīng)中，從一個(gè)異丁醛分子獲得一個(gè)異丁醇分子，以及從一個(gè)nadh分子形成一個(gè)nad⁺分子。該反應(yīng)可以通過醇脫氫酶(ec1.1.1.1)催化：

從上述化學(xué)方程式，多酶體系的總化學(xué)計(jì)量在理論上沒有nad⁺或nadh的損失或增加。根據(jù)以下反應(yīng)，總反應(yīng)導(dǎo)致使用兩個(gè)乳酸分子來產(chǎn)生一個(gè)異丁醇分子，獲得100％的轉(zhuǎn)化效率：

b)nadp⁺/nadph，根據(jù)以下反應(yīng)通過結(jié)合產(chǎn)生nadph的一種酶和產(chǎn)生nadp⁺的兩種酶：

-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。在該反應(yīng)中，從兩個(gè)nadp⁺分子獲得兩個(gè)nadph分子，并將兩個(gè)乳酸分子轉(zhuǎn)化為兩個(gè)丙酮酸分子。該反應(yīng)可以通過l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)和/或d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)催化：

-丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸。在該反應(yīng)中，從兩個(gè)丙酮酸分子獲得一個(gè)2-乙酰乳酸分子。該反應(yīng)可以通過乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)催化：

-2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸。在該反應(yīng)中，從2-乙酰乳酸分子得到2,3-二羥基戊酸分子，以及從一個(gè)nadph分子形成一個(gè)nadp⁺分子。該反應(yīng)可以通過酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)催化：

-2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸。在該反應(yīng)中，從2,3-二羥基戊酸分子獲得酮異戊酸分子。該反應(yīng)可以通過二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)催化：

-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛。在該反應(yīng)中，從酮異戊酸分子獲得異丁醛分子。該反應(yīng)可以通過酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)催化：

-異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇。在該反應(yīng)中，從異丁醛分子獲得異丁醇分子，以及從一個(gè)nadph分子產(chǎn)生一個(gè)nadp⁺分子。該反應(yīng)可以通過醇脫氫酶(ec1.1.1.2)催化：

從上述化學(xué)方程式，多酶體系的總化學(xué)計(jì)量在理論上沒有nadp⁺或nadph的損失或增加。根據(jù)以下反應(yīng)，總反應(yīng)導(dǎo)致使用兩個(gè)乳酸分子來產(chǎn)生一個(gè)異丁醇分子，獲得100％的轉(zhuǎn)化效率：

c)nad(p)⁺/nad(p)h的混合物，根據(jù)以下反應(yīng)通過結(jié)合產(chǎn)生nad(p)h的酶和產(chǎn)生nad(p)⁺的酶：

-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸。在該反應(yīng)中，從兩個(gè)nad(p)⁺分子獲得兩個(gè)nad(p)h分子，以及將兩個(gè)乳酸分子轉(zhuǎn)化為兩個(gè)丙酮酸分子。該反應(yīng)可以通過l-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.27)和/或d-乳酸脫氫酶(ec1.1.1.28)催化：

-丙酮酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰乳酸。在該反應(yīng)中，從兩個(gè)丙酮酸分子獲得一個(gè)2-乙酰乳酸分子。該反應(yīng)可以通過乙酰乳酸合成酶(ec2.2.1.6)催化：

-2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基戊酸。在該反應(yīng)中，一個(gè)2,3-二羥基戊酸分子從一個(gè)2-乙酰乳酸分子形成，以及從一個(gè)nad(p)h分子產(chǎn)生一個(gè)nad(p)⁺分子。該反應(yīng)可以通過酮酸還原異構(gòu)酶(ec1.1.1.86)催化：

-2,3-二羥基戊酸轉(zhuǎn)化為酮異戊酸。在該反應(yīng)中，從2,3-二羥基戊酸分子獲得酮異戊酸分子。該反應(yīng)可以通過二羥基酸脫水酶(ec4.2.1.9)催化：

-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醛。在該反應(yīng)中，從一個(gè)酮異戊酸分子獲得一個(gè)異丁醛分子。該反應(yīng)可以通過酮酸脫羧酶(ec4.1.1.72)催化：

-異丁醛轉(zhuǎn)化為異丁醇。在該反應(yīng)中，從一個(gè)異丁醛分子獲得一個(gè)異丁醇分子，以及從一個(gè)nad(p)h分子產(chǎn)生一個(gè)nad(p)⁺分子。該反應(yīng)可以通過醇脫氫酶(ec1.1.1.1和ec1.1.1.2)催化：

從上述化學(xué)方程式，多酶體系的總化學(xué)計(jì)量在理論上沒有nad(p)⁺或nad(p)h的損失或增加。根據(jù)以下反應(yīng)，總反應(yīng)導(dǎo)致使用兩個(gè)乳酸分子來產(chǎn)生一個(gè)異丁醇分子，獲得100％的轉(zhuǎn)化效率：

開發(fā)了間歇體系，以將nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系與由乳酸生產(chǎn)異丁醇相關(guān)聯(lián)，以在不同的操作條件下使用(表26)。反應(yīng)混合物用酶(表27)、輔因子和輔酶(以現(xiàn)有技術(shù)中描述的濃度)、乳酸和nad⁺和/或nadp⁺配制。在圖2中，示出了在間歇過程中進(jìn)行的條件之一的結(jié)果。在該特定條件下，使用1l體積的物料，l-乳酸的初始濃度為20g/l，nad⁺的初始濃度為0.1g/l。將反應(yīng)混合物中每種酶(ec1.1.1.27、ec2.2.1.6、ec1.1.1.86、ec4.2.1.9、ec4.1.1.72和ec1.1.1.1)的濃度調(diào)節(jié)至1g/l。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，如表26和27所示對(duì)于不同條件獲得了類似的行為。

在所有情況下，通過加入乳酸引發(fā)反應(yīng)。從反應(yīng)開始，對(duì)反應(yīng)混合物連續(xù)取樣以確定反應(yīng)進(jìn)程。在cary-60分光光度計(jì)上在340nm的波長下測量nadh和/或nadph濃度。使用rezexroa-有機(jī)酸h⁺柱用帶有折光指數(shù)檢測器的hplc監(jiān)測乳酸和異丁醇。

表26.從乳酸間歇生產(chǎn)異丁醇的反應(yīng)條件

表27.用于配制酶混合物以由乳酸生產(chǎn)異丁醇的酶

在沒有nadh再生的體系中，理論化學(xué)計(jì)量平衡表明，需要147.8gnadh將19.55g丙酮酸(相當(dāng)于20g乳酸)轉(zhuǎn)化為8.22g異丁醇。然而，通過結(jié)合nad⁺/nadh再生體系，如本發(fā)明所提出的，并且與通過l-乳酸脫氫酶作用的乳酸氧化相關(guān)聯(lián)，僅需要0.1gnad⁺將20g乳酸轉(zhuǎn)化為8.22g異丁醇。

當(dāng)用0.1g/l的nadp⁺進(jìn)行該過程時(shí)以及當(dāng)以0.1g/l的濃度使用nad⁺和nadp⁺的混合物時(shí)，獲得與前面段落中描述的相似結(jié)果。

前面提到的評(píng)述證明，在與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系結(jié)合的間歇過程中由乳酸生產(chǎn)異丁醇是可能的。

實(shí)施例3.在連續(xù)過程中結(jié)合nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系從乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇

為了證明通過使用游離酶在連續(xù)過程中將從乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系結(jié)合的可能性，進(jìn)行以下程序：

在反應(yīng)器中使用游離酶將乳酸連續(xù)地轉(zhuǎn)化為異丁醇。使用酶混合物(表27)、輔因子和輔酶(以本領(lǐng)域通常使用的濃度)、乳酸和nad⁺和/或nadp⁺配制反應(yīng)混合物。反應(yīng)器的操作條件示于表28中。反應(yīng)器的入口流和出口流是相同的，以便執(zhí)行連續(xù)方法。

圖3顯示了在cstr中進(jìn)行的數(shù)個(gè)條件下獲得的一些結(jié)果，該條件對(duì)應(yīng)于d-乳酸的初始濃度為20g/l和nadp⁺的初始濃度為0.1g/l。將反應(yīng)混合物中每種酶(ec1.1.1.28、ec2.2.1.6、ec1.1.1.86、ec4.2.1.9、ec4.1.1.72和ec1.1.1.2)的濃度調(diào)節(jié)至1g/l。對(duì)于所有這些條件，通過改變流動(dòng)條件使用50l的操作體積。

表28.由乳酸生產(chǎn)異丁醇的反應(yīng)器操作條件

以與間歇過程相同的方式引發(fā)反應(yīng)(參見實(shí)施例2)；隨后，反應(yīng)介質(zhì)的添加和除去以連續(xù)方式進(jìn)行。

將來自反應(yīng)器的輸出物流連接到反滲透體系，該反滲透體系將酶、輔因子和輔酶與異丁醇分離。將酶、輔因子和輔酶流再循環(huán)到反應(yīng)器中。

對(duì)于表27和28中列出的所有條件，監(jiān)測反應(yīng)器出口流中的反應(yīng)中間體的演變。在cary-60分光光度計(jì)上在340nm波長下測量nadh和/或nadph的演變。乳酸和異丁醇使用rezex-roa有機(jī)酸h⁺柱用帶有折光指數(shù)檢測器的hplc測量。

從圖3看出，轉(zhuǎn)換效率相對(duì)于流動(dòng)條件沒有波動(dòng)，并且接近100％。以與實(shí)施例2相同的方式。這樣的結(jié)果證明了將從乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系結(jié)合的可能性，在連續(xù)過程中僅使用0.1g/lnadp⁺來轉(zhuǎn)化20g/l乳酸。

應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，如表27和28所示，對(duì)于其他條件獲得了非常相似的轉(zhuǎn)化效率。

實(shí)施例4.使用固定化的酶在連續(xù)過程中結(jié)合nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系從乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇

為了證明在使用固定化的酶的連續(xù)過程中將從乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系結(jié)合的可能性，進(jìn)行以下操作：

在其中每種酶或酶混合物(表27)固定在不同載體中/載體上(表10)的反應(yīng)器中從乳酸連續(xù)生產(chǎn)異丁醇，固定化的蛋白的量變化。操作條件示于表29中。使用固定化的酶混合物(表27)、輔因子和輔酶(以本領(lǐng)域通常使用的濃度)、乳酸和nad⁺和/或nadp⁺配制反應(yīng)混合物。

表29.使用固定化的酶將乳酸轉(zhuǎn)化為異丁醇的連續(xù)反應(yīng)器的操作條件

將反應(yīng)器的輸出物流連接到反滲透體系，反滲透體系將輔因子和輔酶的混合物再循環(huán)到反應(yīng)器和/或混合罐。nad⁺和/或nadp⁺的初始濃度為0.1g/l，而反應(yīng)器入口處的乳酸濃度根據(jù)表29而變化。在表27和29中提及的所有條件下，沿著管式反應(yīng)器監(jiān)測反應(yīng)中間體的演變。在cary-60分光光度計(jì)上在340nm的波長下測量nadh和/或nadph的變化。使用rezex-roa有機(jī)酸h⁺柱用具有折光指數(shù)檢測器的hplc測量乳酸和異丁醇濃度。

圖4顯示了使用裝填在管式反應(yīng)器中的固定化的酶在不同條件下進(jìn)行連續(xù)過程的性能的一些結(jié)果。對(duì)于所有這些操作條件，使用50l的操作體積，具有不同的進(jìn)料流動(dòng)條件，l-乳酸的輸入濃度為264g/l和nad⁺的輸入濃度為0.1g/l。將每種酶(ec1.1.1.27、ec2.2.1.6、ec1.1.1.86、ec4.2.1.9、ec4.1.1.72和ec1.1.1.1)的量調(diào)節(jié)至0.01克/克載體。

對(duì)于該特定情況，當(dāng)輔因子、輔酶、l-乳酸和nad⁺的混合物進(jìn)入填充反應(yīng)器時(shí)，反應(yīng)開始。

如圖4所示，l-乳酸酯轉(zhuǎn)化為異丁醇，同時(shí)使混合物移位通過填充管反應(yīng)器以達(dá)到100％的轉(zhuǎn)化效率。在表27和29中列出的不同操作條件下發(fā)生相同的情況。以與實(shí)施例2和3相同的方式，證明可以將從乳酸酶促生產(chǎn)異丁醇與nad⁺/nadh和/或nadp⁺/nadph再生體系相關(guān)聯(lián)，僅使用0.1g/l的nad⁺將264g/l的乳酸轉(zhuǎn)化為108g/l的異丁醇。

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用于將2摩爾乳酸轉(zhuǎn)化為1摩爾異丁醇的nad⁺和nadh的總量小于1摩爾、小于0.1摩爾或優(yōu)選小于0.01摩爾。

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用于將2摩爾乳酸轉(zhuǎn)化為1摩爾異丁醇的nadp⁺和nadph的總量小于1摩爾、小于0.1摩爾或優(yōu)選小于0.01摩爾。

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用于將2摩爾乳酸轉(zhuǎn)化為1摩爾異丁醇的nadp⁺/nad⁺和nadph/nadh的總量小于1摩爾、小于0.1摩爾或優(yōu)選小于0.01摩爾。

參考文獻(xiàn)

以下參考文獻(xiàn)的內(nèi)容通過整體引用并入本文。

-atsumis,liz,liaojc.(2009).acetolactatesynthasefrombacillussubtilisservesasa2-ketoisovaleratedecarboxylaseforisobutanolbiosynthesisinescherichiacoli(來自枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶用作在大腸桿菌中進(jìn)行異丁醇生物合成的2-酮異戊酸脫羧酶)。applenvironmicrobiol.75(19):6306-6311。

-atsumis,wuty,ecklem,hawkinssd,bueltert,liaojc.(2010)engineeringtheisobutanolbiosyntheticpathwayinescherichiacolibycomparisonofthreealdehydereductase/alcoholdehydrogenasegenes(通過比較三種醛還原酶/醇脫氫酶基因在大腸桿菌中工程化異丁醇生物合成途徑)。applmicrobiolbiotechnol.85(3):651-657。

-barakz,chipmandm,gollopn.(1987).physiologicalimplicationsofthespecificityofacetohydroxyacidsynthaseisozymesofentericbacteria(腸細(xì)菌的乙酰羥基酸合成酶同功型的特異性的生理學(xué)意義)。jbacteriol.169(8):3750-3756。

-bastians,liux,meyerowitzjt,snowcd,chenmm,arnoldfh.(2011).engineeredketol-acidreductoisomeraseandalcoholdehydrogenaseenableanaerobic2-methylpropan-1-olproductionattheoreticalyieldinescherichiacoli.(工程化酮酸還原異構(gòu)酶和醇脫氫酶能夠在大腸桿菌中以理論產(chǎn)率生產(chǎn)厭氧2-甲基丙-1-醇)。metabeng.13(3):345-352。

-berezinaov,zakharovanv,yarotskycv,zverlovvv.(2012).microbialproducersofbutanol(丁醇的微生物生產(chǎn)商)。appl.biochem.microbiol.48(7):625-638。

-cetinels,caliskanhb,yucesoydt,donatanas,yucae,urgenm,karagulerng,tamerlerc.(2013)addressableself-immobilizationoflactatedehydrogenaseacrossmultiplelengthscales(跨多個(gè)長度等級(jí)的乳酸脫氫酶的可尋址的自固定)。biotechnolj.8(2):262-272。

-delaplazam,fernándezdepalenciap,peláezc,requenat.biochemicalandmolecularcharacterizationofalpha-ketoisovaleratedecarboxylase,anenzymeinvolvedintheformationofaldehydesfromaminoacidsbylactococcuslactis(α-酮異戊酸脫羧酶—一種通過lactococcuslactis參與由氨基酸形成醛的酶的生物化學(xué)和分子表征)。(2004).femsmicrobiollett.238(2):367-74。

-dickinsonjr,harrisonsj,hewlinsmj.(1998)aninvestigationofthemetabolismofvalinetoisobutylalcoholinsaccharomycescerevisiae(在saccharomycescerevisiae中將纈氨酸代謝為異丁醇的研究)。j.biol.chem.273(40):25751-25756。

-flintdh,emptagemh,finneganmg,fuw,johnsonmk.(1993).theroleandpropertiesoftheiron-sulfurclusterinescherichiacolidihydroxy-aciddehydratase(鐵硫簇在大腸桿菌二羥基酸脫水酶中的作用和性質(zhì))。jbiolchem.268(20):14732-14742。

-greenmichaelr.,sambrookjoseph.(2012).molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊)，coldspringharborlaboratorypress;第4版。

-holtzclawwd,chapmanlf.(1975).degradativeacetolactatesynthaseofbacillussubtilis:purificationandproperties(枯草芽孢桿菌的降解性乙酰乳酸合成酶：純化和性質(zhì))，jbacteriol.121(3):917-922。

-jonesdt,woodsdr.(1986).acetone-butanolfermentationrevisited(丙酮-丁醇發(fā)酵再述).microbiol.rev.50(4):484-524。

-kims,gusa,kimyh,kimkj.(2014)crystalstructureandthermodynamicpropertiesofd-乳酸dehydrogenasefromlactobacillusjensenii(來自lactobacillusjensenii的d-乳酸脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)和熱動(dòng)力學(xué)性質(zhì))。intjbiolmacromol.68:151-7。

-lis,wenj,jiax.(2011)engineeringbacillussubtilisforisobutanolproductionbyheterologousehrlichpathwayconstructionandthebiosynthetic2-ketoisovalerateprecursorpathwayoverexpression(通過異源ehrlich途徑構(gòu)建體的用于異丁醇生產(chǎn)的工程化枯草芽孢桿菌和生物合成的2-酮異戊酸前體途徑過表達(dá))。applmicrobiolbiotechnol.91(3):577-589。

-liaj,tanasn,geh.(1996).silicasol-gelimmobilizedamperometricbiosensorforhydrogenperoxide(用于過氧化氫的二氧化硅溶膠-凝膠固定的電流生物傳感器)analyticachimicaacta335(1-2):137-145。

-liub,hur,dengj.(1997).characterizationofimmobilizationofanenzymeinamodifiedyzeolitematrixanditsapplicationtoanamperometricglucosebiosensor(酶在修飾的y沸石基質(zhì)中的固定化的表征及其在電流葡萄糖生物傳感器中的應(yīng)用)。analchem.69(13):2343-8。

-ranemj,calvokc.(1997).reversalofthenucleotidespecificityofketolacidreductoisomerasebysite-directedmutagenesisidentifiesthenadphbindingsite(通過定點(diǎn)突變逆轉(zhuǎn)酮酸酸還原異構(gòu)酶的核苷酸特異性，鑒定出nadph結(jié)合位點(diǎn))。archbiochembiophys.338(1):83-89。

-torabisf,khajehk,ghasempurs,ghaemin,siadatso.(2007).covalentattachmentofcholesteroloxidaseandhorseradishperoxidaseonperlitethroughsilanization:activity,stabilityandco-immobilization(膽固醇氧化酶和辣根過氧化物酶通過硅烷化共價(jià)連接珍珠巖：活性，穩(wěn)定性和共同固定化)。jbiotechnol.131(2):111-20。

-wonak,kimas,kimakj,parkhw,moonasj.(2005).optimizationoflipaseentrapmentinca-alginategelbeads(藻酸鈣凝膠珠中脂肪酶捕獲的優(yōu)化)。processbiochem.40:2149-2154。