本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了進(jìn)行靶核酸的高通量多路檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

許多用于檢測(cè)靶核酸的方法是已知的?，F(xiàn)有的用于核酸檢測(cè)的同質(zhì)測(cè)定法包括TaqMan?、Ampliflour?、染料結(jié)合、等位基因選擇性的動(dòng)態(tài)PCR和Scorpion?引物測(cè)定。由于待檢測(cè)的每種靶核酸需要不同的染料，這些測(cè)定操作不容易多路化，并且因此在其改善潛力方面有限。為了克服此類(lèi)局限性，幾項(xiàng)近期研究已公開(kāi)了含有可切割的“標(biāo)簽”部分的寡核苷酸探針的應(yīng)用，所述“標(biāo)簽”部分可以被容易地分離和檢測(cè)(例如參見(jiàn)Chenna等人，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0053939；Van Den Boom，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,133,701)。然而，來(lái)自這些研究的結(jié)果表明，在能夠準(zhǔn)確地使檢測(cè)標(biāo)簽與靶核酸相關(guān)聯(lián)上存在問(wèn)題，并且仍需要進(jìn)行靶核酸的高通量多路檢測(cè)的準(zhǔn)確方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了用于核酸序列檢測(cè)的新型方法。在該方法中，在PCR期間通過(guò)DNA聚合酶的5'-核酸酶活性產(chǎn)生與擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的靶核酸結(jié)合的、來(lái)自寡核苷酸探針的獨(dú)特的鑒定性切割片段。這通過(guò)具有附接至探針的5'末端的非互補(bǔ)“翼(flap)”區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)鑒定獨(dú)特的切割片段，可以確定靶核酸的身份。例如，這可以容易地通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)完成。由于具有獨(dú)特的且可容易分辨的質(zhì)量的可能切割片段的數(shù)目極大，由此使得核酸靶標(biāo)的快速高通量多路檢測(cè)成為可能。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中存在或不存在靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)通過(guò)使包含靶核酸的樣品與以下物質(zhì)接觸來(lái)制備反應(yīng)混合物：(i)一對(duì)各自與親和標(biāo)記物附接的寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含與靶核酸序列的一條鏈中的區(qū)域互補(bǔ)的序列且引發(fā)第一延伸產(chǎn)物的合成，且其中第二寡核苷酸引物包含與所述第一延伸產(chǎn)物中的區(qū)域互補(bǔ)的序列且引發(fā)與所述第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的核酸鏈的合成，和(ii)寡核苷酸探針，其包含至少兩個(gè)不同部分，第一部分包含標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，其具有或不具有核苷酸類(lèi)似物，所述第一部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少部分互補(bǔ)的序列，其中所述第一部分在所述寡核苷酸引物對(duì)所結(jié)合的靶核酸序列內(nèi)退火，且其中所述第一部分還包含親和標(biāo)記物，在3'末端處或附近的外切核酸酶抗性修飾以防止被3'至5'外切核酸酶切割，且在3'末端處被阻斷以阻止通過(guò)核酸聚合酶延伸；且附接至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補(bǔ)的序列，其中所述第二部分還包含外切核酸酶抗性修飾；

(b)在一定條件下在包含核苷酸三磷酸和具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增所述靶核酸序列，所述條件允許所述寡核苷酸引物對(duì)和所述寡核苷酸探針與所述靶核酸序列退火以及從所述寡核苷酸引物對(duì)合成引物延伸產(chǎn)物，而所述核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能夠切割退火的寡核苷酸探針并從其釋放含有所述寡核苷酸探針的第二部分的片段，所述片段具有或不具有來(lái)自所述寡核苷酸探針的第一部分的額外核苷酸；

(c)使所述反應(yīng)混合物經(jīng)受親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識(shí)別并結(jié)合所述寡核苷酸引物對(duì)和所述寡核苷酸探針上的親和標(biāo)記物，由此除去過(guò)量寡核苷酸引物和未切割的寡核苷酸探針；

(d)用3'至5'外切核酸酶處理所述含有所述寡核苷酸探針的第二部分的片段，所述3'至5'外切核酸酶切割所述片段直到外切核酸酶抗性修飾，由此產(chǎn)生具有獨(dú)特的質(zhì)量可區(qū)分的大小的單個(gè)片段；和

(e)通過(guò)質(zhì)譜法檢測(cè)所述單個(gè)片段的存在或不存在，由此檢測(cè)所述樣品中存在或不存在所述靶核酸序列。

在一些實(shí)施方案中，在步驟(d)期間，通過(guò)添加堿性磷酸酶來(lái)除去未并入的核苷酸三磷酸。在一些實(shí)施方案中，步驟(e)之前是純化所述反應(yīng)混合物以除去質(zhì)譜的污染物的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述親和標(biāo)記物包含生物素，且親和基質(zhì)包含鏈霉抗生物素包被的顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述外切核酸酶抗性修飾選自硫代磷酸酯、2'-O-甲基-核糖核苷酸、丙二醇間隔物、HEG間隔物和反向核苷酸。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含寡核苷酸探針的組合物，其中所述寡核苷酸探針包含至少兩個(gè)不同部分，其中第一部分包含標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，其具有或不具有核苷酸類(lèi)似物，所述第一部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少部分互補(bǔ)的序列，其中所述第一部分在所述寡核苷酸引物對(duì)所結(jié)合的靶核酸序列內(nèi)退火，且其中所述第一部分還包含親和標(biāo)記物，在3'末端處或附近的外切核酸酶抗性修飾以防止被3'至5'外切核酸酶切割，且在3'末端處被阻斷以阻止通過(guò)核酸聚合酶延伸；且附接至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補(bǔ)的序列，其中所述第二部分還包含外切核酸酶抗性修飾。

在另一個(gè)方面，所述組合物還包含一對(duì)各自與親和標(biāo)記物附接的寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含與靶核酸序列的一條鏈中的區(qū)域互補(bǔ)的序列且在擴(kuò)增反應(yīng)中引發(fā)第一延伸產(chǎn)物的合成，且其中第二寡核苷酸引物包含與所述第一延伸產(chǎn)物中的區(qū)域互補(bǔ)的序列且在所述擴(kuò)增反應(yīng)中引發(fā)與所述第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的核酸鏈的合成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親和標(biāo)記物包含生物素，且親和基質(zhì)包含鏈霉抗生物素包被的顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述外切核酸酶抗性修飾選自硫代磷酸酯、2'-O-甲基-核糖核苷酸、丙二醇間隔物、HEG間隔物和反向核苷酸。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含寡核苷酸探針的組合物，其中所述寡核苷酸探針包含至少兩個(gè)不同部分，第一部分包含標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，其具有或不具有核苷酸類(lèi)似物，所述第一部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少部分互補(bǔ)的序列，其中所述第一部分在所述寡核苷酸引物對(duì)所結(jié)合的靶核酸序列內(nèi)退火，其中所述第一部分還包含在5'末端處的修飾，所述修飾使其對(duì)單鏈特異性5'-3'-外切核酸酶的切割具有抗性，且附接至所述第一部分的3'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補(bǔ)的序列，其中所述第二部分還包含使其對(duì)單鏈特異性5'-3'外切核酸酶的切割具有抗性的修飾。

在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針的第二部分中的外切核酸酶抗性修飾包含不可切割的核苷酸類(lèi)似物，其選自硫代磷酸酯、2'-O-甲基-核糖核苷酸、丙二醇間隔物、HEG間隔物、反向核苷酸、或使得寡核苷酸片段在修飾附接點(diǎn)外對(duì)于核酸外切切割具有抗性的任何其它修飾。在其它實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針的第二部分包含非核苷酸，其可以是任何有機(jī)部分或重復(fù)單元(例如(CH2-CH2-O)n等)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在樣品中進(jìn)行不止一種靶核酸的高通量多路檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供包含靶核酸的樣品；b)從所述樣品提取總核酸；c)提供不止一對(duì)寡核苷酸引物，其中各引物對(duì)與所述不止一種靶核酸之一互補(bǔ)并且可以引發(fā)從所述不止一種靶核酸之一合成延伸產(chǎn)物，且其中各寡核苷酸引物與親和標(biāo)記物附接；d)提供不止一種寡核苷酸探針，其中各探針包含至少兩個(gè)不同部分，其特征在于：(i)第一部分包含標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，其具有或不具有核苷酸類(lèi)似物，所述第一部分包含與靶核酸序列的區(qū)域至少部分互補(bǔ)的序列，其中所述第一部分在所述寡核苷酸引物對(duì)所結(jié)合的靶核酸序列內(nèi)退火，且其中所述第一部分還包含親和標(biāo)記物，在3'末端處或附近的外切核酸酶抗性修飾以防止被3'至5'外切核酸酶切割，且在3'末端處被阻斷以阻止通過(guò)核酸聚合酶延伸；(ii)附接至所述第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者，且包含與靶核酸序列非互補(bǔ)的序列；其中所述第二部分還包含外切核酸酶抗性修飾，其中來(lái)自各寡核苷酸探針的第二部分與來(lái)自其它寡核苷酸探針的第二部分相比具有質(zhì)量可區(qū)分的大小，

e)在包含不止一對(duì)寡核苷酸引物和不止一種寡核苷酸探針的反應(yīng)混合物中，且在聚離子去污劑、鹽和金屬緩沖液、核苷酸三磷酸以及具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶的存在下，在允許各寡核苷酸引物對(duì)和各寡核苷酸探針對(duì)與其互補(bǔ)的靶核酸序列退火以及各寡核苷酸引物對(duì)合成引物延伸產(chǎn)物的條件下，擴(kuò)增所述不止一種靶核酸，而所述核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能夠切割各退火的寡核苷酸探針并從其釋放含有各所述寡核苷酸探針的第二部分的片段，其具有或不具有來(lái)自各所述寡核苷酸探針的第一部分的額外核苷酸；

f)使所述反應(yīng)混合物經(jīng)受親和基質(zhì)，所述親和基質(zhì)識(shí)別并結(jié)合所述不止一對(duì)寡核苷酸引物和所述不止一種寡核苷酸探針上的親和標(biāo)記物；

g)過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去過(guò)量的寡核苷酸引物和未切割的寡核苷酸探針，并收集包含來(lái)自所述寡核苷酸探針的第二部分的片段的上清液；h)向所述上清液中添加堿性磷酸酶以降解未并入的核苷酸三磷酸并加入3'至5'外切核酸酶，所述3'至5'外切核酸酶將來(lái)自寡核苷酸探針的第二部分的片段切割直至外切核酸酶-抗性修飾[包含丙二醇]，由此產(chǎn)生來(lái)自各寡核苷酸探針的第二部分的單個(gè)片段，其中各單個(gè)片段對(duì)應(yīng)于靶核酸且具有獨(dú)特的質(zhì)量可區(qū)分的大??；I)通過(guò)柱色譜法除去聚離子去污劑和鹽以及金屬緩沖液；j)使用質(zhì)譜法以檢測(cè)對(duì)應(yīng)于所述樣品中存在的所述一種或多種靶核酸的單個(gè)片段的存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增步驟在多個(gè)反應(yīng)混合物中進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，移除去污劑以及質(zhì)譜法的步驟在自動(dòng)化過(guò)程中進(jìn)行。

附圖簡(jiǎn)述

圖1代表本發(fā)明的方法的說(shuō)明性描述。

圖2代表質(zhì)譜圖，其顯示寡核苷酸T₉JTTTGC經(jīng)外切核酸酶I消化后的寡核苷酸片段，其中J是2’-O-甲基-尿苷(A)、HEG間隔物(B)或丙二醇間隔物(C)。

圖3代表在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的EGFR T790M突變體5'-翼探針片段的LC-MS后，以及在不具有(A)或具有(B)通過(guò)外切核酸酶I的后續(xù)消化后的提取離子色譜圖(EIC)。

圖4代表進(jìn)行靶核酸的高通量多路檢測(cè)的本發(fā)明的方法的詳細(xì)流程圖。

圖5代表實(shí)施例3中所述的多路測(cè)定的單離子監(jiān)測(cè)色譜圖。

發(fā)明詳述

定義

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”包括包含核酸的樣本或培養(yǎng)物(例如，微生物培養(yǎng)物)。術(shù)語(yǔ)“樣品”還意圖包括生物樣品和環(huán)境樣品。樣品可以包括合成起源的樣本。生物樣品包括全血、血清、血漿、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊水、腦脊液、脊髓液、洗出液(例如，支氣管肺泡的、胃的、腹膜的、管的、耳的、關(guān)節(jié)鏡的洗出液)、活組織檢查樣品、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、膽汁、淚液、汗液、乳汁、乳房流體、胚胎細(xì)胞和胎兒細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物樣品是血液，并且更優(yōu)選地是血漿。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“血液”包括全血或任何血液級(jí)分，諸如如常規(guī)地定義的血清和血漿。血漿是指由用抗凝劑處理過(guò)的血液的離心產(chǎn)生的全血級(jí)分。血清是指血液樣品已經(jīng)凝固后剩下的流體的水樣部分。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料諸如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品，以及來(lái)自食物和乳制品加工儀器、儀器、設(shè)備、器皿、一次用棄的和非一次用棄的物品的樣品。這些實(shí)例不應(yīng)解釋為限制可應(yīng)用于本發(fā)明的樣品類(lèi)型。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“靶標(biāo)”或“靶核酸”意圖指待檢測(cè)或測(cè)量其存在、或者待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶標(biāo)包括用于它的可檢測(cè)探針(例如，寡核苷酸探針)或測(cè)定存在或可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員生產(chǎn)的基本上任何的分子。例如，靶標(biāo)可以是生物分子，諸如核酸分子、多肽、脂質(zhì)或碳水化合物，其能夠與可檢測(cè)探針(例如抗體)結(jié)合或以其它方式發(fā)生接觸，其中所述可檢測(cè)探針還包含能夠通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)的核酸。如本文所使用的“可檢測(cè)探針”是指能夠與目標(biāo)靶生物分子雜交或退火且允許如本文所述的靶生物分子的特異性檢測(cè)的任何分子或試劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述靶標(biāo)是核酸，且所述可檢測(cè)探針是寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“核酸分子”可以貫穿本公開(kāi)互換使用。所述術(shù)語(yǔ)是指寡核苷酸、寡物、多核苷酸、脫氧核糖核苷酸(DNA)、基因組DNA、線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)、細(xì)菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、質(zhì)粒、M13、P1、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、擴(kuò)增的核酸、擴(kuò)增子、PCR產(chǎn)物及其它類(lèi)型的擴(kuò)增的核酸、RNA/DNA雜交體和聚酰胺核酸(PNA)，所有這些可以呈單鏈或雙鏈形式，并且除非另有限制，否則將包括天然核苷酸的已知類(lèi)似物，其可以以與天然存在的核苷酸類(lèi)似的方式起作用，及其組合和/或混合物。因此，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”是指天然存在的和修飾的/非天然存在的核苷酸，包括三、二和單磷酸核苷，以及在聚核酸或寡核苷酸內(nèi)存在的單磷酸單體。核苷酸還可以是核糖核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2',3'-脫氧核苷酸以及本領(lǐng)域眾所周知的廣泛多樣的其它核苷酸模仿物。模仿物包括鏈終止核苷酸，諸如3'-O-甲基、鹵代堿基或糖取代；替代性的糖結(jié)構(gòu)，包括非糖、烷基環(huán)結(jié)構(gòu)；替代性的堿基，包括肌苷；脫氮修飾的；接頭修飾的χ和ψ；質(zhì)量標(biāo)記物修飾的；磷酸二酯修飾或替換，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼代磷酸酯、酰胺、酯、醚；和堿基或完全核苷酸間替換，包括切割鍵諸如光可切割的硝基苯基部分。

可以定量地或定性地測(cè)量靶標(biāo)的存在或不存在。靶標(biāo)可以以多種不同形式出現(xiàn)，包括例如簡(jiǎn)單或復(fù)雜混合物，或基本上純化的形式。例如，靶標(biāo)可以是含有其它組分的樣品的組成部分，或可以是樣品的唯一或主要組分。因此，靶標(biāo)可以是全細(xì)胞或組織的組分、細(xì)胞或組織提取物、其分級(jí)分離的裂解物或基本上純化的分子。另外，靶標(biāo)可以具有已知的或未知的序列或結(jié)構(gòu)。

術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增反應(yīng)”是指用于增加靶核酸序列的拷貝的任何體外方式。

“擴(kuò)增”是指使溶液處于足以允許擴(kuò)增的條件的步驟。擴(kuò)增反應(yīng)的組分可以包括、但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增”通常是指靶核酸的“指數(shù)”增加。然而，如本文所使用的“擴(kuò)增”還可以是指選定的靶核酸序列的數(shù)目的線(xiàn)性增加，但不同于一次性的、單引物延伸步驟。

“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”是指用于以等比數(shù)列擴(kuò)增靶雙鏈DNA的特定區(qū)段或子序列的方法。PCR是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的；參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,195和4,683,202；和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等人編, 1990。

如本文所使用的“寡核苷酸”是指通過(guò)磷酸二酯鍵或其類(lèi)似物連接的天然或修飾的核苷單體的線(xiàn)性寡聚體。寡核苷酸包括能夠特異性地結(jié)合靶核酸的脫氧核糖核苷、核糖核苷、其端基異構(gòu)形式、肽核酸(PNA)等。通常，單體通過(guò)磷酸二酯鍵或其類(lèi)似物連接以形成寡核苷酸，所述寡核苷酸的大小范圍從幾個(gè)單體單元(例如3-4個(gè))至幾十個(gè)單體單元(例如40-60個(gè))。每當(dāng)寡核苷酸通過(guò)字母的序列諸如“ATGCCTG”是指時(shí)，應(yīng)該理解，核苷酸從左到右是5'-3'順序，并且除非另外指出，否則“A”是指脫氧腺苷，“C”是指脫氧胞苷，“G”是指脫氧鳥(niǎo)苷，“T”是指脫氧胸苷，并且“U”是指核糖核苷，尿苷。通常，寡核苷酸包含四種天然脫氧核苷酸；然而，它們還可以包含核糖核苷或非天然核苷酸類(lèi)似物。當(dāng)酶由于活性具有特定寡核苷酸或多核苷酸底物要求時(shí)，例如單鏈DNA、RNA/DNA雙鏈體等，則關(guān)于寡核苷酸或多核苷酸底物的適當(dāng)組成的選擇完全是在普通技術(shù)人員的知識(shí)內(nèi)。

如本文所使用的“寡核苷酸引物”或簡(jiǎn)稱(chēng)“引物”是指這樣的多核苷酸序列：其與靶核酸模板上的序列雜交并且促進(jìn)寡核苷酸探針的檢測(cè)。在本發(fā)明的擴(kuò)增實(shí)施方案中，寡核苷酸引物充當(dāng)核酸合成的起始點(diǎn)。在非擴(kuò)增實(shí)施方案中，寡核苷酸引物可以用于建立能夠被切割試劑切割的結(jié)構(gòu)。引物可以具有多種長(zhǎng)度，并且通常是小于50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，例如12-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度?？梢曰诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的原則來(lái)設(shè)計(jì)用于PCR中的引物的長(zhǎng)度和序列。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸探針”是指這樣的多核苷酸序列：其能夠與目標(biāo)靶核酸雜交或退火并且允許所述靶核酸的特異性檢測(cè)。

“親和”標(biāo)記物是可以特異性結(jié)合其分子結(jié)合配偶體的分子。所述結(jié)合可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)(例如，離子、氫等)鍵。如本文所使用，親和標(biāo)記物諸如生物素可以選擇性結(jié)合親和基質(zhì)，諸如鏈霉抗生物素蛋白包被的珠粒或顆粒。如本文所使用，“鏈霉抗生物素蛋白包被的顆?！笨梢耘c“抗生物素蛋白包被的顆?！被Q使用。

如本文所使用的“親和基質(zhì)”是指附接至固體支持物或固體基質(zhì)(例如磁性膠乳顆粒、玻璃珠粒)的表面的分子，其可以特異性結(jié)合其分子結(jié)合配偶體。所述結(jié)合可以通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。如本文所使用，親和基質(zhì)(諸如鏈霉抗生物素蛋白包被的顆粒)可以選擇性結(jié)合親和標(biāo)記物，諸如生物素。

“錯(cuò)配核苷酸”或“錯(cuò)配”是指在所述一個(gè)或多個(gè)位置處與靶序列不互補(bǔ)的核苷酸。寡核苷酸探針可以具有至少一個(gè)錯(cuò)配，但還可以具有2、3、4、5、6或7個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配核苷酸。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”是指等位基因變體。多態(tài)性可以包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性。多態(tài)性可以是由于與另一個(gè)等位基因相比在一個(gè)等位基因處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代，或可以是由于本領(lǐng)域已知的插入或缺失、復(fù)制、反向及其它改變。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)量可區(qū)分的大小”可以與“切割產(chǎn)物大小”、“降解產(chǎn)物大小”或“探針片段大小”互換使用，并且是指如通過(guò)本文方法描述的由寡核苷酸探針的切割和釋放產(chǎn)生的一種或多種降解產(chǎn)物的大小。具有質(zhì)量可區(qū)分的大小(MDF)的片段可以包括、但不限于寡核苷酸探針片段、核苷酸寡核苷酸探針片段、非核苷酸寡核苷酸探針片段、含有修飾標(biāo)簽(例如疏水部分和親和部分)以促進(jìn)分離的寡核苷酸探針片段。產(chǎn)生具有獨(dú)特的質(zhì)量可區(qū)分的大小的片段會(huì)導(dǎo)致顯著改善的靈敏度，且允許增強(qiáng)進(jìn)行多路反應(yīng)的能力。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“修飾”是指在分子水平(例如，堿基部分、糖部分或磷酸酯主鏈)改變寡核苷酸探針。核苷修飾包括但不限于：引入切割阻斷劑或裂解誘導(dǎo)物、引入小溝結(jié)合劑、同位素富集、同位素耗盡、引入氘和鹵素修飾。核苷修飾還可以包括增加雜交的嚴(yán)格性或增加寡核苷酸探針的解鏈溫度的部分。例如，核苷酸分子可以用連接2'和4'碳的額外橋進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生對(duì)核酸酶切割具有抗性的鎖核酸(LNA)核苷酸。

提及一種分子與另一種分子的結(jié)合的術(shù)語(yǔ)“特異性的”或“特異性”，諸如探針對(duì)靶多核苷酸的特異性，是指兩種分子之間的識(shí)別、接觸和穩(wěn)定復(fù)合物的形成，以及該分子與其它分子的大幅減少的識(shí)別、接觸或復(fù)合物形成。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“退火”是指兩種分子之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

如果探針的至少一個(gè)區(qū)域與核酸序列的補(bǔ)體的至少一個(gè)區(qū)域共享實(shí)質(zhì)序列同一性，則所述探針“能夠與核酸序列退火”。“實(shí)質(zhì)序列同一性”是至少約80%、優(yōu)選地至少約85%、更優(yōu)選地至少約90%、95%或99%、和最優(yōu)選地100%的序列同一性。為了確定DNA序列和RNA序列的序列同一性的目的，U和T通常視為相同核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探針能夠與包含序列GCUGAU的靶RNA序列雜交。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“切割試劑”是指能夠切割寡核苷酸探針以產(chǎn)生質(zhì)量可區(qū)分的大小的片段的任何方式，包括但不限于酶。對(duì)于其中不發(fā)生擴(kuò)增的方法，切割試劑可以?xún)H用于切割、降解或以其它方式釋放寡核苷酸探針的第二部分或其片段。切割試劑可以是酶。切割試劑可以是天然的、合成的、未修飾的或修飾的。

對(duì)于其中發(fā)生擴(kuò)增的方法，切割試劑優(yōu)選地是具有合成(或聚合)活性和核酸酶活性的酶。這樣的酶通常為核酸擴(kuò)增酶。核酸擴(kuò)增酶的一個(gè)實(shí)例是核酸聚合酶，諸如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I。所述酶可以是天然存在的、未修飾的或修飾的。

術(shù)語(yǔ)“切割所述片段直至外切核酸酶抗性修飾”意指切割片段直至到達(dá)外切核酸酶抗性修飾自身或在定位接近于外切核酸酶抗性修飾的限定核苷酸處的切割活性。對(duì)于3'至5'外切核酸酶活性，接近于修飾的限定核苷酸可以位于距離所述修飾緊3'的第一個(gè)位置處?；蛘?，該限定核苷酸可以位于距離所述修飾3'兩個(gè)或三個(gè)或甚至更多個(gè)位置，只要通過(guò)3'至5'外切核酸酶的切割一致地在限定核苷酸的位置處終止。

術(shù)語(yǔ)“丙二醇”或“丙二醇間隔物”是指1,3-丙二醇，并且與丙烷-1,3-二醇、1,3-二羥基丙烷和亞丙基二醇同義。術(shù)語(yǔ)“HEG”或“HEG間隔物”是指六甘醇，其與3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二醇同義。術(shù)語(yǔ)反向核苷酸是指其中糖部分經(jīng)由3'至3'磷酸二酯鍵而連接至鄰近核苷酸的糖部分的核苷酸。

術(shù)語(yǔ)“質(zhì)譜的污染物”是指能夠干擾通過(guò)質(zhì)譜儀檢測(cè)具有質(zhì)量可區(qū)分大小(MDF)的片段的任何物質(zhì)。質(zhì)譜的一些污染物的實(shí)例公開(kāi)于Keller等人，Analytica Chimica Acta(2008)627:71-81中。

“核酸聚合酶”是指催化核苷酸向核酸內(nèi)的摻入的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶等。

“熱穩(wěn)定的DNA聚合酶”是指這樣的DNA聚合酶：當(dāng)遭受高溫選定的時(shí)間段時(shí)，其為穩(wěn)定的(即抵抗分解或變性)且保持足夠的催化活性。例如，當(dāng)遭受高溫使雙鏈核酸變性所需的時(shí)間時(shí)，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶保留實(shí)現(xiàn)后續(xù)引物延伸反應(yīng)的足夠活性。核酸變性所需的加熱條件是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,202和4,683,195中舉例說(shuō)明。如本文所使用的熱穩(wěn)定的聚合酶通常適用于溫度循環(huán)反應(yīng)諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)中。熱穩(wěn)定的核酸聚合酶的實(shí)例包括水生棲熱菌Taq DNA聚合酶、棲熱菌屬(Thermus)種Z05聚合酶、黃棲熱菌(Thermus flavus)聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶諸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。

“修飾的”聚合酶是指其中至少一個(gè)單體不同于參照序列的聚合酶，所述參照序列諸如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一種修飾形式。示例性修飾包括單體插入、缺失和取代。修飾的聚合酶還包括嵌合聚合酶，其具有衍生自?xún)蓚€(gè)或更多個(gè)親本的可鑒定的組分序列(例如，結(jié)構(gòu)或功能結(jié)構(gòu)域等)。在修飾的聚合酶的定義內(nèi)還包括包含參照序列的化學(xué)修飾的那些。修飾的聚合酶的實(shí)例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。

術(shù)語(yǔ)“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”是指通常與核酸鏈合成相關(guān)的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5'末端除去。例如，大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活性，而克列諾片段沒(méi)有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。術(shù)語(yǔ)“單鏈特異性5'-3'外切核酸酶”是指從5'末端起作用的外切核酸酶，其相對(duì)于雙鏈核酸對(duì)單鏈核酸具有優(yōu)先性。這樣的單鏈特異性5'-3' 外切核酸酶的實(shí)例包括：來(lái)自枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的外切核酸酶、來(lái)自脾的磷酸二酯酶、來(lái)自酵母的外切核酸酶II、來(lái)自酵母的外切核酸酶V和來(lái)自粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)的外切核酸酶。

術(shù)語(yǔ)“3'至5'外切核酸酶”或“3'至5'外切核酸酶活性”是指酶或酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的3'末端除去。3'至5'外切核酸酶的實(shí)例包括：來(lái)自大腸桿菌的外切核酸酶I、來(lái)自大腸桿菌的外切核酸酶IV、來(lái)自大腸桿菌的外切核酸酶V、來(lái)自噬菌體T4的T4外切核酸酶IV、來(lái)自噬菌體T4的T4 DNA聚合酶、來(lái)自酵母的外切核酸酶I、來(lái)自酵母的外切核酸酶III、來(lái)自大腸桿菌的DNA聚合酶I、Klenow片段、來(lái)自果蠅屬(Drosophila)的DNA聚合酶α、來(lái)自果蠅屬的DNA聚合酶γ和蛇毒磷酸二酯酶。

本發(fā)明的各個(gè)方面基于核酸聚合酶的特殊性質(zhì)。核酸聚合酶可以具有幾種活性，其中包括5'至3'核酸酶活性，由此核酸聚合酶可以從寡核苷酸切割單核苷酸或小寡核苷酸，所述寡核苷酸與其較大互補(bǔ)多核苷酸退火。為了使切割有效地發(fā)生，上游寡核苷酸還必須與相同的較大多核苷酸退火。

利用5'至3'核酸酶活性的靶核酸的檢測(cè)可以通過(guò)如以下文獻(xiàn)中所述的“TaqMan?”或“5′-核酸酶測(cè)定”來(lái)進(jìn)行：美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,210,015、5,487,972和5,804,375；和Holland等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280。在TaqMan?測(cè)定中，在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)雜交的標(biāo)記的檢測(cè)探針在擴(kuò)增反應(yīng)期間存在。探針如此進(jìn)行修飾，以阻止探針充當(dāng)DNA合成的引物。所述擴(kuò)增使用對(duì)雙鏈核酸具有5'至3′核酸酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行。在擴(kuò)增的每個(gè)合成步驟期間，與來(lái)自待延伸引物下游的靶核酸雜交的任何探針通過(guò)DNA聚合酶的5'至3′核酸酶活性降解。因此，新靶鏈的合成也導(dǎo)致探針的降解，并且降解產(chǎn)物的積累會(huì)提供靶序列合成的量度。

適合用于檢測(cè)降解產(chǎn)物的任何方法均可用在5'核酸酶測(cè)定中。通常，檢測(cè)探針用兩種熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，其中之一能夠猝滅另一種染料的熒光。所述染料附接至探針，通常報(bào)道或檢測(cè)染料附接至5'末端，且猝滅染料附接至內(nèi)部位點(diǎn)，使得當(dāng)探針處于非雜交狀態(tài)時(shí)，猝滅發(fā)生，并且使得通過(guò)DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性實(shí)現(xiàn)的探針切割發(fā)生在兩種染料之間。擴(kuò)增導(dǎo)致染料之間的探針切割，伴隨猝滅的消除和來(lái)自最初猝滅的染料的可觀(guān)察的熒光的增加。通過(guò)測(cè)量反應(yīng)熒光的增加，監(jiān)測(cè)降解產(chǎn)物的積累。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,491,063和5,571,673描述了用于檢測(cè)與擴(kuò)增伴隨發(fā)生的探針降解的替代方法。

用于檢測(cè)靶核酸的5'核酸酶測(cè)定可以采用具有5'至3′核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在某些實(shí)施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是熱穩(wěn)定和熱活性的核酸聚合酶。這樣的熱穩(wěn)定的聚合酶包括、但不限于來(lái)自真細(xì)菌屬棲熱菌屬、熱袍菌屬(Thermatoga)和棲熱腔菌屬(Thermosipho)的多個(gè)種的天然和重組形式的聚合酶以及其嵌合形式。例如，可以用于本發(fā)明的方法中的棲熱菌屬種聚合酶包括水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、棲熱菌屬種Z05(Z05)DNA聚合酶、棲熱菌屬種sps17(sps17)和棲熱菌屬種Z05(例如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762中所述)?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法中的熱袍菌屬聚合酶包括例如海棲熱袍菌DNA聚合酶和新阿波羅棲熱袍菌(Thermatoga neapolitana)DNA聚合酶，而可以使用的棲熱腔菌屬聚合酶的一個(gè)實(shí)例是非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)DNA聚合酶。海棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌DNA聚合酶的序列公開(kāi)于具有公開(kāi)號(hào)WO 92/06200的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US91/07035中。新阿波羅棲熱袍菌的序列可以在國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)WO 97/09451中找到。

在5'核酸酶測(cè)定中，擴(kuò)增檢測(cè)通常與擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生(即，“實(shí)時(shí)”)。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)是定量的，并且擴(kuò)增檢測(cè)是實(shí)時(shí)的。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)是定性的(例如，靶核酸的存在或不存在的終點(diǎn)檢測(cè))。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)在擴(kuò)增之后。在某些實(shí)施方案中，擴(kuò)增檢測(cè)是定性的，并且擴(kuò)增檢測(cè)在擴(kuò)增之后。

在本發(fā)明中，來(lái)自寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物的檢測(cè)不涉及使用熒光報(bào)道染料和猝滅染料，而是涉及具有兩個(gè)不同部分的探針的合成。第一部分是與靶核酸至少部分互補(bǔ)的互補(bǔ)部分，并且由標(biāo)準(zhǔn)核苷酸或核苷酸類(lèi)似物組成，使得該部分能夠與待檢測(cè)的靶核酸結(jié)合。此外，探針的該第一部分的3'末端是修飾的或被封閉的，使得它不可被DNA聚合酶延伸。阻斷3'末端以阻止聚合酶的延伸可以通過(guò)在3'端放置非匹配(即非互補(bǔ))核苷酸或通過(guò)修飾或除去末端核苷酸的3'-羥基來(lái)實(shí)現(xiàn)。第一部分還含有如下所述的3'-5'外切核酸酶抗性修飾。第二部分是附接至第一部分的5'末端的非互補(bǔ)部分，并且形成不能與靶核酸結(jié)合的“5'翼”區(qū)(參見(jiàn)圖1)。該5'翼部分可以包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸兩者?？梢源嬖谟诠押塑账崽结樀?'翼第二部分中的非核苷酸可以是任何有機(jī)部分或重復(fù)單元(例如(CH₂-CH₂-O)_n等)。第二部分還含有使得其對(duì)3'至5'外切核酸酶的活性具有抗性的修飾(在圖1中顯示為“X”)。這種修飾可以是核苷酸類(lèi)似物，其無(wú)法被3'至5'外切核酸酶切割，并且這樣的核苷酸類(lèi)似物的實(shí)例包括硫代磷酸酯、2'-O-甲基-核糖核苷酸、丙二醇間隔物、HEG間隔物、反向核苷酸或使得寡核苷酸片段在修飾附接點(diǎn)外對(duì)于核酸外切切割具有抗性的任何其它修飾。

本發(fā)明提供了寡核苷酸引物和探針。不預(yù)期用于產(chǎn)生這些探針和引物的方法以任何方式受到限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉多種用于產(chǎn)生探針和引物的化學(xué)合成策略和試劑。還不預(yù)期本發(fā)明的寡核苷酸探針限于天然存在的核苷酸結(jié)構(gòu)或天然存在的堿基(例如，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。除核酸中通常發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基之外，非天然核酸類(lèi)似物也與本發(fā)明一起使用。

非天然類(lèi)似物包括具有非天然存在的雜環(huán)堿基或其它修飾的堿基的那些。具體地，許多非天然存在的堿基進(jìn)一步描述在，例如，Seela等人(1991), Helv. Chim. Acta 74: 1790, Grein等人(1994), Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 971-976,和Seela等人(1999), Helv. Chim. Acta 82: 1640。為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明，任選地包括在核苷酸中使用的充當(dāng)解鏈溫度(Tm)改性劑的某些堿基。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如，7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN (例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,990,303。其它代表性的雜環(huán)堿基包括，例如，次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的8-氮雜衍生物；腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物；6-氮雜胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6- 異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶等。為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明，修飾的寡核苷酸的其它實(shí)例包括具有一個(gè)或多個(gè)鎖核酸(LNA?)單體的那些(包含LNA?單體的寡核苷酸，可得自例如Link Technologies，Ltd.，Lanarkshire，蘇格蘭；在來(lái)自Exiqon A/S, Vedb?k, Denmark的許可證下)。諸如這些的核苷酸類(lèi)似物也描述在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,639,059、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,303,315和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2003/0092905中。

使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，可以制備寡核苷酸探針和引物。在某些實(shí)施方案中，例如，使用任何核酸合成方法化學(xué)合成寡核苷酸探針和引物，所述方法包括例如根據(jù)Beaucage和Caruthers (1981), Tetrahedron Letts. 22(20): 1859 1862描述的固相亞磷酰胺方法。為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明，還可以使用三酯法合成寡核苷酸(參見(jiàn)，例如，Capaldi等人(2000), “Highly efficient solid phase synthesis of oligonucleotide analogs containing phosphorodithioate linkages”, Nucleic Acids Res. 28(9):e40, 和Eldrup等人(1994), “Preparation of oligodeoxyribonucleoside phosphorodithioates by a triester method”, Nucleic Acids Res. 22(10): 1797-1804)。還可以利用本領(lǐng)域已知的其它合成技術(shù)，包括、例如，使用自動(dòng)化的合成儀，如在Needham VanDevanter等人(1984), Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168中所述。多種用于自動(dòng)化寡核苷酸合成的設(shè)備是商購(gòu)可得的。還任選地利用多核苷酸合成方案(例如，三-核苷酸合成等)。此外，引物核酸任選地包括各種修飾。在某些實(shí)施方案中，例如，引物包括限制位點(diǎn)接頭，例如以促進(jìn)后續(xù)擴(kuò)增子克隆等。為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明，引物還任選地經(jīng)過(guò)修飾以改善擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，如例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,001,611中所述。引物和探針還可以用如本文描述的或如本領(lǐng)域以其它方式已知的各種其它修飾進(jìn)行合成。

在本發(fā)明的反應(yīng)混合物、方法和其它方面中利用的探針可以具有核苷酸或非核苷酸標(biāo)簽。這樣的標(biāo)簽可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)直接地或間接地附接至寡核苷酸。為了舉例說(shuō)明，取決于使用的標(biāo)簽的類(lèi)型，標(biāo)簽可以附接至末端(寡核苷酸引物和/或探針的5’或3’末端)或非末端核苷酸，并且可以通過(guò)各種大小和組成的接頭或間隔臂間接地附接。使用商購(gòu)可得的亞磷酰胺試劑，經(jīng)由適當(dāng)保護(hù)的亞磷酰胺，可以產(chǎn)生在5'或3'末端處含有官能團(tuán)(例如，硫醇或伯胺)的寡核苷酸，并且可以使用例如以下文獻(xiàn)中所述的方案將標(biāo)簽附接至這樣的寡核苷酸：Innis等人(編) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990)(Innis)。

基本上任何核酸(標(biāo)準(zhǔn)的或非標(biāo)準(zhǔn)的，標(biāo)記或未標(biāo)記的)可以從多種商業(yè)來(lái)源中的任一種定制或標(biāo)準(zhǔn)定購(gòu)，諸如The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX)、Operon Technologies Inc. (Huntsville, AL)、Proligo LLC (Boulder, CO)及許多其它公司。

本發(fā)明還提供了包括實(shí)施本發(fā)明的方法所需的組分的試劑盒，所述組分可以包括以下中的一種或多種：請(qǐng)求保護(hù)的組合物(請(qǐng)求保護(hù)的寡核苷酸探針和引物)、酶(DNA聚合酶、外切核酸酶、堿性磷酸酶)、用于擴(kuò)增的試劑(核苷酸三磷酸、鹽和去污劑)和用于純化的試劑(親和樹(shù)脂)。通常，為了易于使用而將所述試劑盒隔室化，并且含有提供用于實(shí)施所述方法的組分的容器。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列，包括對(duì)照核酸序列(用于陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照)。

由于探針的退火的第一部分中的多重切割位點(diǎn)，在TaqMan PCR測(cè)定中使用本發(fā)明的寡核苷酸探針導(dǎo)致探針的多重片段的生成(圖1)。盡管這些片段在通過(guò)質(zhì)譜法的后續(xù)檢測(cè)中獲得關(guān)于給定靶核酸的“質(zhì)量可區(qū)分標(biāo)志”，但樣品中的多種靶核酸的存在(例如，用超過(guò)十種靶核酸的多路測(cè)定)生成巨大數(shù)目的“質(zhì)量可區(qū)分標(biāo)志”片段，使得將出現(xiàn)源于不同靶核酸的具有非常相似的質(zhì)量的片段。因此，準(zhǔn)確鑒定特定靶核酸的存在或不存在將是困難的。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)提供使用3'至5'外切核酸酶的處理步驟得到解決，所述3'至5'外切核酸酶將切割片段直至到達(dá)外切核酸酶抗性修飾自身，或在定位接近于在5'翼部分上的外切核酸酶抗性修飾的3'側(cè)的限定核苷酸處，并且不再進(jìn)一步切割片段。因此，對(duì)于每種個(gè)別靶核酸生成單個(gè)“獨(dú)特質(zhì)粒”片段，并且通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。

具有質(zhì)量可區(qū)分的大小(MDF)的片段通過(guò)特定物理屬性或檢測(cè)特征(包括、但不限于長(zhǎng)度、質(zhì)量、電荷或荷質(zhì)比)來(lái)區(qū)分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)特征是質(zhì)量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)特征是電荷和質(zhì)量。MDF的分離和檢測(cè)可以通過(guò)電泳分離(例如，通過(guò)凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、等電聚焦、通過(guò)微流體電泳)來(lái)完成?；蛘?，分離和檢測(cè)可以使用液相色譜(例如，高效液相色譜(HPLC)、反相HPLC、超高效液相色譜(UPLC)等)來(lái)完成。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，MDF可以通過(guò)與物理屬性相關(guān)的行為來(lái)區(qū)分，包括、但不限于質(zhì)量、在MALDI-TOF質(zhì)譜法中的飛行時(shí)間。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，來(lái)自一種或多種寡核苷酸探針的MDF被釋放且從質(zhì)譜基質(zhì)選擇性地解吸，使得非選擇性引物和寡核苷酸探針(即不存在靶核酸)不解吸。對(duì)于這些實(shí)施方案，與寡核苷酸探針或反應(yīng)混合物中存在的其它非MDF相比，MDF應(yīng)從質(zhì)譜基質(zhì)更有效地解吸。優(yōu)選的質(zhì)譜基質(zhì)包括2,5-二羥基苯甲酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸、3-羥基吡啶甲酸(3-HPA)、檸檬酸二銨(DAC)和它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)譜基質(zhì)可以設(shè)計(jì)用于蛋白質(zhì)分析。用于蛋白質(zhì)分析的示例性基質(zhì)包括、但不限于DHB和CHCA。

該方法可以進(jìn)一步包括使一種或多種寡核苷酸探針片段(即，MDF)與未切割的或部分地切割的寡核苷酸探針?lè)蛛x的另外步驟?？梢允褂貌东@配體(諸如生物素或其它親和配體)和與所述捕獲配體具有特異性結(jié)合活性的捕獲試劑(諸如抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、抗體、受體、與MDF互補(bǔ)的捕獲探針或其功能片段)來(lái)完成分離。MDF可以含有對(duì)捕獲試劑具有特異性結(jié)合活性的捕獲配體。捕獲配體和捕獲試劑還可以用于給MDF的剩余部分添加質(zhì)量，使得它可以從質(zhì)譜儀中檢測(cè)的MDF的質(zhì)量范圍中排除。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針可以具有用于切割產(chǎn)物的通用擴(kuò)增的通用引物。

分離步驟還可以用于從MDF中除去鹽、酶或其它緩沖液組分。本領(lǐng)域眾所周知的幾種方法諸如色譜、凝膠電泳或沉淀可以用于提純樣品。例如，尺寸排阻色譜或親和色譜可以用于從樣品除去鹽。分離方法的選擇可以取決于樣品的量。例如，當(dāng)少量樣品可獲得或使用小型化儀器時(shí)，可以使用微量親和色譜分離步驟。另外，是否需要分離步驟，以及分離方法的選擇，可以取決于使用的檢測(cè)方法。例如，通過(guò)從樣品除去鹽，可以改善基質(zhì)輔助的激光解吸/電離和電噴射電離的效率。例如，鹽可以吸收來(lái)自基質(zhì)輔助的激光解吸/電離中的激光的能量并且導(dǎo)致更低的電離效率。

質(zhì)譜法是檢測(cè)本發(fā)明的具有質(zhì)量可區(qū)分的大小(MDF)的片段的優(yōu)選方法，并且因此鑒定和/或定量靶核酸。MDF可以在質(zhì)譜儀中離子化，并且離子基于它們的質(zhì)荷比在空間或時(shí)間中分離。質(zhì)譜儀然后計(jì)算與每種離子相關(guān)的質(zhì)量。因此，當(dāng)提及質(zhì)譜法時(shí)，術(shù)語(yǔ)質(zhì)量可以用于簡(jiǎn)潔描述質(zhì)荷比。

質(zhì)譜法是用于分離和鑒定分子的靈敏且準(zhǔn)確的技術(shù)。通常，質(zhì)譜儀具有兩個(gè)主要部件，即用于產(chǎn)生離子的離子源和用于測(cè)量離子的質(zhì)荷比的質(zhì)量選擇性分析儀，其是且轉(zhuǎn)換成這些離子的質(zhì)量的測(cè)量。幾種電離方法是本領(lǐng)域已知的并且在本文中描述。MDF可以在從寡核苷酸探針切割之前、期間或之后是帶電的。結(jié)果，通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)量的MDF不總是需要電荷，因?yàn)殡姾煽梢酝ㄟ^(guò)質(zhì)譜法操作來(lái)獲得。在質(zhì)譜法分析中，MDF的任選組分諸如電荷和檢測(cè)部分可以用于給MDF貢獻(xiàn)質(zhì)量。

如本文所述的不同質(zhì)譜法方法例如四極質(zhì)譜法、離子阱質(zhì)譜法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法和串聯(lián)質(zhì)譜法可以利用離子源和質(zhì)量分析儀的各種組合，其允許在設(shè)計(jì)定制的檢測(cè)方案中的靈活性。另外，質(zhì)譜儀可以程序化成將來(lái)自離子源的所有離子依次或同時(shí)傳遞進(jìn)質(zhì)譜儀。此外，質(zhì)譜儀可以程序化成選擇特定質(zhì)量的離子用于傳遞進(jìn)質(zhì)譜儀，同時(shí)阻斷其它離子。

精確地控制質(zhì)譜儀中的離子移動(dòng)的能力允許檢測(cè)方案中的更多選項(xiàng)，當(dāng)分析例如來(lái)自多路實(shí)驗(yàn)的大量MDF時(shí)，這可以是有利的。例如，在具有大量MDF的多路實(shí)驗(yàn)中，可以有利的是，從一組相似報(bào)道分子中選擇個(gè)別報(bào)道分子且然后分別分析該報(bào)道分子?；诳刂仆ㄟ^(guò)質(zhì)譜儀檢測(cè)的質(zhì)量范圍的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括從分析中排除未切割的或部分地切割的帶標(biāo)簽的探針的能力，這會(huì)降低來(lái)自測(cè)定的背景噪音。

質(zhì)譜儀可以分辨具有小質(zhì)量差異的離子，并且以高準(zhǔn)確度測(cè)量離子的質(zhì)量。因此，相似質(zhì)量的MDF可以一起用于相同實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)橘|(zhì)譜儀可以區(qū)分甚至緊密相關(guān)的標(biāo)簽的質(zhì)量。使用質(zhì)譜法方法達(dá)到的高分辨程度和質(zhì)量準(zhǔn)確度允許使用帶標(biāo)簽的探針的大集合，因?yàn)樗玫降膱?bào)道標(biāo)簽可以彼此區(qū)分。當(dāng)設(shè)計(jì)多路實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用帶標(biāo)簽的探針的大集合的能力是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。

使用質(zhì)譜法用于檢測(cè)MDF的質(zhì)量的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是基于這類(lèi)質(zhì)量分析的高靈敏度。通過(guò)利用由離子源形成的大部分離子且將這些離子通過(guò)質(zhì)量分析儀有效地傳遞給檢測(cè)器，質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)高靈敏度。因?yàn)樵摳哽`敏度水平，使用質(zhì)譜法可以測(cè)量甚至有限量的樣品。這可以是多路實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，在所述多路實(shí)驗(yàn)中每個(gè)MDF種類(lèi)的量可以很小。

質(zhì)譜法方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)Burlingame等人. Anal. Chem. 70: 647R-716R (1998)；Kinter和Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, New York (2000))。與質(zhì)譜法方法相關(guān)的基本過(guò)程是產(chǎn)生從樣品衍生出的氣相離子并測(cè)量其質(zhì)量。

使用在質(zhì)譜儀中產(chǎn)生的電磁場(chǎng)，可以精確地控制氣相離子的移動(dòng)。離子在這些電磁場(chǎng)中的移動(dòng)與離子的m/z成比例，并且這構(gòu)成測(cè)量樣品的m/z并因此測(cè)量樣品的質(zhì)量的基礎(chǔ)。離子在這些電磁場(chǎng)中的移動(dòng)允許離子被包含和集中，這解釋了質(zhì)譜法的高靈敏度。在m/z測(cè)量過(guò)程期間，離子以高效率傳遞給顆粒檢測(cè)器，所述顆粒檢測(cè)器記錄這些離子的到達(dá)。在每個(gè)m/z處的離子數(shù)量通過(guò)圖上的峰來(lái)證實(shí)，在圖中x軸是m/z，并且y軸是相對(duì)豐度。不同的質(zhì)譜儀具有不同的分辨水平，也就是說(shuō)，分辨在質(zhì)量上緊密相關(guān)的離子之間的峰的能力。分辨率定義為R=m/δm，其中m是離子質(zhì)量，并且δm是質(zhì)譜圖中兩個(gè)峰之間的質(zhì)量差異。例如，具有1000的分辨率的質(zhì)譜儀可以將具有100.0的m/z的離子與具有100.1的m/z的離子區(qū)分開(kāi)。

現(xiàn)有若干類(lèi)型的質(zhì)譜儀，并且可以以各種構(gòu)型產(chǎn)生。一般而言，質(zhì)譜儀具有以下主要部件：樣品入口、離子源、質(zhì)量分析儀、檢測(cè)器、真空系統(tǒng)和儀器控制系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)系統(tǒng)。樣品入口、離子源和質(zhì)量分析儀中的差異一般限定儀器的類(lèi)型及其能力。例如，入口可以是毛細(xì)管柱液相色譜源，或可以是諸如在基質(zhì)輔助的激光解吸中使用的直接探針或臺(tái)(stage)。常見(jiàn)的離子源是例如電噴射，包括納米噴霧和微米噴霧或基質(zhì)輔助的激光解吸。示例性的質(zhì)量分析儀包括四極質(zhì)量過(guò)濾器、離子阱質(zhì)量分析儀和飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀。

離子形成過(guò)程是質(zhì)譜圖分析的起點(diǎn)。幾種電離法是可獲得的，并且電離法的選擇取決于待分析的樣品。例如，對(duì)于多肽的分析，相對(duì)溫和的電離操作諸如電噴射電離(ESI)可以是合乎需要的。對(duì)于ESI，使含有樣品的溶液在高電位穿過(guò)細(xì)針，所述高電位產(chǎn)生強(qiáng)電場(chǎng)，從而產(chǎn)生被導(dǎo)向質(zhì)譜儀的高度荷電的微滴的細(xì)噴霧。其它電離操作包括例如快原子轟擊(FAB)，其使用中性原子的高能束來(lái)撞擊固相樣品，從而造成解吸和電離。基質(zhì)輔助的激光解吸電離(MALDI)是一種其中使用激光脈沖撞擊樣品的方法，所述樣品已經(jīng)在吸收紫外線(xiàn)的化合物基質(zhì)中結(jié)晶。本領(lǐng)域已知的其它電離操作包括例如等離子體和輝光放電、等離子體解吸電離、共振電離、和次級(jí)電離。MDF可以在從帶標(biāo)簽的探針切割之前、期間或之后變成離子化。

電噴射電離(ESI)具有可用于本文描述的發(fā)明的幾種特性。例如，ESI可以用于難以電離或蒸發(fā)的生物分子諸如多肽。另外，ESI的效率可以是極高的，這會(huì)提供用于高靈敏度測(cè)量的基礎(chǔ)。此外，ESI產(chǎn)生來(lái)自溶液的荷電分子，這對(duì)于分析溶液中的MDF是方便的。相反，電離程序諸如MALDI要求在電離前使樣品結(jié)晶。

因?yàn)镋SI可以直接從溶液產(chǎn)生荷電分子，所以它與來(lái)自液相色譜系統(tǒng)的樣品相容。例如，質(zhì)譜儀可以具有用于液相色譜系統(tǒng)(諸如HPLC)的入口，使得級(jí)分從色譜柱流進(jìn)質(zhì)譜儀內(nèi)。液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜儀的這種線(xiàn)內(nèi)排列有時(shí)被稱(chēng)為L(zhǎng)C-MS。LC-MS系統(tǒng)可以用于例如在質(zhì)譜法分析前使未切割的或部分地切割的MDF與切割的MDF分離。另外，色譜可以用于在質(zhì)譜法分析前從MDF樣品除去鹽或其它緩沖液組分。例如，使用線(xiàn)內(nèi)或離線(xiàn)反相HPLC柱使樣品脫鹽，可以用于增加電離過(guò)程的效率，且因此改善質(zhì)譜法的檢測(cè)靈敏度。

多種質(zhì)量分析儀是可獲得的，其可以與不同離子源配對(duì)。不同的質(zhì)量分析儀具有不同的優(yōu)點(diǎn)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和如本文描述的。選擇用于檢測(cè)的質(zhì)譜儀和方法取決于特定測(cè)定，例如，當(dāng)產(chǎn)生少量離子用于檢測(cè)時(shí)，可以使用更靈敏的質(zhì)量分析儀。在下文描述了幾類(lèi)質(zhì)量分析儀和質(zhì)譜法方法。

離子遷移率質(zhì)量(IM)光譜測(cè)定法是一種氣相分離方法，其給質(zhì)譜法(MS)添加新量綱。IM基于氣相離子的碰撞橫截面來(lái)分離它們，并且可以與飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜法偶聯(lián)以產(chǎn)生用于鑒定和表征蛋白質(zhì)和肽的有力工具。因此，當(dāng)MDF是蛋白質(zhì)或肽時(shí)，IM-MS對(duì)于本發(fā)明而言具有特殊效用。Verbeck等人在Journal of Biomolecular Techniques(第13卷, 第2期, 56-61)中更詳細(xì)地討論了IM-MS。

四極質(zhì)譜法利用四極質(zhì)量過(guò)濾器或分析儀。這類(lèi)質(zhì)量分析儀由排列為兩套兩個(gè)電連接桿的四個(gè)桿組成。當(dāng)離子從質(zhì)量過(guò)濾器開(kāi)始移動(dòng)到末端時(shí)，將rf和dc電壓的組合施加于每對(duì)桿，這會(huì)產(chǎn)生引起離子的振蕩運(yùn)動(dòng)的場(chǎng)。這些場(chǎng)的結(jié)果是在一對(duì)桿中產(chǎn)生高通質(zhì)量過(guò)濾器，并且在另一對(duì)桿中產(chǎn)生低通過(guò)濾器。高通和低通過(guò)濾器之間的重疊留下限定的m/z，其可以穿過(guò)兩個(gè)過(guò)濾器且穿越四極的長(zhǎng)度。該m/z被選擇且在四極質(zhì)量過(guò)濾器中保持穩(wěn)定，而所有其它m/z具有不穩(wěn)定的軌跡并且不保留在質(zhì)量過(guò)濾器中。質(zhì)譜圖如下產(chǎn)生：使施加的場(chǎng)逐漸變化，使得逐漸增加的m/z被選擇穿過(guò)質(zhì)量過(guò)濾器且到達(dá)檢測(cè)器。另外，通過(guò)施加僅rf場(chǎng)，四極還可以設(shè)置為含有且傳遞所有m/z的離子。這允許四極充當(dāng)質(zhì)譜儀的特定區(qū)域中的透鏡或聚焦系統(tǒng)，在所述特定區(qū)域中需要離子傳遞而無(wú)需質(zhì)量過(guò)濾。這可用于如下文進(jìn)一步描述的串聯(lián)質(zhì)譜法中。

四極質(zhì)量分析儀、以及本文描述的其它質(zhì)量分析儀可以程序化成分析限定的m/z或質(zhì)量范圍。質(zhì)譜儀的這種特性對(duì)于本文描述的發(fā)明是有用的。因?yàn)榍懈畹腗DF的質(zhì)量范圍是在測(cè)定前已知的，所以質(zhì)譜儀可以程序化成傳遞投射的正確質(zhì)量范圍的離子，同時(shí)排除更高或更低質(zhì)量范圍的離子。選擇質(zhì)量范圍的能力可以減小測(cè)定中的背景噪音并且因此增加信噪比。另外，限定的質(zhì)量范圍可以用于排除任何未切割的寡核苷酸探針的分析，所述未切割的寡核苷酸探針具有比MDF的質(zhì)量更高的質(zhì)量。因此，質(zhì)譜儀可以完成固有的分離步驟以及MDF的檢測(cè)和鑒定。

離子阱質(zhì)譜法利用離子阱質(zhì)量分析儀。在這些質(zhì)量分析儀中，施加場(chǎng)使得所有m/z的離子最初都被捕集在質(zhì)量分析儀中且在其中振蕩。離子從離子源穿過(guò)聚焦裝置諸如八極透鏡系統(tǒng)進(jìn)入離子阱。在激發(fā)和穿過(guò)電極射出到檢測(cè)器前，離子捕集發(fā)生在捕集區(qū)中。質(zhì)量分析通過(guò)依次施加電壓來(lái)完成，所述電壓以將遞增m/z的離子射出阱且進(jìn)入檢測(cè)器中的方式增加振蕩的振幅。與四極質(zhì)譜法相比，所有離子都保留在質(zhì)量分析儀的場(chǎng)內(nèi)，除了具有選定的m/z的那些之外。離子阱的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它們具有極高靈敏度，只要小心地限制一次捕集的離子的數(shù)目。通過(guò)改變將離子注射到阱內(nèi)的時(shí)間，可以完成離子數(shù)目的控制。離子阱的質(zhì)量分辨率類(lèi)似于四極質(zhì)量過(guò)濾器的質(zhì)量分辨率，但離子阱的確具有低m/z限制。

飛行時(shí)間質(zhì)譜法利用飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀。對(duì)于這種m/z分析方法，離子首先通過(guò)在電場(chǎng)(由高電壓產(chǎn)生)中加速獲得固定量的動(dòng)能。在加速后，離子進(jìn)入無(wú)場(chǎng)或“漂移”區(qū)域，在該區(qū)域中它以與其m/z成反比的速度行進(jìn)。因此，具有低m/z的離子比具有高m/z的離子更迅速地行進(jìn)。測(cè)量離子經(jīng)過(guò)無(wú)場(chǎng)區(qū)域的長(zhǎng)度所需的時(shí)間，并用于計(jì)算離子的m/z。

這類(lèi)質(zhì)量分析中的一個(gè)考慮是，將待研究的離子集合同時(shí)引入分析儀內(nèi)。例如，這類(lèi)質(zhì)量分析非常適合于電離技術(shù)如MALDI，其以短的充分確定的脈沖產(chǎn)生離子。另一個(gè)考慮是控制由離子產(chǎn)生的速度分布，所述離子在其動(dòng)能的量方面具有變動(dòng)。更長(zhǎng)的飛行管、離子反射器或更高的加速電壓的應(yīng)用可以幫助使速度分布的效應(yīng)最小化。飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀具有高靈敏度水平和比四極或離子阱質(zhì)量分析儀更寬的m/z范圍。另外，用這類(lèi)質(zhì)量分析儀可以快速地獲得數(shù)據(jù)，因?yàn)橘|(zhì)量分析儀的掃描不是必要的。

氣相色譜質(zhì)譜法會(huì)為實(shí)時(shí)檢測(cè)靶標(biāo)提供良好解決方案。系統(tǒng)的氣相色譜(GC)部分將化學(xué)混合物分離成分析物(例如，MDF)的脈沖，并且質(zhì)譜儀(MS)鑒定和定量分析物。

串聯(lián)質(zhì)譜法可以利用上文描述的質(zhì)量分析儀的組合。串聯(lián)質(zhì)譜儀可以使用根據(jù)其m/z來(lái)分離離子的第一質(zhì)量分析儀，以便分離目標(biāo)離子用于進(jìn)一步分析。分離的目標(biāo)離子隨后破碎成碎片離子(稱(chēng)為碰撞活化的解離或碰撞誘導(dǎo)的解離)，并且碎片離子由第二質(zhì)量分析儀進(jìn)行分析。這些類(lèi)型的串聯(lián)質(zhì)譜儀系統(tǒng)被稱(chēng)為在空間上串聯(lián)的系統(tǒng)，因?yàn)閮蓚€(gè)質(zhì)量分析儀通常由碰撞室在空間上分離。串聯(lián)質(zhì)譜儀系統(tǒng)還包括在時(shí)間上串聯(lián)的系統(tǒng)，其中使用一種質(zhì)量分析儀，然而，質(zhì)量分析儀依次用于分離離子、誘導(dǎo)破碎和隨后進(jìn)行質(zhì)量分析。

空間串聯(lián)類(lèi)別中的質(zhì)譜儀具有不止一個(gè)質(zhì)量分析儀。例如，串聯(lián)四極質(zhì)譜儀系統(tǒng)可以具有第一四極質(zhì)量過(guò)濾器，隨后為碰撞室，隨后為第二四極質(zhì)量過(guò)濾器，然后為檢測(cè)器。另一種排列是使用四極質(zhì)量過(guò)濾器用于第一質(zhì)量分析儀，并使用飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀用于第二質(zhì)量分析儀，碰撞室將兩個(gè)質(zhì)量分析儀隔開(kāi)。其它串聯(lián)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括反射-飛行時(shí)間、串聯(lián)扇區(qū)和扇區(qū)-四極質(zhì)譜法。

時(shí)間串聯(lián)類(lèi)別中的質(zhì)譜儀具有在不同時(shí)間執(zhí)行不同功能的一個(gè)質(zhì)量分析儀。例如，離子阱質(zhì)譜儀可以用于捕集所有m/z的離子。應(yīng)用一系列rf掃描功能，其從阱射出所有m/z的離子，除了目標(biāo)離子的m/z之外。在目標(biāo)m/z已被分離后，施加rf脈沖以產(chǎn)生與阱中的氣體分子的碰撞，從而誘導(dǎo)離子的破碎。然后通過(guò)質(zhì)量分析儀測(cè)量碎片離子的m/z值。離子回旋加速器共振儀器，也被稱(chēng)作傅里葉變換質(zhì)譜儀，是在時(shí)間上串聯(lián)的系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例。

通過(guò)控制在實(shí)驗(yàn)的每個(gè)階段中選擇的離子，可以進(jìn)行幾類(lèi)串聯(lián)質(zhì)譜法實(shí)驗(yàn)。不同類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)利用質(zhì)量分析儀的不同操作模式，有時(shí)稱(chēng)為“掃描”。在被稱(chēng)為質(zhì)譜圖掃描的第一個(gè)實(shí)例中，第一質(zhì)量分析儀和碰撞室將用于質(zhì)量分析的所有離子傳遞到第二質(zhì)量分析儀內(nèi)。在被稱(chēng)為產(chǎn)物離子掃描的第二個(gè)實(shí)例中，目標(biāo)離子在第一質(zhì)量分析儀中進(jìn)行質(zhì)量選擇，然后在碰撞室內(nèi)破碎。所形成的離子隨后通過(guò)掃描第二質(zhì)量分析儀進(jìn)行質(zhì)量分析。在稱(chēng)為前體離子掃描的第三個(gè)實(shí)例中，掃描第一質(zhì)量分析儀以依次將分析過(guò)質(zhì)量的離子傳遞到碰撞室內(nèi)用于破碎。第二質(zhì)量分析儀對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物離子進(jìn)行質(zhì)量選擇用于傳遞給檢測(cè)器。因此，檢測(cè)器信號(hào)是所有前體離子的結(jié)果，其可以破碎成共同的產(chǎn)物離子。其它實(shí)驗(yàn)形式包括中性丟失掃描，其中在質(zhì)量掃描中表示出恒定質(zhì)量差異。與多路實(shí)驗(yàn)一樣，當(dāng)在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)量報(bào)道標(biāo)簽的大集合時(shí)，這些不同的串聯(lián)質(zhì)譜法掃描操作的應(yīng)用可以是有利的。

在典型應(yīng)用中，基于循環(huán)閾(Ct)值確定在反應(yīng)期間生成的MDF量，所述Ct值代表產(chǎn)生可檢測(cè)量的核酸所需的循環(huán)的數(shù)目。Ct值的確定是本領(lǐng)域眾所周知的。簡(jiǎn)言之，在PCR期間，隨著形成的擴(kuò)增子的量增加，信號(hào)強(qiáng)度增加至可測(cè)量的水平，并且在反應(yīng)進(jìn)入非對(duì)數(shù)期時(shí)在以后循環(huán)中達(dá)到平臺(tái)。通過(guò)相對(duì)于反應(yīng)的對(duì)數(shù)期中的循環(huán)數(shù)目繪制信號(hào)強(qiáng)度，可以推斷出獲得可測(cè)量信號(hào)時(shí)的具體循環(huán)，且用于計(jì)算在PCR開(kāi)始之前的靶標(biāo)數(shù)量。確定Ct的示例性方法描述在例如Heid等人. Genome Methods 6:986-94, 1996中，參考水解探針。

實(shí)施例

實(shí)施例1

外切核酸酶抗性修飾的評(píng)估

為了評(píng)估可以用于實(shí)踐本發(fā)明的方法的不同外切核酸酶抗性修飾，合成了以下寡核苷酸：T₉JTTTGC(SEQ ID NO: 1)，其中T₉代表5'翼部分，并且J代表修飾。在一個(gè)特定實(shí)驗(yàn)中使用的修飾包括硫代磷酸酯、2'-氨基-尿苷、2'-氟尿苷、2'-O-甲基尿苷、丙烷-二醇間隔物和HEG(全名)間隔物。將1μM各寡核苷酸懸浮于1 X外切核酸酶I緩沖液(New England Biolabs)和2單位的外切核酸酶I(New England Biolabs)中，并在37℃下溫育三十分鐘。反應(yīng)通過(guò)在冰上冷卻而終止，并且在A(yíng)gilent Q-TOF 6530儀器中通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)分析外切核酸酶消化的產(chǎn)物。來(lái)自含有三種修飾(2'-O-甲基尿苷、HEG間隔物和丙二醇間隔物)之一的寡核苷酸的外切核酸酶I消化的產(chǎn)物顯示于圖2 A-C的質(zhì)譜圖上。這些結(jié)果顯示：這些修飾有效阻斷在修飾附接點(diǎn)外的寡核苷酸消化。

實(shí)施例2

使用5'翼探針檢測(cè)EGFR T790M擴(kuò)增

進(jìn)行PCR測(cè)定，以檢測(cè)人上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的T790M突變(核苷酸變化2369 C->T)。以下引物用于擴(kuò)增EGFR基因的區(qū)域，該區(qū)域包括T790M突變的位置：

正向引物： 5`CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGA 3`(SEQ ID NO: 2)

反向引物： 5`CAGTCGAAGGGCATGAGCTGEA 3` (E= 叔丁基芐基-dC, SEQ ID NO: 3)。

為了檢測(cè)，使用以下5'-翼探針,

5`-C<sub>6</sub>ECCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGP-3`(SEQ ID NO: 4)，其中C₆代表非互補(bǔ)的5'-翼部分，E代表1,3-丙二醇，且P代表磷酸酯。在96孔板上制備PCR反應(yīng)混合物，具有以下終濃度：50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，80-100 mM氯化鉀，200 μM各dATP、dCTP和dGTP，400 μM dUTP，200nM各引物，200 nM 5`-翼探針，靶DNA (1,000-100,000個(gè)拷貝的EGFR質(zhì)粒) ，20 nM DNA聚合酶(具有5'核酸酶活性)，0.1 mM EDTA，2.5 mM乙酸鎂。使用Roche LightCycler? 480儀器(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)進(jìn)行擴(kuò)增和分析。使用以下溫度概況：95℃持續(xù)1分鐘(或2個(gè)循環(huán)的95℃(10秒)至62℃(25秒)，隨后從92℃(10秒)至62℃(25-30秒)循環(huán)99次。在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將10單位的外切核酸酶I(New England Biolabs)添加至一些樣品孔，并將溶液在37℃下溫育30分鐘，隨后在冰上冷卻。

使反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)TopTip(Glygen Corp)陰離子交換柱，用于除去去污劑及其它污染物，然后上樣至Agilent Q-TOF 6530儀器上，并通過(guò)LC-MS分析片段。圖3顯示了在通過(guò)外切核酸酶I消化前(A)和后(B)，5'-翼探針的片段的提取離子色譜圖(EIC)。在無(wú)外切核酸酶消化的反應(yīng)中觀(guān)察到兩個(gè)不同的峰，其具有對(duì)應(yīng)于具有序列C₆ECC和C₆ECCT的探針片段的預(yù)期質(zhì)量。然而，在外切核酸酶I消化后，僅觀(guān)察到質(zhì)量對(duì)應(yīng)于探針片段C₆EC的單個(gè)獨(dú)特峰，并且不再觀(guān)察到對(duì)應(yīng)于C₆ECC和C₆ECCT的峰。

實(shí)施例3

使用多種5'-翼探針的多路測(cè)定

關(guān)于如何使用本發(fā)明的方法來(lái)進(jìn)行靶核酸的高通量多路檢測(cè)的詳細(xì)流程圖顯示于圖2上。進(jìn)行PCR測(cè)定以同時(shí)檢測(cè)人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的外顯子19缺失序列、T790M突變(核苷酸變化2369 C->T)、L858R突變和外顯子28內(nèi)部對(duì)照序列。在每種情況下，等位基因特異性引物用于擴(kuò)增EGFR基因的包括指定突變的位置的區(qū)域。為了檢測(cè)，使用以下5'-翼探針：

T790M: 5`-GGTGGAGETTTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGEBT-3` (SEQ ID NO: 5)

外顯子19 Del: 5`-GGGAGGGEGCCCAGAGCCATGGACCCCCACACAGEBT-3` (SEQ ID NO: 6)

L858R: 5`-TTCTTCTTECTTTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTEBT-3` (SEQ ID NO:7)

外顯子28: 5`-ACCACCACCECTTAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAAEBT-3` (SEQ ID NO:8)

對(duì)于各探針序列，E代表1,3-丙二醇，且B代表經(jīng)由丙二醇接頭(E)附接至寡核苷酸探針的生物素。

在96孔板上制備PCR反應(yīng)混合物，具有以下終濃度：50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、80-100 mM氯化鉀、200 μM各dATP、dCTP和dGTP、400 μM dUTP、50 nM各引物、50 nM各5`-翼探針、靶DNA (對(duì)于各突變，10個(gè)拷貝的EGFR質(zhì)粒) 、20 nM DNA聚合酶(具有5'核酸酶活性)、0.1 mM EDTA、2.5 mM乙酸鎂。使用Roche LightCycler? 480儀器(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)進(jìn)行擴(kuò)增和分析。使用以下溫度概況：95℃持續(xù)1分鐘(或2個(gè)循環(huán)的95℃(10秒)至62℃(25秒)，隨后從92℃(10秒)至62℃(25-30秒)循環(huán)55次。在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)混合物與75uL預(yù)先轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中的1x外切核酸酶I緩沖液的固定化的抗生物素蛋白樹(shù)脂(G Biosciences，Part 376A-A，批號(hào)112106)溫育。添加樣品(PCR孔，50 uL)，并將反應(yīng)混合物溫育10分鐘。然后將樣品轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)柱過(guò)濾器，并以500x g (2400 rpm)旋轉(zhuǎn)。棄去樹(shù)脂，并如下所述進(jìn)一步處理流通物。

向指定樣品中添加1uL 20單位/μL外切核酸酶I和3 uL 1u/uL蝦堿性磷酸酶，并將反應(yīng)混合物在37℃下溫育15分鐘。通過(guò)將溶液置于冰上來(lái)終止反應(yīng)。

將反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)TopTip (Glygen Corp)陰離子交換旋轉(zhuǎn)柱用于除去去污劑和其它污染物，然后上樣至自動(dòng)進(jìn)樣器上，并通過(guò)LC-MS在A(yíng)gilent TMQ 6460儀器上以SIM模式分析，在M/z 1518.7、1383.3、1345.8和1320.5處監(jiān)測(cè)。圖5顯示在通過(guò)外切核酸酶I消化后各5'-翼的片段的單離子監(jiān)測(cè)色譜圖(SIM)。在反應(yīng)消化中觀(guān)察到四個(gè)不同的峰，其具有對(duì)應(yīng)于具有以下所示序列的探針片段的預(yù)期質(zhì)量：

外顯子28_ ACCACCACC<丙烷1,3-二醇間隔物>C (M/z 1518.7，第二電荷狀態(tài))

L858R_ TTCTTCTT<丙烷1,3-二醇間隔物>C (M/z 1383.3，第二電荷狀態(tài))

外顯子19 Del_GGGAGGG<丙烷1,3-二醇間隔物>G (M/z 1345.8，第二電荷狀態(tài))

T790M_GGTGGAG<丙烷1,3-二醇間隔物>T (M/z 1320.5，第二電荷狀態(tài))

僅當(dāng)相應(yīng)的靶標(biāo)存在時(shí)才觀(guān)察到這些峰。沒(méi)有靶標(biāo)對(duì)照沒(méi)有顯示峰(數(shù)據(jù)未顯示)。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

Roche Molecular Systems, Inc.

<120> 通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的探針切割鑒定核酸靶標(biāo)

<130> 32318 WO-HS

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的探針

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 外切核酸酶抗性修飾

<400> 1

tttttttttt ttgc 14

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引物

<400> 2

cctccctcca ggaagcctac gtga 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引物

<220>

<221> 修飾的堿基

<222> (21)..(21)

<223> 叔丁基芐基-dC

<400> 3

cagtcgaagg gcatgagctg ca 22

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的探針

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(7)

<223> 1,3-丙二醇

<400> 4

cccccccctg cacggtggag gtgaggcag 29

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的探針T790M

<220>

<221> misc

<222> (7)..(8)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (30)..(31)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (30)..(31)

<223> 生物素

<400> 5

ggtggagttt gcacggtgga ggtgaggcag t 31

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的探針外顯子19 Del

<220>

<221> misc

<222> (7)..(8)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (33)..(34)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (33)..(34)

<223> 生物素

<400> 6

gggaggggcc cagagccatg gacccccaca cagt 34

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的探針 L858R

<220>

<221> misc

<222> (8)..(9)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (36)..(37)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (36)..(37)

<223> 生物素

<400> 7

ttcttcttct ttactggtga aaacaccgca gcatgtt 37

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的探針外顯子28

<220>

<221> misc

<222> (9)..(10)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (37)..(38)

<223> 1,3-丙二醇

<220>

<221> misc

<222> (37)..(38)

<223> 生物素

<400> 8

accaccaccc ttaaaggccc gctggctctg tgcagaat 38