一種銀耳功能性多糖的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銀耳功能性多糖的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明以市售銀耳為原料，所述制備方法包括步驟：混合、水提、堿提、透析、濃縮、沉淀、潤洗和干燥。本方法最大程度地提高了銀耳多糖的得率，而根據(jù)本方法制備而得的銀耳多糖能夠保持較高的抗氧化活性，可以應(yīng)用于抗氧化食品和藥物中。
【專利說明】-種銀耳功能性多糖的制備及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種功能性多糖的制備及應(yīng)用，尤其涉及一 種以銀耳為原料的功能性多糖的制備及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 銀耳是一種經(jīng)濟(jì)價值高，營養(yǎng)豐富的藥食兩用菌，具有滋補(bǔ)生津、潤肺養(yǎng)胃的功 效。研究表明，銀耳中的多糖具有廣泛的生理活性，能提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、 降血糖和降血脂等。另外，作為一種天然藥食兩用菌，它對人體基本上沒有負(fù)作用。所以， 開發(fā)銀耳的生物活性，并應(yīng)用于保健和藥品行業(yè)，有著廣闊的需求市場。
[0003] 近年來有很多對銀耳多糖的提取方法的研究報道。利用熱水浸提法提取銀 耳多糖，通過單因素和正交試驗考察了不同提取條件對銀耳多糖提取率的影響，得出 銀耳多糖的最佳提取工藝條件（周帥飛等，銀耳多糖的提取工藝研究，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013, 41 (27) : 11148-11149)。利用微波輔助萃取法，分析了微波功率、加熱溫度、保持時間 對銀耳多糖提取率的影響，得到微波輔助提取銀耳多糖的最佳工藝條件（吳瓊等，微波輔 助萃取銀耳多糖的研究，食品科技，2006, 9:109-111)。通過比較水浸提法、堿浸提法和酶 法對銀耳多糖的提取率，研究得出利用果膠酶浸提能夠得到得率較高的銀耳多糖（崔蕊靜 等，銀耳多糖的提取及其在飲料中的應(yīng)用，中國食用菌，2003, 23 (2) : 39-41)。采用熱水浸 提、乙醇沉淀和Sevag法得到銀耳多糖，并對銀耳多糖的抗氧化活性進(jìn)行了評價（顏軍等， 銀耳多糖的提取及其清除自由基作用，成都大學(xué)學(xué)報，2006, 25 (1) : 35-38)。多糖的提取或 制備方法影響其抗氧化活性（王艷麗等，超聲參數(shù)對白術(shù)多糖抗氧化活性的影響，生物加 工過程[J]，2012, 10(1) :7-12 ;張麗霞等，不同提取方法對樺褐孔菌多糖抗氧化活性的影 響，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)[J]，2012, 40 (10) : 5870-5872)。
[0004] 因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能提高產(chǎn)率和抗氧化活性的銀耳多糖制 備方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何在制備銀耳多糖 的過程中，既提高多糖的得率和又保持多糖的抗氧化活性。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0007] 1)混合：將銀耳除雜洗凈，加入蒸餾水，用打磨機(jī)高速打碎，得到混合液；
[0008] 2)水提：在加熱條件下，對步驟1)中的混合液進(jìn)行磁力攪拌，一段時間后將混合 液用濾布過濾，得到的濾液即為水提液，將濾渣取出進(jìn)行堿提；
[0009] 3)堿提：在步驟2)的濾渣中加入NaOH溶液，在加熱條件下進(jìn)行磁力攪拌，一段時 間后用濾布過濾，得到的濾液即為堿提液；
[0010] 4)透析：向步驟3)的堿提液中加入鹽酸，調(diào)溶液pH值至7,然后用透析袋透析；
[0011] 5)濃縮：合并步驟2)中的水提液和步驟4)中透析后的堿提液，加熱濃縮，得到濃 縮液；
[0012] 6)沉淀：在步驟5)的濃縮液中加入乙醇，靜置過夜，以除去蛋白質(zhì)；
[0013] 7)潤洗：將步驟6)中靜置過夜后得到的濃縮液離心，去除上層清液，用低沸點有 機(jī)溶劑潤洗沉淀；
[0014] 8)干燥：將步驟7)潤洗后的沉淀吹干，得到銀耳功能性多糖。
[0015] 優(yōu)選地，步驟1)中的銀耳為市售銀耳，按重量計其含水量為5% ;加入蒸餾水的重 量為銀耳重量的20-40倍；所用打磨機(jī)為家用型或?qū)嶒炇矣眯汀?br> [0016] 優(yōu)選地，步驟2)和步驟3)中的加熱溫度為80-KKTC，攪拌時間為2-3小時；所用 的濾布為200目或以上。
[0017] 優(yōu)選地，步驟3)中加入NaOH溶液的濃度為0. 5-lmol/L，加入的量為濾渣重量的 20-40 倍。
[0018] 優(yōu)選地，步驟4)中加入的鹽酸是濃鹽酸稀釋后的稀鹽酸溶液，其較佳的濃度為 6mol/L ;透析過程中所使用的透析袋規(guī)格為3500Da的截留分子量，透析時間為24小時。
[0019] 優(yōu)選地，步驟5)的濃縮過程在可調(diào)溫度的恒溫加熱裝置上進(jìn)行，加熱溫度為 80-100°C ;最終得到的濃縮液體積為濃縮前體積的1/20。
[0020] 優(yōu)選地，步驟6)中加入乙醇的量為使最終混合后的溶液中乙醇的體積百分比濃 度大于80%。
[0021] 優(yōu)選地，步驟7)中離心的轉(zhuǎn)速為4000rpm ;潤洗所用的低沸點有機(jī)溶劑為丙酮、乙 醇和乙醚中的一種或多種。
[0022] 此外，本發(fā)明還提供了用上述方法制備而得的銀耳功能性多糖。本發(fā)明的銀耳功 能性多糖可應(yīng)用于抗氧化食品和藥品中。
[0023] 本發(fā)明采用了以上技術(shù)方案，具有如下的優(yōu)點和有益效果：
[0024] 1、本發(fā)明提供了一種銀耳功能性多糖的制備方法，相較于現(xiàn)有的常規(guī)制備方法， 所得的多糖具有更高的得率；
[0025] 2、本發(fā)明所得的銀耳多糖，相較于現(xiàn)有的常規(guī)制備方法，具有更高的抗氧化活性。
[0026] 以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體步驟及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是本發(fā)明的兩個較佳實施例與對比例獲得的多糖的得率對比圖；
[0028] 圖2是本發(fā)明的兩個較佳實施例與對比例獲得的多糖的ORAC抗氧化活性對比圖， 其中TE為trolox當(dāng)量；
[0029] 圖3是本發(fā)明的兩個較佳實施例與對比例獲得的多糖的CAA抗氧化活性對比圖。

【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0031] 實施例1
[0032] 1)混合：將市售銀耳除雜洗凈，加入20倍重量蒸餾水，用打磨機(jī)高速打碎，得到混 合液；
[0033] 2)水提：在加熱溫度為KKTC條件下，對步驟1)中混合液進(jìn)行磁力攪拌，水提2小 時，再將混合液用濾布過濾，得到濾液即為水提液，將濾渣取出進(jìn)行堿提；
[0034] 3)堿提：在步驟2)的濾渣中加入20倍重量的NaOH溶液（0. 5mol/L)，在加熱溫度 為KKTC條件下進(jìn)行磁力攪拌，堿提2小時后用濾布過濾，得到濾液即為堿提液；
[0035] 4)透析：向步驟3)的堿提液中加入鹽酸（6mol/L)，調(diào)節(jié)溶液pH值至7,然后透析 24小時；
[0036] 5)濃縮：合并步驟2)中的水提液和步驟4)中透析后的堿提液，在加熱溫度為 80°C條件下濃縮至原來體積的1/20,得到濃縮液；
[0037] 6)沉淀：在步驟5)的濃縮液中加入乙醇，使得混合均勻后乙醇最終的體積百分比 濃度大于80%，靜置過夜；
[0038] 7)潤洗：將步驟6)中靜置過夜的濃縮液在4000rpm下離心后去除上層清液，相繼 用丙酮和乙醚潤洗沉淀；
[0039] 8)干燥：將步驟7)潤洗后的沉淀吹干、稱重，并進(jìn)行抗氧化活性評價。
[0040] 實施例2
[0041] 1)混合：將市售銀耳除雜洗凈，加入40倍重量的蒸餾水，用打磨機(jī)高速打碎，得到 混合液；
[0042] 2)水提：在加熱溫度為80°C條件下，對步驟1)中混合液進(jìn)行磁力攪拌，水提3小 時，再將混合液用濾布過濾，得到濾液即為水提液，將濾渣取出進(jìn)行堿提；
[0043] 3)堿提：在步驟2)的濾渣中加入40倍重量的NaOH溶液（lmol/L)，在加熱溫度為 80°C的條件下進(jìn)行磁力攪拌，堿提3小時后用濾布過濾，得到濾液即為堿提液；
[0044] 4)透析：向步驟3)的堿提液中加入鹽酸（6mol/L)，調(diào)節(jié)溶液pH值至7,然后透析 24小時；
[0045] 5)濃縮：合并步驟2)中的水提液和步驟4)中透析后的堿提液，在加熱溫度為 KKTC條件下濃縮至原來體積的1/20,得到濃縮液；
[0046] 6)沉淀：在步驟5)的濃縮液中加入乙醇，使得混合均勻后乙醇最終的體積百分比 濃度大于80%，靜置過夜；
[0047] 7)潤洗：將步驟6)中靜置過夜的濃縮液在4000rpm下離心后去除上層清液，用無 水乙醇潤洗沉淀兩次；
[0048] 8)干燥：將步驟7)潤洗后的沉淀吹干、稱重，并進(jìn)行抗氧化活性評價。
[0049] 對比例
[0050] 1)混合：將市售銀耳除雜洗凈，加入20倍重量蒸餾水，用打磨機(jī)高速打碎，得到混 合液；
[0051] 2)第一次水提：在加熱溫度為KKTC的條件下，對步驟1)中的混合液進(jìn)行磁力攪 拌，水提3小時，再將混合液用濾布過濾，將得到的水提液保留，將濾渣進(jìn)一步水提；
[0052] 3)第二次水提：在步驟2)的濾渣中加入20倍重量的蒸餾水，在加熱溫度為100°C 的條件下進(jìn)行磁力攪拌，水提3小時，然后用濾布過濾，將得到的水提液保留；
[0053] 4)濃縮：合并步驟2)和步驟3)中的水提液，在加熱溫度為80°C條件下濃縮至原 來體積的1/20,得到濃縮液；
[0054] 5)沉淀：在步驟4)的濃縮液中加入乙醇，并使乙醇的最終體積百分比濃度大于 80%，靜置過夜；
[0055] 6)潤洗：將步驟5)中的靜置過夜后的濃縮液在4000rpm下離心后去除上層清液， 相繼用丙酮和乙醚潤洗沉淀；
[0056] 7)干燥：將步驟6)潤洗后的沉淀吹干、稱重，并進(jìn)行抗氧化活性評價。
[0057] 評價實駘
[0058] 將實施例1、實施例2和對比例所得銀耳多糖分別進(jìn)行抗氧化ORAC評價。
[0059] 具體評價方法如下：在96孔酶標(biāo)板（黑色）最外周加入300 μ L水，測量孔中依次 加入25 μ L樣品，150 μ L的4xl(T6mmol/L熒光素鈉溶液。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，37°C下預(yù) 熱 30min 后，力口入 25 μ L2, 2' 一Azobis (2_methylp;ropionamidine) dihydrochloride (AAPH) 開始熒光淬滅反應(yīng)。其中空白組以25yL緩沖液代替樣品，對照組以25yL不同濃度的 Trolox溶液代替樣品。樣品平行測定三次。結(jié)果以Trolox含量作為當(dāng)量來表示ORAC值。 酶標(biāo)儀測量條件設(shè)置如下：激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長538nm;加入AAPH后，振幅1mm，震蕩 8S。反應(yīng)開始后,測量循環(huán)次數(shù)為120,循環(huán)周期為lmin。
[0060] 將實施例1、實施例2和對比例所得銀耳多糖分別進(jìn)行細(xì)胞抗氧化（celluar antioxidant activity, CAA)評價。
[0061] 具體評價方法如下：在黑色96孔酶標(biāo)板上將肝臟細(xì)胞L02按照每孔6 X IO4的濃 度鋪板，培養(yǎng)基為100 μ L，培育24h ;移除培養(yǎng)基，用100 μ L PBS洗一次；加入多糖樣品和 2'，7'-二氣突光素二乙酸醋（2'，7'-(1；[(3]11〇1'0(1；[]17(11'0；1^1110代806；[11(1丨306七3七6)為突光探 針，在37°C孵育1小時，然后移去孵育液，IOOyL PBS洗一次，加 IOOyL的600μπι1/1 ΜΡΗ， 立刻放入已在37°C預(yù)熱的酶標(biāo)儀中測量。酶標(biāo)儀測量條件設(shè)置如下：485nm激發(fā)光，538nm 發(fā)射光，反應(yīng)溫度37°C，Imin讀一次，讀90min。其中，空白組是用超純水代替多糖樣品的處 理組。
[0062] 結(jié)果與比較
[0063] 如圖1所示，實施例1和實施例2的多糖得率分別為1. 00%和2. 93% (w/w)，而對 比例為0.77% (w/w)。由此可見，本發(fā)明所提供的銀耳功能性多糖的制備方法可以提高銀 耳多糖的得率。
[0064] 如圖2所示，實施例2制得的多糖ORAC值最高，為11. 9 μ mol TE/mg，即抗氧化 活性最好，其次為實施例1，為1.65 μ mol TE/mg，對比例制得的多糖抗氧化值最小，僅為 0· 12 μ mol TE/mg〇
[0065] 如圖3所示，在正常肝細(xì)胞模型上，實施例1和實施例2制得多糖的熒光值降低百 分率提高到43. 5和53. 7%，而對比例僅為31. 4%，顯示了實施例1和實施例2制得多糖的 清除自由基的活力明顯增強(qiáng)。由此可見，本發(fā)明所提供的銀耳功能性多糖的制備方法可以 明顯提高銀耳多糖的抗氧化活性。
[0066] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無 需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 混合：將銀耳除雜洗凈，加入蒸餾水，用打磨機(jī)高速打碎，得到混合液； 2) 水提：在加熱條件下，對步驟1)中的混合液進(jìn)行磁力攪拌，一段時間后將混合液用 濾布過濾，得到的濾液即為水提液，將濾渣取出進(jìn)行堿提； 3) 堿提：在步驟2)的濾渣中加入NaOH溶液，在加熱條件下進(jìn)行磁力攪拌，一段時間后 用濾布過濾，得到的濾液即為堿提液； 4) 透析：向步驟3)的堿提液中加入鹽酸，調(diào)溶液pH值至7,然后用透析袋透析； 5) 濃縮：合并步驟2)中的水提液和步驟4)中透析后的堿提液，加熱濃縮，得到濃縮 液； 6) 沉淀：在步驟5)的濃縮液中加入乙醇，靜置過夜，以除去蛋白質(zhì)； 7) 潤洗：將步驟6)中靜置過夜后得到的濃縮液離心，去除上層清液，用低沸點有機(jī)溶 劑潤洗沉淀； 8) 干燥：將步驟7)潤洗后的沉淀吹干，得到銀耳功能性多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟1)中的銀耳 按重量計，其含水量為5%，加入蒸餾水的重量為銀耳重量的20-40倍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟2)和步驟3) 中所述濾布為200目或以上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟2)和步驟3) 中的加熱溫度為80-KKTC，攪拌時間為2-3小時；步驟5)中加熱溫度為80-KKTC。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟3)中加入的 所述NaOH溶液的濃度為0. 5-lmol/L，加入的重量為濾渣重量的20-40倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟4)中所述透 析使用的透析袋規(guī)格為3500Da的截留分子量，透析時間為24小時。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟6)中所述加 入乙醇的量為使混合后的溶液中乙醇的最終體積百分比濃度大于80%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀耳功能性多糖的制備方法，其特征在于，步驟7)中所述離 心的轉(zhuǎn)速為4000rpm。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項所述的制備方法制得的銀耳功能性多糖。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的銀耳功能性多糖在抗氧化食品及藥品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C08B37/00GK104211829SQ201410475033
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】敬璞, 宋立華, 趙淑娟, 陸漫漫, 蔡湛 申請人:上海交通大學(xué)