本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，具體涉及利用雙鞭甲藻菌株發(fā)酵生產(chǎn)含二十二碳六稀酸的混合油脂。

背景技術(shù)：
二十二碳六烯酸(cis-4,7,10，13,16，19-docosahexaenoicacid，DHA)是一種極其重要的ω-3系列的長鏈多不飽和脂肪酸，具有促進嬰幼兒大腦發(fā)育、保護視力、預(yù)防和治療心血管疾病和提高機體免疫能力等重要生理功能。目前DHA的商業(yè)來源主要是魚油和微藻。國內(nèi)魚油的年產(chǎn)量約4萬噸，經(jīng)精煉提純DHA含量達30％的魚油，其價格在4-5萬元/噸，進口魚油為8萬元/噸，而DHA微藻油價格為15-20萬美元/噸。近幾年由于國內(nèi)魚油質(zhì)量不能滿足保健品原料的需求以及魚油資源大量衰減，國內(nèi)魚油的進口量明顯上升，進而導(dǎo)致市售價格也相繼走高，因此尋找微生物來源的DHA就顯得日益迫切。而微藻DHA的市場份額在逐年快速上升，有取代魚油DHA的趨勢。但是由于DHA生產(chǎn)技術(shù)相對落后，規(guī)模小，因此提高DHA生產(chǎn)技術(shù)及品質(zhì)，進軍DHA微藻市場前景廣闊。公開號為CN1986822A的專利公開了一種用寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其所公開的產(chǎn)量為海藻細胞中二十二碳六烯酸含量在30％-50％，獲得的海藻細胞為20-40g/L，油脂含量為20-50％，DHA生產(chǎn)率為3.5g/(L·d)。公開號為CN101538592A的專利公開了一種用寇氏隱甲藻工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其所公開的最高產(chǎn)量為微藻細胞生物量51g/L，油脂含量為72％，DHA含量為55.3％，EPA含量為0.2％，DHA生產(chǎn)率為4.6g/(L·d)，這也是目前報道的采用寇氏隱甲藻生產(chǎn)DHA的最高生產(chǎn)水平。雖然其DHA生產(chǎn)率較之前的研究有了較大提高，但對于利用微藻進行工業(yè)化生產(chǎn)二十二碳六烯酸，大大降低其生產(chǎn)成本，提高單位產(chǎn)量，使微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA的方法能夠得到大力推廣和普及使用還是遠遠不夠的。公開號為CN102391955A的專利公開了一種雙鞭甲藻的誘變篩選方法，其采用紫外+LiCl、硫酸二乙酯類對雙鞭甲藻進行復(fù)合誘變，從而獲得性能較優(yōu)良的菌株，但這種誘變的長期遺傳穩(wěn)定性不高，菌株產(chǎn)DHA的產(chǎn)量不穩(wěn)定，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，同時，通過誘變的菌株的基因組可預(yù)測性不高，其產(chǎn)品產(chǎn)量均發(fā)生變化，這對后期的純化提出了更高的技術(shù)要求，不適用于規(guī)?；纳a(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種用雙鞭甲藻(Crypthecodiniumcohnii)為菌種，工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸油脂的方法，該方法能夠低成本、大量生產(chǎn)綠色環(huán)保的高品質(zhì)DHA油脂。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：用雙鞭甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，包括以雙鞭甲藻為菌種，采用包括碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基，通過溶氧調(diào)控策略發(fā)酵制得二十二碳六烯酸油脂(DHA)，具體如下：1)將雙鞭甲藻菌株接入裝有350mL培養(yǎng)基的2L搖瓶，在22-32℃的搖床中以180rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)20-30h；2)按照0.4-1％的接種量將搖瓶的菌種接入裝有1m3培養(yǎng)基的2m3一級種子發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度22-32℃，通氣量1-2vvm，壓力0.02-0.05MPa，培養(yǎng)25-35h；3)按照1-3％的接種量將一級種子罐的菌種接入裝有8m3培養(yǎng)基的15m3二級種子發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度22-32℃，通氣量1-2vvm，壓力0.02-0.05MPa，培養(yǎng)15-25h；4)按照1-3％的接種量將二級種子罐的菌種接入裝有40m3培養(yǎng)基的100m3發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度22-32℃，壓力0.02-0.05MPa，通氣量1-2vvm，通過溶氧調(diào)控策略將DO控制在50％，整個發(fā)酵過程流加40％的氨水控制pH在6.0-7.0，過程中葡萄糖濃度維持在1-5g/L，流加碳源發(fā)酵培養(yǎng)60-80h，終止發(fā)酵，放罐，測定發(fā)酵液中細胞干重達70-110g/L，油脂含量達40-60％，DHA占總油脂含量為45-55％，DHA生產(chǎn)率最高可達8.7g/(L·d)。所述的菌種為雙鞭甲藻為(Crypthecodiniumcohnii，ATCC30556)斜面保藏菌株。發(fā)酵培養(yǎng)基碳源中添加20％處理后的甘油。發(fā)酵過程中溶氧轉(zhuǎn)速耦聯(lián)控制DO在50％。一級種子、二級種子、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源包括葡萄糖、玉米漿粉、糖蜜、甘油和葡萄糖漿中的一種或多種，添加量為60g/L；氮源包括硫酸銨、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸鈉、谷氨酸鈉中的一種或多種，添加量為5g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的微量元素包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、賴氨酸、維生素B1、微生物B6、微生物B12中的一種或多種，當(dāng)為其中一種時，添加量為0.001-0.01％；當(dāng)為其中多種時，任意一種組分的添加量為0.001-0.005％。一級種子、二級種子、發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的無機鹽包括硫酸鎂1.5g/L、氯化鉀2g/L、氯化鈉13g/L、氯化鈣1.0g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L。。本發(fā)明應(yīng)用溶氧調(diào)控策略來控制雙鞭甲藻發(fā)酵從而生產(chǎn)DHA，所得DHA油脂產(chǎn)量高、純度高，本發(fā)明的工藝技術(shù)指標(biāo)均明顯優(yōu)于現(xiàn)有的工藝技術(shù)指標(biāo)，有利于DHA的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時，甘油為原料的添加也降低了DHA的生產(chǎn)成本，大大提高了DHA發(fā)酵生產(chǎn)的市場競爭力。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作詳細說明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1.30L發(fā)酵罐雙鞭甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA將新鮮的雙鞭甲藻斜面菌種接入裝有350mL培養(yǎng)基的2L搖瓶中培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，制備DHA種子液，菌體密度為8g/L。在30L發(fā)酵罐中，按3％的接種量將DHA種子液接入已消毒滅菌的培養(yǎng)基中，接后體積20L，罐壓0.02MPa，初始攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，通氣量1vvm，通過溶氧轉(zhuǎn)速耦聯(lián)將DO控制在50％左右，整個發(fā)酵過程流加40％的氨水控制pH在6.8左右，過程中流加碳源控制葡萄糖濃度在1-5g/L，培養(yǎng)68h后終止發(fā)酵，放罐。測定發(fā)酵液中細胞干重達84g/L，油脂含量達50％，DHA含量為46％，DHA生產(chǎn)率高達6.8g/(L·d)。以下表1為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表130L發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成實施例2.100L發(fā)酵罐雙鞭甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA將新鮮的雙鞭甲藻斜面菌種接入裝有350mL培養(yǎng)基的2L搖瓶中培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，制備DHA種子液，菌體密度為7g/L。在100L發(fā)酵罐中，按3％的接種量將DHA種子液接入已消毒滅菌的培養(yǎng)基中，接后體積50L，罐壓0.02MPa，初始攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，通氣量1vvm，通過溶氧轉(zhuǎn)速耦聯(lián)將DO控制在50％左右，整個發(fā)酵過程流加40％的氨水控制pH在6.8左右，過程中流加碳源控制葡萄糖濃度在1-5g/L，發(fā)酵培養(yǎng)72h后終止發(fā)酵，放罐。測定發(fā)酵液中細胞干重達91g/L，油脂含量達50％，DHA占總油脂含量為49％，DHA生產(chǎn)率高達7.4g/(L·d)。以下表2為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表2100L發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成實施例3.100m3發(fā)酵罐雙鞭甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA對雙鞭甲藻進行工業(yè)化擴大培養(yǎng)，過程如下：將新鮮的雙鞭甲藻斜面菌種接入裝有350mL培養(yǎng)基的2L搖瓶中，28℃搖床培養(yǎng)48h，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，制備DHA種子液，菌體密度為9g/L。在一級種子罐中，按照0.4％的接種量將搖瓶中的DHA種子液接入已消毒滅菌的一級種子罐培養(yǎng)基中，通氣量1vvm，壓力0.02MPa，攪拌轉(zhuǎn)速20Hz，培養(yǎng)30h，測定發(fā)酵液中細胞干重為5g/L。在二級種子罐中，按照3％的接種量將一級種子接入已消毒滅菌的二級種子罐培養(yǎng)基中，壓力0.02MPa，攪拌轉(zhuǎn)速25Hz，通氣量1vvm，培養(yǎng)25h，測定發(fā)酵液中細胞干重為10g/L。在發(fā)酵罐中按照3％的接種量將二級種子接入已消毒滅菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，壓力0.03MPa，攪拌轉(zhuǎn)速30Hz，通氣量1vvm，通過溶氧轉(zhuǎn)速耦聯(lián)將DO控制在50％左右，整個發(fā)酵過程流加40％的氨水控制pH在6.8左右，過程中流加碳源控制葡萄糖濃度在1-5g/L，發(fā)酵培養(yǎng)72h后終止發(fā)酵，放罐。測定發(fā)酵液中細胞干重達97g/L，油脂含量達54％，DHA占總油脂含量為50％，EPA含量低至0.1％，DHA生產(chǎn)率高達8.7g/(L·d)。以下表3為發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成氣相分析結(jié)果：表3100m3發(fā)酵罐發(fā)酵后所得混合油脂脂肪酸組成以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。