專利名稱：裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及胞外多糖，尤其是涉及一種裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法。
背景技術(shù)：
海洋占地球表面積的70.78%,生物種類約占地球生物總量的87%。海洋生物生活在一個具有一定水壓、較高鹽度、較小溫差、有限溶氧和有限光照的海水化緩沖體系中。由于特殊的生活環(huán)境，海洋生物合成多糖的過程與陸地生物不同，并能產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎作用特殊的活性物質(zhì)，使其具有顯著的藥理穩(wěn)定性和保效性，對防止癌癥、降低血糖血脂具有獨特效應，因此海洋微生物已成為開發(fā)新型生物產(chǎn)品的主要方向之一。(參見文獻:徐靜，謝蓉桃，林強，馮玉紅，黃志明，陳太學.海洋生物多糖的種類及其生物活性[J].中國熱帶學，2006:1277-1278)。微藻胞外多糖是指微藻在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離的水溶性多糖或多糖復合物，具有多樣性、復雜性等特點，作為一種海洋生物代謝產(chǎn)物，具有理化性質(zhì)獨特，生物活性優(yōu)良而備受人們的關(guān)注。(參見文獻:張姍姍，王長云，魏曉蕾，李亮.海洋微生物胞外多糖結(jié)構(gòu)與生物活性研究進展[J].微生物學通報，2007，34 (I): 153-156)。裂殖壺藻由于其生長繁殖快，耐機械攪拌，培養(yǎng)條件相對要求較低，產(chǎn)生的脂質(zhì)成分簡單且易于分離，因此成為用于生產(chǎn)DHA最理想的微生物之一。(參見文獻:周茂洪，周林.1株裂殖壺菌(Schizochytrium.spi)的分離鑒定[J].微生物學通報,2006，33 (4):48-51)。目前就其生產(chǎn)，分離純化其胞內(nèi)產(chǎn)物DHA研究較多，但其胞外產(chǎn)物同時也含有豐富的多糖，因此也可作為生產(chǎn)微藻多糖的主要原料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法。本發(fā)明包括以下步驟:I)以裂殖壺菌發(fā)酵液為原料，用乙醇沉淀發(fā)酵液中多糖，有機溶劑清洗不溶物，再用去離子水溶解不溶物，三氯乙酸法去除蛋白，再次使用乙醇沉淀得多糖粗品，使用去離子水為溶媒，配制成待分級溶液；2)將步驟I)配制成的待分級溶液經(jīng)快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換樹脂梯度洗脫分管收集，硫酸苯酚法測定各管多糖濃度，繪制洗脫曲線，將收集的各個部分合并，濃縮，經(jīng)透析膜出去小分子雜質(zhì)，凍干后即得分離純化的裂殖壺藻胞外多糖。在步驟I)中，所述乙醇的濃度可為30% 80%，用乙醇沉淀的時間可為I 24h，沉淀的pH可為5 10 ;所述有機溶劑可采用無水乙醇或無水甲醇等；所述清洗的方法可采用交替超聲清洗2 3次；所述去離子水溶解不溶物的條件可為:水浴加熱溫度為50 100°C，加熱時間為I 5h，調(diào)節(jié)溶液pH為5 10 ;所述三氯乙酸的濃度可為0.5% 5% ；所述待分級溶液的最終濃度可為I 5mg/mL。在步驟2)中，所述快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換樹脂的層析條件可為:層析柱規(guī)格:柱長度300 500mm,柱直徑10 20mm ;上樣濃度:1 5mg/mL ;上樣量:1 5mL ;所述梯度洗脫的流速可為:1 5mL/min,5 IOmin收集一管；洗脫梯度為:去離子水；濃度為0.02 0.1M氯化鈉溶液；濃度為0.2 0.3M氯化鈉溶液；濃度為0.4 IM氯化鈉溶液，分別洗脫得4個部分多糖樣品，依次命名為SP1、SP2、SP3、SP4 ;透析膜截留分子量為3000 8000Da，透析 24 48h。分離純化的裂殖壺藻胞外多糖可進行檢測，可使用超純水為溶媒，配制成多糖溶液，并經(jīng)微孔濾膜去除固體小顆粒雜質(zhì)，經(jīng)高效凝膠滲透色譜分析樣品純度以及分子量。所述配制成的多糖溶液的濃度可為I 5mg/mL ;高效液相凝膠滲透色譜條件可為:色譜柱:TSK-G4000PW凝膠色譜柱；檢測器:示差檢測器；柱溫:25 30°C ;流動相:
0.01% 0.1%疊氮化鈉溶液(溶劑為超純水)流速:(λ 5 lmL/min。本發(fā)明以裂殖壺藻發(fā)酵液為原料，經(jīng)過乙醇沉淀，熱水浸提，蛋白去除等步驟分離除微藻胞外多糖樣品，制成濃度為I 5mg/mL的多樣溶液樣品，經(jīng)過快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換層析分級洗脫得到四個部分樣品，再經(jīng)過透析除鹽，凍干得到四種均一性微藻胞外多糖。從海洋微藻裂壺藻(Schizochytrium sp.)發(fā)酵液中提取、分離純化胞外多糖的工藝，并對多糖產(chǎn)品的基本性質(zhì)進行了表征。本發(fā)明操作簡便、高效，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，獲得多糖性質(zhì)專一，生理活性高。


圖1為實施例1中裂殖壺菌胞外多糖階段性梯度洗脫曲線圖。在圖1中，橫坐標為收集洗脫液的管數(shù)，左縱坐 標為洗脫液吸光度(495nm)，右縱坐標為洗脫液的氯化鈉溶液的濃度梯度(mol/mL)。圖2為實施例1中裂殖壺菌胞外多糖線性梯度洗脫曲線圖。在圖2中，橫坐標為收集洗脫液的管數(shù)，左縱坐標為洗脫液吸光度(495nm)，右縱坐標為洗脫液的氯化鈉溶液的濃度梯度(mol/mL)。
具體實施例方式實施例1:快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換層析中線性梯度洗脫和階段性梯度洗脫效果對比制備原料:獲取裂殖壺菌發(fā)酵液，量取5mL發(fā)酵上清液，經(jīng)四倍體積無水乙醇(即80%乙醇)沉淀，分離出不溶物并使用無水乙醇，無水甲醇交替超聲清洗兩次，烘干，得到紅褐色多糖粗品 lOOmg。將多糖粗品溶于5mL去離子水，調(diào)節(jié)溶液pH為8，70°C水浴加熱3h使其充分溶解，硫酸苯酚法測得多糖沉淀效率為2.587mg/mL。向多糖溶液中滴加4%三氯乙酸溶液，直到pH為7，80%乙醇于4°C環(huán)境中沉淀2h，6000r/min離心5min分離出不溶物，烘干得紅褐色固體。所得固體中加入適量去離子水加熱完全溶解樣品，硫酸苯酚法測得多糖純度為38.29%。將所得多糖溶液制得4mg/mL的多糖樣品溶液，儲存至_20°C的環(huán)境中備用?？炝魉倮w維素瓊脂糖凝膠陰離子交換層析分級分離條件:
層析柱規(guī)格:10_X300_上樣濃度:4mg/mL上樣量:3mL洗脫流速:4mL/min,每IOmin收集一管。階段性梯度洗脫:去離子水洗脫20管得SP1部分，濃度分別為0.05M, 0.25M，0.5M氯化鈉溶液各洗脫20管分別得SP2，SP3, SP4三個部分。線性梯度洗脫:去離子水洗脫20管得SP1部分，濃度為O IM氯化鈉溶液線性洗脫100管，洗脫梯度為Ct=t/100M，分別得到SP2，SP3, SP4三個部分。柱洗脫樣品收集完成后，用硫酸-苯酚法測定收集的各樣品中的糖含量。將測得結(jié)果以管數(shù)為X軸，各管溶液硫酸-苯酚法測得吸光度為I軸，作出洗脫曲線如圖1和2所示。

對比圖1和2，階段性梯度洗脫洗脫曲線明顯優(yōu)于線性梯度洗脫，所以就階段性梯度洗脫得到的四個部分的樣品進行產(chǎn)品品質(zhì)分析。將階段性梯度洗脫得到各個部分多糖使用截留分子量為3000Da的透析袋透析24h，凍干，測定各部分純度，如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以裂殖壺菌發(fā)酵液為原料，用乙醇沉淀發(fā)酵液中多糖，有機溶劑清洗不溶物，再用去離子水溶解不溶物，三氯乙酸法去除蛋白，再次使用乙醇沉淀得多糖粗品，使用去離子水為溶媒，配制成待分級溶液； 2)將步驟I)配制成的待分級溶液經(jīng)快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換樹脂梯度洗脫分管收集，硫酸苯酚法測定各管多糖濃度，繪制洗脫曲線，將收集的各個部分合并，濃縮，經(jīng)透析膜出去小分子雜質(zhì)，凍干后即得分離純化的裂殖壺藻胞外多糖。
2.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟I)中，所述乙醇的濃度為30% 80%，用乙醇沉淀的時間可為I 24h，沉淀的pH可為5 10。
3.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟I)中，所述有機溶劑采用無水乙醇或無水甲醇。
4.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟I)中，所述清洗的方法采用交替超聲清洗2 3次。
5.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟I)中，所述去離子水溶解不溶物的條件為:水浴加熱溫度為50 100°C，加熱時間為I 5h，調(diào)節(jié)溶液pH為5 10。
6.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟I)中，所述三氯乙酸的濃度為0.5% 5%。
7.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟I)中，所述待分級溶液的最終濃 度為I 5mg/mL。
8.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟2)中，所述快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換樹脂的層析條件為:層析柱規(guī)格:柱長度300 500mm,柱直徑10 20_ ;上樣濃度:1 5mg/mL ;上樣量:1 5mL。
9.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟2)中，所述梯度洗脫的流速為:1 5mL/min，5 IOmin收集一管；洗脫梯度為:去離子水；濃度為0.02 0.1M氯化鈉溶液；濃度為0.2 0.3M氯化鈉溶液；濃度為0.4 IM氯化鈉溶液，分別洗脫得4個部分多糖樣品，依次命名為SPp SP2, SP3> SP40
10.如權(quán)利要求1所述裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，其特征在于在步驟2)中，所述透析膜的截留分子量為3000 8000Da，透析24 48h。
全文摘要
裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法，涉及胞外多糖。包括以下步驟1)以裂殖壺菌發(fā)酵液為原料，用乙醇沉淀發(fā)酵液中多糖，有機溶劑清洗不溶物，再用去離子水溶解不溶物，三氯乙酸法去除蛋白，再次使用乙醇沉淀得多糖粗品，使用去離子水為溶媒，配制成待分級溶液；2)將步驟1)配制成的待分級溶液經(jīng)快流速纖維素瓊脂糖凝膠陰離子交換樹脂梯度洗脫分管收集，硫酸苯酚法測定各管多糖濃度，繪制洗脫曲線，將收集的各個部分合并，濃縮，經(jīng)透析膜出去小分子雜質(zhì)，凍干后即得分離純化的裂殖壺藻胞外多糖。操作簡便﹑高效，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，獲得多糖性質(zhì)專一，生理活性高。
文檔編號C08B37/00GK103204951SQ20131016732
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者盧英華, 王麗娟, 沈亮, 海璇雋, 吳意珣, 凌雪萍, 姚傳義, 敬科舉 申請人:廈門大學