用于制備糖-蛋白質(zhì)糖綴合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于還原胺化多糖的還原端處的羰基的方法，其中所述還原胺化在pH4至5之間進(jìn)行。本發(fā)明還提供了用于制備多糖和載體分子的綴合物的方法，其包括步驟：(a)使多糖與連接體偶聯(lián)，以形成多糖-連接體化合物，其中連接體的游離端是酯基；和(b)使酯基與載體分子中的伯氨基反應(yīng)，以形成多糖-連接體-載體分子綴合物，其中所述連接體通過(guò)酰胺鍵與載體分子偶聯(lián)。本發(fā)明還提供了減少未反應(yīng)的連接體污染多糖-連接體化合物的方法，其包括在小于pH5的含水條件下沉淀未反應(yīng)的連接體的步驟。本發(fā)明還提供了通過(guò)這些方法獲得的或者可獲得的多糖-連接體-載體分子綴合物和中間化合物。
【專利說(shuō)明】用于制備糖-蛋白質(zhì)糖綴合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及綴合的糖領(lǐng)域，特別是來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結(jié)構(gòu)域，以及用于形成復(fù)合糖的載體?？蓪?fù)合糖用于免疫接種。
[0002]發(fā)明背景
[0003]已經(jīng)將來(lái)自細(xì)菌的糖用于疫苗多年。然后，由于糖是非T細(xì)胞依賴性抗原，所以它們免疫原性差。與載體綴合可以將非T細(xì)胞依賴性抗原轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴性抗原，從而增強(qiáng)記憶應(yīng)答，并允許產(chǎn)生保護(hù)性免疫。因此，最有效的糖疫苗是基于復(fù)合糖的，并且原型結(jié)合疫苗(prototype conjugatevaccine)是針對(duì)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae) b型(‘Hib’ )的[例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)64的第14章]。
[0004]革蘭氏陰性菌由含脂多糖的外膜圍繞。脂多糖是作為內(nèi)毒素并在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答的一組分子。每一脂多糖包含三個(gè)部分:0-抗原(也稱為O-特異多糖或O-多糖)、核心結(jié)構(gòu)域和脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)域。針對(duì)來(lái)自特定革蘭氏陰性菌的O-抗原的抗體可以賦予針對(duì)該細(xì)菌感染的保護(hù)。因此，已經(jīng)設(shè)想了含有與載體蛋白綴合的O-抗原的疫苗。例如，基于O-抗原的結(jié)合疫苗已經(jīng)建議用于多種沙門氏菌(Salmonellae)(例如，參考文獻(xiàn)I和2中的腸沙門氏菌(Salmonella enterica)中的血清型鼠傷寒桿菌(Salmonella Typhimurium)和甲型副傷寒沙門 氏菌(SalmonellaParatyphi A));志賀氏桿菌屬(Shigella)[參考文獻(xiàn)
3、4、5、6、7、8和9];以及大腸桿菌(Escherichia coli)[參考文獻(xiàn)10和11]。在這些疫苗中，O-抗原與來(lái)自全長(zhǎng)脂多糖的核心結(jié)構(gòu)域連接(即綴合的多糖是沒(méi)有其脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)域的脂多糖)。多糖通過(guò)其核心結(jié)構(gòu)域與載體綴合。該核心結(jié)構(gòu)域自身可以誘導(dǎo)保護(hù)性抗體，因此設(shè)想結(jié)合疫苗含有不與O-抗原連接的核心結(jié)構(gòu)域[參考文獻(xiàn)12]。
[0005]已知將含核心結(jié)構(gòu)域的多糖與載體蛋白綴合的多種方法。一些方法涉及通過(guò)連接體綴合之前，多糖鏈的隨機(jī)活化(例如使用溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨吡啶四氟硼酸酯(CDAP))(參見(jiàn)例如，參考文獻(xiàn)I和2)。其他方法是更有選擇性的，涉及該鏈的特異性殘基(例如核心結(jié)構(gòu)域的2-酮-3-脫氧辛酸(KDO)端)。例如，參考文獻(xiàn)13的方法涉及KDO端中的羰基與己二酸二酰肼(ADH)連接體之間的還原胺化。涉及還原胺化的反應(yīng)通常非常慢，例如參考文獻(xiàn)13中需要7天的步驟。另一選擇性方法描述于參考文獻(xiàn)9中，這次涉及通過(guò)KDO中的羧基，使用1-乙基-3 - (3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDAC)和ADH的偶聯(lián)。在這些非選擇性和選擇性方法中，通常使用EDAC進(jìn)行與載體的后續(xù)反應(yīng)，EDAC活化蛋白質(zhì)中的用于與連接體反應(yīng)的羧基。該EDAC活化可以引起KDO亞基中羧基的活化，導(dǎo)致不想要的副反應(yīng)。EDAC活化還可以引起載體蛋白的交聯(lián)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中活化的羧基可以與蛋白質(zhì)中的而非連接體中的伯胺基反應(yīng)。
[0006]因此，仍存在制備綴合物，特別是來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結(jié)構(gòu)域的其他以及更好的方法的需求。
[0007]發(fā)明公開(kāi)
[0008]本發(fā)明基于綴合方法，其可以用于取代現(xiàn)有技術(shù)的綴合方法。這些方法可以比現(xiàn)有技術(shù)方法，特別是涉及還原胺化的那些方法更快地施行。該方法還不需要使用EDAC，這避免了不想要的副反應(yīng)。在研發(fā)這些方法期間，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了不需要使用毒性化合物來(lái)純化中間化合物的方法。因此，本方法可以更安全地實(shí)施。與現(xiàn)有技術(shù)的綴合物相比，得到的綴合物具有不同的，優(yōu)選地改進(jìn)的免疫學(xué)特性。
[0009]因此，本發(fā)明提供了用于將多糖與載體蛋白綴合的備選或改進(jìn)方法，以及通過(guò)這些方法獲得或者可獲得的綴合物。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的中間化合物，以及用于制備這些中間化合物的方法。
[0010]本發(fā)明的第一方面
[0011]在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于制備多糖和載體分子的綴合物的方法，其包括以下步驟:(a)使多糖與連接體偶聯(lián)，以形成多糖-連接體中間產(chǎn)物，其中連接體的游離端是酯基；和(b)使酯基與載體分子中的伯胺基反應(yīng)，以形成多糖-連接體-載體分子綴合物，其中連接體通過(guò)酰胺鍵與載體分子偶聯(lián)。不同于參考文獻(xiàn)1、2和13中所使用的綴合方法，本發(fā)明不需要使用EDAC活化載體分子，從而避免了不想要的副反應(yīng)。本發(fā)明還提供了該方法的各個(gè)步驟(a)和(b);通過(guò)該方法獲得的或者可獲得的綴合物；以及通過(guò)該方法的步驟(a)獲得的或者可獲得的多糖-連接體中間產(chǎn)物。[0012]本發(fā)明第一方面的步驟(a)
[0013]在本發(fā)明第一方面的步驟(a)中，將多糖與連接體偶聯(lián)，以形成多糖-連接體中間產(chǎn)物，其中連接體的游離端是酯基。因此，連接體是這樣的連接體，其中至少一個(gè)末端是酯基。如下所述，連接體的其他末端是選擇性的，以使其可以與多糖反應(yīng)以形成多糖-連接體中間產(chǎn)物。
[0014]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，直接發(fā)生步驟(a)中的偶聯(lián)。在這些實(shí)施方案中，通常使用多糖中的伯胺基將多糖與連接體偶聯(lián)。在這些實(shí)施方案中，連接體通常在兩個(gè)末端均具有酯基。這允許酯基中的一個(gè)通過(guò)親核?；〈c多糖中的伯胺基反應(yīng)來(lái)發(fā)生偶聯(lián)。該反應(yīng)產(chǎn)生了多糖-連接體中間產(chǎn)物，其中多糖通過(guò)酰胺鍵與連接體偶聯(lián)。因此在這些實(shí)施方案中，連接體是雙功能連接體，其提供用于與多糖中伯胺基反應(yīng)的第一酯基以及用于與載體分子中伯胺基反應(yīng)的第二酯基。例如，可以使用通式X1-L-X2的雙功能連接體，其中X1是可以與多糖中的伯胺基反應(yīng)的酯基；X2是可以與載體分子中的伯胺基反應(yīng)的酯基；并且L是連接體中的連接部分。一般的L基團(tuán)是具有1-10個(gè)碳原子的直鏈烷基(例如C1X2'C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C1(I)，特別地-(CH2) 4_。通式X-L-X的同型雙功能連接體是特別合適的，其中兩個(gè)X基團(tuán)是一模一樣的，并且能與兩個(gè)伯胺基反應(yīng)；并且其中L是連接體中的連接部分。一般的X基團(tuán)是N-氧丁二酰亞胺。L通常具有通式-L’-L2-L’-，其中L’是羰基。一般的L2基團(tuán)是具有1-10個(gè)碳原子的直鏈烷基(例如Cp C2、C3> C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特別地-(CH2)4-。因此，一般的連接體是己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯(adipic acid Nhydroxysuccinimide diester) (SIDEA),并且發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該化合物特別適合作為本發(fā)明的
連接體:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.用于還原胺化多糖的還原端處的羰基的方法，其中所述還原胺化在pH4至PH5之間進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述羰基在所述多糖的還原端處的KDO亞基內(nèi)。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述多糖包含來(lái)自革蘭氏陰性菌脂多糖的核心結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述多糖包含與所述核心結(jié)構(gòu)域連接的來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖的O-抗原。
5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的方法，其中所述脂多糖來(lái)自沙門氏菌屬(Salmonella)細(xì)菌。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述脂多糖來(lái)自甲型副傷寒桿菌(S.Paratyphi A)、鼠傷寒桿菌(S.Typhimurium)或腸炎沙門菌(S.Enteritidis)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述多糖是細(xì)菌莢膜多糖。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)菌莢膜多糖來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清組 X。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述還原胺化包括所述羰基與通式為Y1-L-Y2的雙功能連接體中的Y1反應(yīng)，以形成多糖-雙功能連接體化合物，其中所述多糖通過(guò)C-N鍵與所述雙功能連接體偶聯(lián)，其中:所述Y1包含可與所述多糖中的羰基反應(yīng)的伯胺基；所述Y2包含第二反應(yīng)基團(tuán)例如伯胺基或-SH基團(tuán)；并且L是連接部分。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述Y1和Y2均是-NHNH2基團(tuán)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述L具有通式-L’-L2-L’-，其中所述L’是羰基，并且所述L2是具有1至10個(gè)碳原子的直鏈烷基。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述L2是-(CH2)4_。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述L是羰基。
14.通過(guò)權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)的方法獲得的多糖-雙功能連接體化合物。
15.用于制備多糖和載體分子的綴合物的方法，其包括步驟:(a)將所述多糖與連接體偶聯(lián)，以形成多糖-連接體化合物，其中所述連接體的游離端是酯基；和(b)使所述酯基與所述載體分子中的伯胺基反應(yīng)，以形成多糖-連接體-載體分子綴合物，其中所述連接體通過(guò)酰胺鍵與所述載體分子偶聯(lián)，特別地，其中所述多糖包含(i)來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結(jié)構(gòu)域或(ii)來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組X的莢膜多糖。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述多糖包含來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結(jié)構(gòu)域，所述連接體在兩個(gè)末端均具有酯基，并且所述多糖通過(guò)以下方式與所述連接體偶聯(lián)，以形成多糖-連接體化合物:所述酯基中的一個(gè)通過(guò)親核?；〈c所述核心結(jié)構(gòu)域中的伯氨基反應(yīng)，其中所述多糖通過(guò)酰胺鍵與所述連接體偶聯(lián)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述連接體具有通式X1-L-X2，其中所述X1是可以與所述核心結(jié)構(gòu)域中的伯氨基反應(yīng)的酯基；所述X2是酯基；并且所述L是連接部分。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述L是具有1至10個(gè)碳原子的直鏈烷基。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述L是-(CH2)4_。
20.權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的方法，其中所述X1-L-X2是己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯。
21.權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)的方法，其中所述多糖是如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)限定的多糖。
22.權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述脂多糖來(lái)自甲型副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌或腸炎沙門菌，并且所述伯氨基在焦磷酸乙醇胺基團(tuán)內(nèi)。
23.權(quán)利要求15的方法，其中使用其他連接體進(jìn)行所述步驟(a)，所述其他連接體在與所述連接體偶聯(lián)之前用于衍生所述多糖。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述其他連接體在兩個(gè)末端均具有伯氨基，并且所述多糖通過(guò)以下方法使用所述多糖的還原端處的羰基與所述其他連接體偶聯(lián)，所述方法包括兩步:(&1)所述羰基通過(guò)還原胺化與所述其他連接體中的伯氨基中的一個(gè)反應(yīng)，以形成多糖-其他連接體化合物，其中所述多糖通過(guò)C-N鍵與所述其他連接體偶聯(lián)；和(a2)使所述其他連接體的游離端與所述連接體反應(yīng)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述還原胺化根據(jù)權(quán)利要求1的方法進(jìn)行。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述其他連接體在兩個(gè)末端均具有伯氨基，并且所述多糖通過(guò)以下方法使用所述多糖中的羧基與所述其他連接體偶聯(lián)，所述方法包括兩步:(?)所述羧基通過(guò)EDAC活化與所述其他連接體中的伯氨基中的一個(gè)反應(yīng)，以形成多糖-其他連接體化合物，其中所述多糖通過(guò)酰胺鍵與所述其他連接體偶聯(lián)；和(a2)使所述其他連接體的游離端與所述連接體反應(yīng)。
27.權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)的方法，其中所述其他連接體是權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)定義的雙功能連接體。
28.權(quán)利要求24至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述連接體在兩個(gè)末端均具有酯基，并且所述步驟(a2)包括所述酯基中的一個(gè)通過(guò)親核酰基取代與所述其他連接體的游離端處的伯氨基反應(yīng)，以形成多糖-連接體化合物，其中所述多糖通過(guò)所述其他連接體與所述連接體偶聯(lián)，其中所述其他連接體通過(guò)酰胺鍵與所述連接體偶聯(lián)。
29.權(quán)利要求15和權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述連接體是權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)定義的連接體。
30.權(quán)利要求15和權(quán)利要求23至29中任一項(xiàng)的方法，其中所述多糖是如權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)限定的多糖。
31.權(quán)利要求15至30中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體分子是白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、類毒素或其突變體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述載體分子是CRM197白喉毒素突變體。
33.通過(guò)權(quán)利要求15至32中任一項(xiàng)的方法獲得的多糖-連接體-載體分子綴合物。
34.在權(quán)利要求15至30中任一項(xiàng)的方法中獲得的多糖-連接體化合物。
35.在權(quán)利要求24至30中任一項(xiàng)的方法中獲得的多糖-其他連接體化合物。
36.用于減少未反應(yīng)的連接體污染根據(jù)權(quán)利要求34的多糖-連接體化合物的方法，其包括在小于PH5的含水條件下沉淀未反應(yīng)的連接體的步驟。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述沉淀在pH2至5之間，特別地在pH4至5之間進(jìn)行。
38.權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的方法，其中所述pH通過(guò)添加含水緩沖液，特別地檸檬酸緩沖液獲得。
39.權(quán)利要求36或權(quán)利要求37的方法，其中所述pH通過(guò)添加HCl獲得。
40.權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀在具有>60%含水量(體積/體積)的水溶液中進(jìn)行。
41.權(quán)利要求36至39中任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀通過(guò)離心去除。
42.權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)的方法，其中所述多糖-連接體化合物通過(guò)使用醇沉淀從溶液中回收。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述醇是乙醇或2-丙醇。
44.權(quán)利要求43的方法，其中將所述醇加入到含所述多糖-連接體化合物的溶液中，以產(chǎn)生80%至95%之間的乙醇或2-丙醇(體積/體積)的終濃度。
45.權(quán)利要求44的方法，其中沉淀的所述多糖-連接體化合物通過(guò)離心回收。
46.根據(jù)權(quán)利要求36至45中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在權(quán)利要求15至32中任一項(xiàng)的步驟(a)和(b)之間 進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103917245SQ201280054487
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月14日
【發(fā)明者】A·索爾, F·米科利 申請(qǐng)人:諾華股份有限公司