專利名稱：一種肝素鈉平衡提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明方法涉及的是一種以豬小腸粘膜為材料的提取肝素鈉技術(shù)，方法通過超聲波生物酶解技術(shù)、層析技術(shù)提高了現(xiàn)有技術(shù)水平，從而提高了肝素鈉產(chǎn)量的一種提取方法。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是人類的頭號疾病殺手。隨著人們生活水平提高帶來的營養(yǎng)過剩、全球環(huán)境的惡化、生活節(jié)奏加快、人口老齡化加劇，致使全球心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率正逐年增高，肝素的出現(xiàn)為眾多心腦血管疾病患者創(chuàng)造了生命的奇跡。目前肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中，其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物。臨床應(yīng)用及研究顯示，肝素除具有抗凝血作用外，還具有其他多種生物活性和臨床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)增 生、促進(jìn)纖維蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由肝素原料藥作為原料進(jìn)一步加工成的一大類抗血栓的藥物，具有更為廣泛的臨床醫(yī)學(xué)用途，成為治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥(心絞痛、心肌梗塞)等疾病的首選藥物。肝素是世界上迄今為止已知的分子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的化合物，短期內(nèi)無法人工化學(xué)合成，目前只有來源于豬小腸粘膜的肝素能夠用于臨床治療。肝素原料藥的原料是肝素粗品，其提取只能源自健康生豬的小腸粘膜，由于含有大量雜質(zhì)蛋白、雜質(zhì)核酸、微生物等雜質(zhì)，需經(jīng)過物理和化學(xué)提取分離過程，定向獲取天然結(jié)構(gòu)基團(tuán)完整的肝素，從而制成肝素原料藥。肝素鈉原料藥是標(biāo)準(zhǔn)肝素制劑的唯一有效成分和低分子肝素原料的生產(chǎn)起點(diǎn)，目前肝素制劑只有按照注射給藥方式用于臨床，這使得肝素原料藥需要有很高的純度，方可保證制劑的用藥安全。有報道稱采用超聲波輔助酶解和鹽解過程可提高收率，如“黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，宋大魏畢業(yè)論文，《肝素的高效提取和分離純化技術(shù)研究》，通過研究發(fā)現(xiàn)，超聲波通過高壓強(qiáng)空化效應(yīng)確實(shí)可以幫助細(xì)胞破裂，釋放更多的肝素，但在單頻和雙頻下還不能完全適應(yīng)肝素鈉酶解過程，通過研究發(fā)現(xiàn)被分解物質(zhì)的分子量大小與頻率的關(guān)系密切，酶解肝素鈉的過程又需要不同的頻率完成，比如28KHz、40KHz、68KHz之所以要采用這樣的順序，是因?yàn)槊附膺^程是一個由大到微小的過程，28KHz是將大組織分解成小結(jié)構(gòu)的液態(tài)組織在這個時候會釋放10%肝素鈉，40KHz是將液態(tài)組織分解成細(xì)小的水解液這樣會釋放60%肝素鈉，68KHz是將細(xì)小水解液分解成微小水解液這會釋放30%肝素鈉。三個步驟加載一起基本可以完整表達(dá)超聲波酶解肝素鈉過程。所以本發(fā)明提供的是一種適宜于完整酶解過程所需要的多種頻率的超聲波結(jié)合在一起的方法，并且適用于大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化效果顯著。研究傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)，采用樹脂吸附方式提取肝素鈉的方法都存在一個問題，樹脂投入吸附罐后，并不是所有樹脂都得到了充分利用，在樹脂攪拌吸附時，酶解液在罐內(nèi)形成旋渦，底部樹脂密度大于上部，恰恰底部肝素濃度低，上部濃度高，且底部有雜質(zhì)沉淀，另外漂浮在吸附罐內(nèi)上部樹脂易被酶解液中的油脂成分堵塞，堵塞后的樹脂吸附能力大大下降，這些問題影響了樹脂吸附，本發(fā)明是針對上述問題采用層析方法解決這一難題，目前未發(fā)現(xiàn)在肝素鈉粗品生產(chǎn)中采用層析方法的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用超聲波正確的頻率對整個酶解過程提高肝素鈉收率的方法，其成本低、收率高、能耗低、污染小。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，其特征包括如下步驟A采用常規(guī)酶解法在酶解罐中混合豬小腸粘膜、鹽、堿、蛋白酶和水；B對混合后的液體分別加入三種頻率的超聲波進(jìn)行酶解，其頻率分別為28KHz、40KHz、68KH，工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，功率分別為500W、400W、500W，制得豬小腸酶解液；C采用常規(guī)法加熱酶解液使蛋白酶失活蛋白變性；D采用帶有10 μ m-50 μ m的過濾裝置過濾雜質(zhì)并采用帶有恒溫循環(huán)裝置的層析設(shè)備進(jìn)行吸附；E采用常規(guī)法洗脫樹脂；F采用常規(guī)法沉淀肝素鈉；6采用常規(guī)法純化肝素鈉；H最后采用常規(guī)法干燥得到肝素鈉。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.工藝簡單，操作簡便，投資少，對現(xiàn)有設(shè)備改變不大，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。2.肝素鈉收率提高，質(zhì)量穩(wěn)定。以本方法生產(chǎn)的肝素鈉純度可達(dá)105_120IU/mg，肝素鈉收率可達(dá)I億IU/1500-1700根重量在1200克-1400克豬小腸粘膜，較現(xiàn)有技術(shù)提高 20-30%。3.減少污染，降低成本。本發(fā)明方法可以杜絕在吸附罐的樹脂在洗脫時流入排水系統(tǒng)進(jìn)而對水源造成長期污染。4.降低能耗，減少生產(chǎn)成本。本發(fā)明方法采用循環(huán)水系統(tǒng)，較傳統(tǒng)工藝節(jié)電力30%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種肝素鈉平衡提取方法，包括以下步驟A混合酶解液采用傳統(tǒng)酶水解工藝，用健康豬小腸粘膜為原料，加入水、蛋白酶、腸衣鹽、氫氧化鈉，其比例分別為(本專利按份來計(jì)算)，取100份腸粘膜加加500L水500克蛋白酶3000克腸衣鹽，一起投入反應(yīng)罐中，攪拌均勻后，用2mol濃度氫氧化鈉調(diào)節(jié)酶解液 PH 至 8. 0-9.0。B超聲波工作過程在酶解液中溫度達(dá)到40度時分別加入28ΚΗζ、40ΚΗζ、68ΚΗζ超聲波發(fā)生器，設(shè)定其工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，功率分別為5000W、4000W、5000W。超聲波結(jié)束后開始升溫至55-60°C，恒溫攪拌酶解2H。C蛋白酶失活過程將酶解液快速加溫至85-90°C，保溫10-30分鐘，開始過濾。D過濾吸附待蛋白酶失活過程結(jié)束，開始過濾，先用100-120目濾網(wǎng)過濾雜質(zhì)，收集濾液。濾液，再用 ο μ m-50 μ m的過濾裝置過濾，過濾后的液體變清澈，將酶解液降溫后，通過自循環(huán)裝置，把酶解液循環(huán)通過預(yù)裝好樹脂的層析柱，循環(huán)為封閉式循環(huán)，隔絕了與空氣的接觸，柱高為樹脂高度的3倍，循環(huán)8H，同時保持溫度60°C，壓力表顯示1. OlMPa，流速表顯不3m3/H。E洗脫將吸附后的樹脂用15% -19%氯化鈉溶液(樹脂量的I倍)攪拌洗脫2_4H2次，收集洗脫液，然后再用20%氯化鈉溶液(樹脂量的I倍)洗脫I次，收集洗脫液。
F肝素鈉沉淀將步驟E中洗脫液合并，加入85% -95%乙醇攪拌，直到沉淀液乙醇濃度達(dá)到45-50度，停止攪拌，靜置12H，將上部酒精回收待下次使用，收集下部肝素鈉沉淀物。G肝素鈉純化將步驟F所得肝素鈉沉淀用3 %氯化鈉溶液溶解，用200-300目濾網(wǎng)過濾，除去雜質(zhì)，在加入85% -95 %乙醇攪拌，直到溶液濃度達(dá)到45% -50%，靜置沉淀8H，回收上部酒精，收集下部肝素鈉沉淀，然后加入85 % -95 %乙醇脫水，收集肝素鈉沉淀。H烘干將收集的肝素鈉沉淀至于鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干，至半干時，加入蒙脫石干燥，可得肝素鈉。實(shí)施例2本實(shí)施例的步驟同實(shí)施例1只是在吸附層析柱的流速和壓力上作了改變，實(shí)施例2改為壓力表顯示1. 02MPa，流速表顯示5m3/H。 實(shí)施例3本實(shí)施例的步驟同實(shí)施例1只是在吸附層析柱的流速和壓力上作了改變，實(shí)施例3改為壓力表顯示1. 025MPa，流速表顯示10m3/H。本發(fā)明可用其它不違背本發(fā)明精神或主要特征的具體形式來概述，在不脫離本發(fā)明上述主題范圍的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出來的各種變更和替換，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種肝素鈉平衡提取方法，具體步驟如下 A采用常規(guī)酶解法在酶解罐中混合豬小腸粘膜、鹽、堿、蛋白酶和水；B對混合后的液體分別加入三種頻率的超聲波進(jìn)行酶解，其頻率分別為28KHz、40KHz、68KH，工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，制得豬小腸酶解液；C采用常規(guī)法加熱酶解液使蛋白酶失活蛋白變性；D采用帶有10 μ m-50 μ m的過濾裝置過濾雜質(zhì)并采用帶有恒溫循環(huán)裝置的層析設(shè)備進(jìn)行吸附；E采用常規(guī)法洗脫樹脂疋采用常規(guī)法沉淀肝素鈉而采用常規(guī)法純化肝素鈉；H最后采用常規(guī)法干燥得到肝素鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉平衡提取方法，其特征在于所述步驟B、D中采用的三種超聲波特有的頻率對應(yīng)整個酶解過程，和一種10 μ m-50 μ m過濾裝置、恒溫、循環(huán)、密封、層析的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種肝素鈉平衡提取方法，其特征包括如下步驟 A混合酶解液采用傳統(tǒng)酶水解工藝，用健康豬小腸粘膜為原料，加入水、蛋白酶、腸衣鹽、氫氧化鈉，其比例分別為(本專利按份來計(jì)算)5份腸粘膜加25L水25克蛋白酶150克腸衣鹽，一起投入反應(yīng)罐中，攪拌均勻后，用2mol濃度氫氧化鈉調(diào)節(jié)酶解液PH至。8.O-9. O ο B超聲波工作過程在酶解液中溫度達(dá)到40度時分別加入28ΚΗζ、40ΚΗζ、68ΚΗζ超聲波，其工作時間分別為20分鐘、30分鐘、10分鐘，功率分別為5001、4001、5001。超聲波工作結(jié)束后開始升溫至55-60°C，恒溫攪拌酶解2H。
C蛋白酶失活過程將酶解液快速加溫至85-90°C，保溫10-30分鐘，開始過濾。
D過濾吸附待蛋白酶失活過程結(jié)束，開始過濾，先用100-120目濾網(wǎng)過濾雜質(zhì)，收集濾液。濾液再用10μπι-50μπι的過濾裝置過濾，過濾后的液體變清澈，將酶解液降溫后，通過自循環(huán)裝置，把酶解液循環(huán)通過預(yù)裝好樹脂的層析柱，循環(huán)為封閉式循環(huán)，隔絕了與空氣的接觸減少氧化，柱高為樹脂高度的3倍，循環(huán)8Η，同時保持溫度60°C，壓力1. 025MPa。
E洗脫將吸附后的樹脂用15% -20%氯化鈉溶液(樹脂量的I倍)攪拌洗脫2-4H 2次，收集洗脫液，然后再用20%氯化鈉溶液(樹脂量的I倍)洗脫I次，收集洗脫液。
F肝素鈉沉淀將步驟E中洗脫液合并，加入80% -95%乙醇攪拌，直到沉淀液乙醇濃度達(dá)到40-50度，停止攪拌，靜置12H，將上部酒精回收待下次使用，收集下部肝素鈉沉淀物。
G肝素鈉純化將步驟F所得肝素鈉沉淀用3%氯化鈉溶液溶解，用200-300目濾網(wǎng)過濾，除去雜質(zhì)，在加入85% -95%乙醇攪拌，直到溶液濃度達(dá)到45% _50%，靜置沉淀8!1，回收上部酒精，收集下部肝素鈉沉淀，然后加入85% -95%乙醇脫水，收集肝素鈉沉淀。
H烘干將收集的肝素鈉沉淀至于鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干，至半干時，加入蒙脫石干燥，可得肝素鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝素鈉提取的方法，其特點(diǎn)在于解決了傳統(tǒng)酶解工藝中腸粘膜酶解不充分，吸附效果不佳的問題。傳統(tǒng)酶解工藝中會產(chǎn)生酶解不均勻現(xiàn)象，本發(fā)明通過在不同的酶解階段引入不同的超聲波對其進(jìn)行充分酶解使得酶解液肝素鈉含量提高，充分釋放了肝素鈉。在吸附階段，本發(fā)明通過過濾凈化了吸附母液水質(zhì)，使得吸附環(huán)境更清潔，樹脂更易吸附，少被污染和堵塞，從而提高了肝素鈉生產(chǎn)效率。本發(fā)明通過以上兩步驟使得肝素鈉收率提高10％-20％，具有顯著經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C08B37/10GK102993335SQ20111026849
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者譚科 申請人:譚科