專利名稱：一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法及其在DNA分離純化中的應用，屬于磁性復合材料和生物分離材料制備技術領域。
背景技術：
DNA的分離純化在基因工程、生物學、醫(yī)學和遺傳學等領域具有十分重要的地位。 DNA的分離純化技術總體上可以分為兩類無外加磁場輔助和有外加磁場輔助，即無磁分離和有磁分離。無磁分離的方法有多種，在眾多文獻和專利中都有描述(N·拉馬蘇步拉曼彥中國專利=DNA純化方法和純化的DNA. CN 1390229A, 2003年1月8日)，如苯酚-氯仿-異戊醇法、氯化銫-乙啡啶溴化物密度梯度離心法、色譜法、多級層析法、樹脂吸附法、 硅氧化物或硅酸鹽吸附法、交叉流動式離心分離法和相分離法等。上述分離方法各有優(yōu)缺點，在此不一一贅述。有磁分離是利用磁性復合納、微米顆粒對DNA的特異性吸附作用，在外加磁場輔助下將目標DNA從細胞裂解液中分離出來，是近年來發(fā)展迅速的一類DNA純化技術；與無磁分離相比，它具有操作方便、快捷、污染少、易于實現(xiàn)自動化操作等諸多優(yōu)勢。國內(nèi)外關于有磁分離的相關文獻和專利，其差異性主要體現(xiàn)在使用不同的磁性復合納、微米顆粒。磁性復合微球(又稱為磁珠)是一種由磁性材料和非磁性材料復合而成的具有球形或類球形結(jié)構(gòu)的新型功能材料。其磁性成分主要是鐵、鉆、鎳，或者它們的氧化物及合金等；非磁性材料可以是合成高分子(如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚苯胺、聚吡咯等)或天然高分子(殼聚糖、淀粉、蛋白質(zhì)、葡聚糖、瓊脂糖等)，也可以是無機材料如二氧化硅、二氧化鈦等。磁性復合微球根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點大致可以分為四種類型核-殼式、殼-核式、彌散式和夾心式?？紤]到磁性無機粒子在化學穩(wěn)定性、生物相容性和表面修飾等方面存在諸多缺陷，目前研究較多的是磁性成分在內(nèi)、非磁性成分在外的核-殼式結(jié)構(gòu)的復合微球。核-殼式磁性高分子微球?qū)⒑说拇判院筒煌叻肿託营毺氐奈锢砗突瘜W性能、 電學和光學性能有機地結(jié)合起來，在有機催化、生物傳感、藥物緩釋、免疫分析及蛋白質(zhì)和 DNA分離純化等領域有著廣泛的應用(王柯敏等中國專利采用氨基化二氧化硅殼磁性納米顆?？焖俪樘峒兓疍NA的方法.CN 1421455A，2003年6月4日；戴紅蓮等中國專利一種核/殼型聚氨酯磁性復合微球及其制備方法和用途.CN 1966097A，2007年5月23日； 王曉川等中國專利一種應用于蛋白質(zhì)分離純化的納米磁性復合微球的制備方法.CN 101519482A，2009年9月2日；錢浩等中國專利一種嗜硫性磁性復合微球的制備方法和用此微球分離免疫球蛋白G的方法.CN 101279246A,2007年12月觀日；成國祥等中國專利分子印跡磁性復合微球及其懸浮聚合制備方法.CN 1390863A,2003年1月15日；程楊等中國專利一種高磁性負載導電高分子的重金屬吸附劑及其制備方法.CN 101708463A, 2009 年 11 月 23 日；Ugelstad 等美國專利Process for preparing magnetic polymer particles[P], US 47744265，1988 年 9 月 27 日)。
其中，表面富含氨基的磁性復合納、微米顆粒以其良好的生物相容性和表面可接枝性，在核酸分離、藥物載體和廢水處理等領域受到了廣泛關注(CN 1421455A ；CN 1966097A ；CN 101708463A ；CN 101071669A)。王柯敏等公開了一種利用氨基化SiO2包被 Fe3O4復合納米顆?？焖俪樘峒兓疍NA的方法(CN 1421455A)，該方法不需用苯酚-氯仿抽提除去核酸溶液中的蛋白質(zhì)，簡化了操作步驟，提高了分離效率，免去了酚-氯仿對環(huán)境的污染和對人體的損害。戴紅蓮等公開了一種鐵氧體-二氧化硅-聚氨酯磁性復合微球的制備方法(CN 1966097A)，并使其結(jié)合不同藥物，用于靶向治療。程楊等公開了一種 !^e3O4-SiO2-聚吡咯重金屬離子吸附劑及其制備方法(CN 101708463A)，該種吸附劑具有性質(zhì)穩(wěn)定、吸附速率快、可再生的特點，對污水中的重鉻酸根離子有較好的吸附性能。目前表面富含氨基的核-殼式磁性高分子微球的制備均采用聚合物接枝和異相聚合的方法。聚合物接枝法是指將鐵鹽溶液或磁流體分散在聚合物的溶液中，利用磁核表面羥基和聚合物鏈上活性基團之間的化學作用(氫鍵或縮合)，形成聚合物包被磁核的復合物；這種方法制備的磁性復合微球分散性較差、核-殼式結(jié)構(gòu)特征不明顯。異相聚合法通?？梢苑譃閮深愐徊椒ㄔ痪酆虾头植椒ń缑婢酆稀Ｒ徊椒ㄔ痪酆鲜侵笇⒓{米級磁流體、表面活性劑和聚合物單體均勻混合后再引發(fā)聚合，采用乳液聚合或分散聚合法得到聚合物包被狗304、γ-Fe2O3、鐵酸鹽(MC^Fe2O3)或狗丄0、附鐵磁性納米粒子的復合物。分步法界面聚合是指先用交聯(lián)劑(如3-氨丙基三乙(或甲)氧基硅烷等)或表面活性劑(如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、吐溫-80等)將磁核表面修飾，使單體在磁核表面吸附、成核、生長(CN 101708463A ；CN 1966097A ；S. Xuan 等Synthesis of Fe3O4Opolyaniline core/shell microspheres with well-defined blackberry-like morphology [J]. J. Phys. Chem. C2008,112，18804-18809.)。異相聚合法能夠得到質(zhì)量較高的核-殼式磁性復合微球，但制備過程中需加入交聯(lián)劑和/或表面活性劑；這不僅提高了生產(chǎn)成本，而且環(huán)境并不友好。因此，如何簡化制備過程、降低生產(chǎn)成本， 獲得磁響應性高、分散性好、顆粒尺寸分布窄、表面功能化的復合微球，仍然是一項富有挑戰(zhàn)性的課題。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上技術現(xiàn)狀，本發(fā)明目的之一是提供一種制備過程簡單、樣品磁響應性高、 顆粒尺寸分布窄、分散性好、表面富含氨基的核-殼式磁性高分子微球的制備方法；本發(fā)明的另一目的是將所制備的復合微球用于分離、純化DNA。一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法，其特征在于a.將鐵氧體類納/微米球形或類球形原料磁球置于盛有0. 05-0. 15mol/L的質(zhì)子酸水溶液的容器中，超聲分散5-10min，0-l(TC密封靜置12h，磁吸分離除去質(zhì)子酸水溶液， 得到質(zhì)子化磁球，其中原料磁球的質(zhì)量(g)與質(zhì)子酸溶液的體積(mL)之比為1 200-600;b.往上述盛有質(zhì)子化磁球的容器中加入重新蒸餾的含氨基單體和極性有機溶劑， 超聲分散5-lOmin，在0-10°C密封靜置12_Mh，其中原料磁球和含氨基單體的質(zhì)量比為 1-2 1，原料磁球的質(zhì)量(g)和極性有機溶劑的體積(mL)之比為1 100-300;c.將單體物質(zhì)的量的1-2倍的氧化劑溶解在0. 05-0. 15mol/L質(zhì)子酸水溶液中， 質(zhì)子酸水溶液的體積(mL)與原料磁球的質(zhì)量(g)之比為200-400 1，再將其緩慢滴加至b步驟所得體系，滴加時間為30-60min，超聲分散5-lOmin，在零度到室溫范圍內(nèi)，機械攪拌或超聲輔助機械攪拌反應l_12h，得懸浮液；d.懸浮液經(jīng)磁吸分離，所得固體在室溫到50°C范圍內(nèi)、0. 08-0. IMI^a真空度條件下干燥，得表面富含胺基或質(zhì)子化氨基的磁性導電聚合物微球。其中步驟a中所述質(zhì)子酸是指鹽酸、硫酸或硝酸。其中步驟b中含氨基單體分子為苯胺或吡咯，或分子式I所示苯胺的衍生物，或分子式II所示吡咯的衍生物；
權利要求
1.一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法，其特征在于a.將鐵氧體類納/微米球形或類球形原料磁球置于盛有0.05-0. 15mol/L的質(zhì)子酸水溶液的容器中，超聲分散5-10min，0-l(TC密封靜置12h，磁吸分離除去質(zhì)子酸水溶液，得到質(zhì)子化磁球，其中原料磁球的質(zhì)量(g)與質(zhì)子酸溶液的體積(mL)之比為1 200-600 ；b.往上述盛有質(zhì)子化磁球的容器中加入重新蒸餾的含氨基單體和極性有機溶劑， 超聲分散5-lOmin，在0-10°C密封靜置12_Mh，其中原料磁球和含氨基單體的質(zhì)量比為 1-2 1，原料磁球的質(zhì)量(g)和極性有機溶劑的體積(mL)之比為1 100-300 ；c.將含氨基單體物質(zhì)的量的1-2倍的氧化劑溶解在0.05-0. 15mol/L質(zhì)子酸水溶液中， 質(zhì)子酸水溶液的體積(mL)與原料磁球的質(zhì)量(g)之比為200-400 1，再將其緩慢滴加至 b步驟所得體系，滴加時間為30-60min，超聲分散5-lOmin，在零度到室溫范圍內(nèi)，機械攪拌或超聲輔助機械攪拌反應l_12h，得懸浮液；d.懸浮液經(jīng)磁吸分離，所得固體在室溫到50°C范圍內(nèi)、0.08-0. IMI^a真空度條件下干燥，得表面富含胺基或質(zhì)子化氨基的磁性導電聚合物微球。
2.根據(jù)權利要求1所述一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法，其特征在于步驟a中所述質(zhì)子酸是指鹽酸、硫酸或硝酸。
3.根據(jù)權利要求1所述一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法，其特征在于步驟b中含氨基單體分子為苯胺或吡咯，或分子式I所示苯胺的衍生物，或分子式II所示吡咯的衍生物；
4.根據(jù)權利要求1所述一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法，其特征在于步驟b中極性有機溶劑是指分析純的甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺或乙腈。
5.根據(jù)權利要求1所述一種核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法，其特征在于當含氨基單體為苯胺或苯胺衍生物單體時，上述步驟c中的氧化劑指雙氧水、氯酸鈉、碘酸鉀、過硫酸銨或過硫酸鉀；當含氨基單體為吡咯或吡咯衍生物單體時，上述步驟c中的氧化劑指水合氯化鐵、雙氧水、氯酸鈉、碘酸鉀、過硫酸銨或過硫酸鉀。
6.一種根據(jù)權利要求1所述的核-殼式磁性導電聚合物微球的制備方法制備的微球在 DNA分離純化中的應用，其特征在于a.將磁性導電聚合物微球用0.5-3mol/L的氨水在室溫、攪拌下脫摻雜l_48h，抽濾、水洗得固體，固體經(jīng)真空干燥得脫摻雜的磁性聚合物微球；b.取脫摻雜的磁性聚合物微球，用70%(ν/ν)乙醇溶液消毒后，轉(zhuǎn)移至一無菌離心管中，依次加入DNA粗提液和DNA結(jié)合液，搖勻，室溫下放置10-60min待DNA在磁球表面吸附；磁場下收集磁球，用70% (ν/ν)乙醇溶液洗滌磁球，磁分離、棄上清液，將吸附DNA的磁球在室溫下放置使乙醇揮發(fā)；其中脫摻雜磁性聚合物微球質(zhì)量(mg)與DNA粗提液體積(uL)之比為1 4-12 ；DNA結(jié)合液是pH為8的Tris-HCl緩沖液或pH為7的磷酸鹽緩沖液；DNA 粗提液和DNA結(jié)合液的體積之比為1 8-25;c.往步驟b盛有吸附DNA的磁球的無菌離心管中加入DNA解吸液，搖勻，室溫下放置 10-60min待DNA解吸，磁場下收集上清液，并將其轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中；其中DNA解吸液是指2-3mol/L的NaCl溶液或pH為9_11的TE緩沖溶液，pH為9_11的TE緩沖溶液是指由10mmol/L Tris-HCl和lmmol/L EDTA溶液組成的混合溶液；DNA粗提液和DNA解吸液的體積之比為1 5-10 ；d.將步驟c中收集的上清液取樣，用紫外分光光度計測定其260和^Onm處的吸光值， 計算DNA的濃度和純度，并在1. 0 % (w/v)瓊脂糖凝膠的TAE緩沖溶液中進行電泳分析；TAE 緩沖溶液是指由40mmol/L Tris、20mmol/L HAc和lmmol/L EDTA組成的pH為8. 0的混合溶液，瓊脂糖凝膠用0. 5ug/mL的溴乙啡啶溶液著色。
全文摘要
以鐵氧體(Fe3O4，γ-Fe2O3，MFe2O4；M＝Fe，Co，Ni，Mn等)納、微米球形或類球形顆粒為核，先使磁核表面羥基質(zhì)子化，利用質(zhì)子化羥基和單體苯胺、吡咯或它們的衍生物分子之間的靜電和氫鍵作用，使磁核在復合之前與單體分子充分結(jié)合；氧化聚合反應過程中，單體分子被控制在磁核表面成核、生長，制備了磁響應性高、分散性好的核-殼式磁性導電聚合物微球。利用含氨基磁性聚合物微球在近中性溶液中荷正電，而組織或細胞裂解液中的DNA分子荷負電的特點，將所制備的磁性復合微球應用于在外加磁場輔助下的DNA分離與純化。
文檔編號C08G73/02GK102174195SQ201110002419
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權日2011年1月7日
發(fā)明者姜海輝, 蓋利剛, 韓小云, 馬萬勇 申請人:山東輕工業(yè)學院