專利名稱：兩種夾竹桃寡糖及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類及其在制備藥物中的應(yīng)用，具體涉及兩種夾竹桃寡 糖及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
糖是構(gòu)成生命體的三大基本要素，在諸多生命過程中起到重要的作 用。除了成熟的抗凝血藥物肝素、治療糖尿病的阿卡波糖等之外，現(xiàn)
處于第i-m期臨床試驗(yàn)的糖類藥物共有34種。糖類藥物的最大特點(diǎn)是 低毒或無毒，因此其具有巨大的應(yīng)用前景。
源于夾竹桃花的多糖具有抗腫瘤、抗氧化、免疫促進(jìn)和神經(jīng)保護(hù)作
用。但是，遇到的問題是這些大分子如果采用口服給藥，其生物藥 效率將是非常低的。寡糖具有各種生物活性，是一種較新的功能性產(chǎn) 物，被用于保健食品和藥物中。例如，新的抗血管生成試劑PI-88就是 一種高度硫酸化的寡糖，現(xiàn)處于第m期臨床階段。因此，尋找具有高 活性的寡糖是一項(xiàng)很有意義的工作。我們?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種源于夾竹桃 花的寡糖，具有顯著的抗血管生成作用。

發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供兩種具有抗血管生成作用的夾竹桃 寡糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別為
<formula>formula see original document page 4</formula>/ -D-Galp-( 1 —[4)--D-Galp( 1 —]24)-〃-D-Galp
T
*Galp
JZTOA-2
其中，*03^為具有還原末端的半乳糖，所述夾竹桃寡糖的分子量
分別為1800Da和828Da。
本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的夾竹桃寡糖的制備方法，該方 法是首先從夾竹桃花中提取多糖，再經(jīng)水解、分離、純化而制得所述 夾竹桃寡糖的。
本發(fā)明的又一 目的是提供本發(fā)明的夾竹桃寡糖在制備抗腫瘤藥物 中的用途。
本發(fā)明提供的夾竹桃寡糖的制備方法包括以下步驟
a. 多糖提取干燥的夾竹桃花經(jīng)乙醇脫脂，風(fēng)干，加入去離子水， 加熱條件下提取，過濾，殘?jiān)俅斡萌ルx子水提取，如此反復(fù)提取2-6 次，濾液合并，加熱濃縮，濃縮液經(jīng)15。/o三氯乙酸在4。C下脫蛋白，離 心，上清液經(jīng)中和，透析，再濃縮，加入3倍于濃縮液體積的乙醇， 離心得沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥得水提夾竹桃粗多糖JZTP;
b. 多糖水解向水提夾竹桃粗多糖JZTP中加入酸，如三氟乙酸， 在100。C條件下水解4小時(shí)，反應(yīng)完畢后加入曱醇，減壓濃縮，蒸餾水 溶解，再加入乙醇，離心除去沉淀，上清液經(jīng)減壓濃縮得夾竹桃粗寡 糖JZTO;
c. 寡糖分離將夾竹桃粗寡糖JZTO用水溶解、離心，用DEAE-
纖維素(cr型)為載體進(jìn)行柱層析初步分離，以蒸餾水洗脫，^琉酸-苯酚
檢測(cè)，洗脫液再次濃縮、冷凍干燥、溶解和離心，上清液用l:l(質(zhì)量比)的活性炭與硅藻土為載體進(jìn)行柱層析分離，逐步以蒸餾水以及有機(jī)溶
劑與水的混合液，如5%乙醇溶液，50%乙醇溶液依次洗脫，其中50% 乙醇洗脫液經(jīng)濃縮以及冷凍干燥得到中性?shī)A竹桃粗寡糖JZTOA;和
d.寡糖純化取中性?shī)A竹桃粗寡糖JZTOA,水溶解，離心，上清 液通過SephadexG-25柱進(jìn)行分離，以蒸餾水洗脫，辟u酸-苯酚檢測(cè)，收 取合并洗脫液，如此反復(fù)分離得到夾竹桃寡糖純產(chǎn)物JZTOA-l;
取中性?shī)A竹桃粗寡糖JZTOA,水溶解，離心，上清液通過 Bio-GelP-2柱進(jìn)行分離，以蒸餾水洗脫，硫酸-苯酚檢測(cè)，收取合并洗 脫液，如此反復(fù)分離得到夾竹桃寡糖純產(chǎn)物JZTOA-2。
兩種寡糖純產(chǎn)物JZTOA-l和JZTOA-2經(jīng)ESI-MS分析表明其分子 量分別為1800Da和828Da。將其進(jìn)行糖組成分析，即將寡糖完全水解、 還原、乙?；⑤腿?、濃縮后送入GC分析。糖組成分析結(jié)果顯示， 這兩種寡糖為半乳寡聚糖。然后用碘曱烷進(jìn)行反應(yīng)至寡糖完全曱基化， 再完全酸水解、還原、乙?；?、萃取、濃縮后用GC-MS分析。結(jié)合核 磁共振分析(參見圖1和2)和甲基化結(jié)果，確定這兩種寡糖是以風(fēng)1—4) 連接的直鏈半乳糖。
本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的 內(nèi)容。


圖1為夾竹桃寡糖JZTOA-l的UCNMR譜圖2為夾竹桃寡糖JZTOA-2的13C NMR譜圖3為夾竹桃寡糖JZTOA-l與JZTOA-2對(duì)HMEC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑 制作用的示意圖，其中，圖3A表示正常HMEC-1細(xì)胞；圖3B表示加 入JZTOA-l(20 pM)后的HMEC-1細(xì)胞；且圖3C表示加入JZTOA-2(200 pM)后的HMEC-1細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
a. 多糖提取
千燥的夾竹桃花，用95%的乙醇脫脂一周，然后室溫自然干燥。 干燥后的夾竹桃花961 g用沸水20升提取5次，每次6小時(shí)。硫酸-苯酚檢測(cè)至無明顯反應(yīng)，過濾，將每次的提取液合并后加熱濃縮至3 升，冷卻后加入約500g三氯乙酸使其最終濃度為15%,在4。C下脫蛋 白，1 mol/L NaOH中和至pH值為7.0,然后對(duì)流動(dòng)水透析72小時(shí)， 透析袋內(nèi)部的溶液濃縮至2升體積，在攪拌下加入三倍體積6升的95% 乙醇，靜置過夜，傾去上清液，離心分離，所得沉淀用2倍體積的無 水乙醇洗滌，離心分離，沉淀置40。C下真空干燥，得水提夾竹桃粗多 糖JZTP 65 g。
b. 多糖水解
取上述制備的水提夾竹桃粗多糖JZTP 5 g,加入100 mL的0.2 M 的三氟乙酸(TFA)， 100。C條件下水解4小時(shí)。反應(yīng)完畢后3次加入曱 醇，每次約60mL,減壓濃縮至干，以完全去除TFA。加入500 mL蒸 餾水溶解，再加入3倍體積的95%乙醇，靜置過夜，離心分離，上清 液經(jīng)減壓濃縮得夾竹桃粗寡糖JZTO 2.4 g。
c. 寡糖分離
取上述制備的夾竹桃粗寡糖JZTO 2.4 g， 30 mL水溶解，離心除去 不溶物，上清液通過Cr型DEAE-纖維素柱進(jìn)行初步分離。以蒸餾水洗 脫，硫酸-苯酚法繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收取合并洗脫液。洗脫 液經(jīng)濃縮以及冷凍干燥后1.66 g，加入25 mL蒸餾水溶解并離心，上 清液用l:l(質(zhì)量比)的活性炭與硅藻土為栽體進(jìn)行柱層析分離，逐步以 蒸餾水，5%乙醇溶液，50%乙醇溶液洗脫，疏酸-苯酚法繪制洗脫曲線，
7根據(jù)洗脫曲線分別收取合并洗脫液，其中50%乙醇洗脫液經(jīng)濃縮以及 冷凍干燥得到中性?shī)A竹桃粗寡糖JZTOA 803 mg。 d.寡糖純化
取上述制備的中性?shī)A竹桃粗寡糖JZTOA0.4g, 10mL水溶解，離 心除去不溶物，上清液通過Sephadex G-25柱進(jìn)行分離。以蒸餾水洗脫， 硫酸-苯酚檢測(cè)，畫出洗脫曲線，依據(jù)洗脫曲線分別收取合并洗脫液， 如此反復(fù)分離得到夾竹桃寡糖純產(chǎn)物JZTOA-l 29.1 mg;
取中性?shī)A竹桃粗寡糖JZTOA 0.3g, 10 mL水溶解，離心除去不溶 物，上清液通過Bio-GelP-2柱進(jìn)行分離。以蒸餾水洗脫，碌^酸-苯酚檢 測(cè)，畫出洗脫曲線，依據(jù)洗脫曲線分別收取合并洗脫液，如此反復(fù)分 離得到夾竹桃寡糖純產(chǎn)物JZTOA-2 28.2 mg。
試驗(yàn)實(shí)施例1:
抗血管生成試驗(yàn)
試驗(yàn)采用HMEC-1細(xì)胞(人微血管內(nèi)皮細(xì)胞，Human Microvascular Endothelial Cell),在含10%胎牛血清的MDCB131(Gibico公司)完全培 養(yǎng)液(內(nèi)含2 mM谷氨酸，10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子EGF, 100 U/mL青 霉素和100lag/mL鏈霉素)中，于37。C, 5%0)2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。
將Matrigel基質(zhì)膜(BD Biosciencs， MA， U.S.A.)、槍頭和96孔微量 培養(yǎng)板放于4。C預(yù)冷，過夜。次日加入融化的Matrigel50pd/孔,37。C放 置45分鐘至1小時(shí)將其凝固。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMEC-1細(xì)胞(4 x 10VmL)接種于96孔培養(yǎng)板，每孔90(iL，并加入夾竹桃寡糖ZJTOA-l 和2樣品，每孔lOjnL, JZTOA-l的最終濃度分別為2mM， 20 fxM, 200 HM, JZTOA-2的最終濃度200|oM，并設(shè)定空白對(duì)照(即未加入任何抑 制劑，只加入等量培養(yǎng)基)，每個(gè)濃度設(shè)三復(fù)孔。細(xì)胞于37。C, 5%C02 潮濕條件下培養(yǎng)16小時(shí)后，觀察比較微管形成，并用Olympus DP-70(曰本)熒光倒置顯微鏡拍照，分辨率1360 x 1024。
由圖3可見，HMEC-1細(xì)胞在空白對(duì)照中，已形成管腔。當(dāng) JZTOA-l濃度為20 pM時(shí)管腔形成完全抑制，而JZTOA-2濃度為200 pM時(shí)部分抑制管腔形成。因此結(jié)果表明本發(fā)明的夾竹桃寡糖對(duì) HMEC-1細(xì)胞具有明顯抑制作用。
在腫瘤的轉(zhuǎn)移或生長(zhǎng)過程中，存在新血管生成現(xiàn)象。新生成的血 管為胂瘤細(xì)胞提供充分的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，因此抑制新血管的生成可以切 斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。因此本 發(fā)明的夾竹桃寡糖可用于制備抗腫瘤藥物。
權(quán)利要求
1、兩種夾竹桃寡糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別為β-D-Galp-(1→[4)β-D-Galp(1→]84)-β-D-Galp↑ *GalpJZTOA-1和β-D-Galp-(1→[4)β-D-Galp(1→]24)-β-D-Galp↑ *GalpJZTOA-2其中，*Galp為具有還原末端的半乳糖，所述夾竹桃寡糖的分子量分別為1800Da和828Da。
2、 一種制備如權(quán)利要求1所述的夾竹桃寡糖的方法，該方法是首 先從夾竹桃花中提取多糖，再經(jīng)水解、分離、純化而制得所述夾竹桃 寡糖的。
3、 如權(quán)利要求2所述的制備夾竹桃寡糖的方法，該方法包括以下 步驟a. 多糖提取干燥的夾竹桃花經(jīng)乙醇脫脂、水提，過濾并將所得 濾液濃縮，再經(jīng)15%三氯乙酸脫蛋白，中和，透析，濃縮，醇沉，離 心，真空干燥得水提夾竹桃粗多糖；b. 多糖水解向所述水提夾竹桃粗多糖中加入酸，在100。C條件 下水解，然后加入曱醇，減壓濃縮，蒸餾水溶解，醇沉，離心，上清 液經(jīng)減壓濃縮得夾竹桃粗寡糖；c. 寡糖分離將所述夾竹桃粗寡糖用水溶解、離心，用Cr型DEAE-纖維素為載體進(jìn)行柱層析初步分離，再用質(zhì)量比1:1的活性炭與硅藻土 為載體進(jìn)行柱層析分離，用蒸餾水以及有機(jī)溶劑與水的混合液依次洗 脫，洗脫液經(jīng)濃縮及冷凍干燥得到中性?shī)A竹桃粗寡糖；和 d.寡糖純化所述中性?shī)A竹桃粗寡糖通過下述層析 經(jīng)SephadexG-25柱反復(fù)分離得到夾竹桃寡糖純產(chǎn)物JZTOA-l;經(jīng) Bio-GelP-2柱反復(fù)分離得到夾竹桃寡糖純產(chǎn)物JZTOA-2。
4、如權(quán)利要求1所述的夾竹桃寡糖在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩種從夾竹桃花中獲得的寡糖及其制備方法和用途。具體而言，這兩種寡糖是首先從夾竹桃花中提取多糖，再經(jīng)水解、分離和柱層析純化制得的。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明，這兩種寡糖具有明顯的抗血管生成作用，有望成為抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101613414SQ200810039658
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者侃 丁, 芹 劉, 碩 王, 珂 胡 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所