前膠原IIA缺乏小鼠本申請(qǐng)要求2004年7月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/591,935的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此通過(guò)引用結(jié)合于本申請(qǐng)中。在本申請(qǐng)的全文中引用了不同的出版物。對(duì)于這些出版物的全部引用可于權(quán)利要求書的前面看到。這些出版物的公開內(nèi)容在此通過(guò)引用結(jié)合于本申請(qǐng)中，以便更加全面地描述在本文描述和要求的本發(fā)明之日前的本領(lǐng)域現(xiàn)狀。發(fā)明背景心臟病猝死(SCD)是主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在美國(guó)35歲以上人群中因心臟病所致死亡高達(dá)63％。1而急性缺血性心臟疾病是此人群中SCD的主要病因，但是青少年和40歲以下的青壯年猝死的最常見病因之一是肥厚型心肌病(HCM)。其它較少發(fā)生的病因包括畸形的冠狀動(dòng)脈、Marfan’s綜合征、致心律失常的右心室發(fā)育異常、心肌炎、主動(dòng)脈瓣膜狹窄和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。HCM是遺傳性心肌疾病，在沒(méi)有繼發(fā)病因時(shí)，存在具有非擴(kuò)張的、高動(dòng)力性腔室(hyperdynamicchamber)的不對(duì)稱的或?qū)ΨQ的左心室肥大。它同樣地侵襲男性和女性，以高度可變化的臨床過(guò)程、不同的病理學(xué)和復(fù)雜的遺傳表達(dá)為特點(diǎn)。依靠潛在的(underlying)突變，在疾病譜的一個(gè)極端方面，HCM可與正常長(zhǎng)壽共存，但在另外一個(gè)極端方面，它是青年運(yùn)動(dòng)員中SCD的最常見的病因。SCD的病因被假定為源于電不穩(wěn)定性心肌基質(zhì)的復(fù)合的心室心動(dòng)過(guò)速或纖維性顫動(dòng)，但也提示有心動(dòng)過(guò)緩和嚴(yán)重梗塞。對(duì)HCM中的SCD的預(yù)防仍然是臨床醫(yī)師的主要挑戰(zhàn)。在第三期中心(tertiarycenters)，已有報(bào)告使用可植入的心復(fù)律除顫器(cardioverterdefibrillator)(ICD)是有用的，但患者可仍然罹患伴有血栓栓塞性卒中風(fēng)險(xiǎn)的晚期心力衰竭和心房纖維性顫動(dòng)。3，4HCM的病理模型對(duì)于了解HCM的發(fā)展和SCD的病因?qū)⑹潜匦璧模瑢?duì)于預(yù)防和治療將是重要的。當(dāng)前，已知的疾病基因占所有家族性肥厚型心肌病病例的約50-70％。5人的大多數(shù)原發(fā)性心肌病，無(wú)論是肥厚型或擴(kuò)張的，都是由于收縮性蛋白質(zhì)、細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)或間隙連接蛋白質(zhì)的突變，在大多數(shù)病例中是結(jié)構(gòu)性缺損的直接結(jié)果。心臟細(xì)胞外基質(zhì)起著多項(xiàng)重要的功能作用，如同基質(zhì)之于細(xì)胞粘附和支撐，如同信號(hào)之于細(xì)胞生存，如同貯主(reservoir)之于生長(zhǎng)因子，并且作為組織機(jī)械學(xué)(mechanics)的主要決定因素。膠原是哺乳動(dòng)物心臟中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分并表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)(dynamic)表達(dá)模式和在發(fā)育過(guò)程中和在病理?xiàng)l件下同種型(isoform)多樣性。5在成年心肌中，I型膠原占總膠原的80％，與III型膠原一起形成支持個(gè)體心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的纖維狀膠原網(wǎng)絡(luò)，和組織肌肉束、傳導(dǎo)系統(tǒng)和冠狀脈管系統(tǒng)進(jìn)入粘性的收縮性單位。相反地，III型膠原是新生大鼠心臟中的主要成分，約占總膠原含量的三分之一，并且因此其粘彈性不同于成年心肌。在右心室肥大的嚙齒動(dòng)物模型中，I型和III型膠原的比率有顯著改變。9，10II型和VIII膠原在心臟發(fā)育過(guò)程中短暫表達(dá)并已涉及心臟形態(tài)發(fā)生中。盡管II型膠原通常是軟骨特有的，已經(jīng)顯示在小鼠胚胎發(fā)生過(guò)程中有非常廣泛的組織分布。小鼠αl(II)膠原基因(Col2a-1)在許多非軟骨組織中短暫表達(dá)，諸如脊索、神經(jīng)視網(wǎng)膜、尾腱、心臟、外胚層表面、顱蓋的間充質(zhì)、胎腦、內(nèi)耳的感覺上皮細(xì)胞和形成肢芽的頂外胚層脊(apicalectodermalridge)(AER)。對(duì)外顯子2的可選的剪接產(chǎn)生或者包括(IIAmRNA)或排除(IIBmRNA)此外顯子的II型前膠原mRNAs。IIA型mRNA在9.5天胚胎的心房和心室的外心膜細(xì)胞中均含量豐富，但是在10.5天即迅速減少。12.5天后，IIBmRNA水平迅速升高并最后超過(guò)IIAmRNAs。到了16.5天，IIBmRNAs是主要的Col2a-1轉(zhuǎn)錄物，主要在成熟軟骨細(xì)胞中表達(dá)。13自一家醫(yī)院的尸檢分析顯示，在2例II型膠原疾病的軟骨發(fā)育不良(hypochondrogenesis)的嬰兒心臟隔膜(septation)中發(fā)現(xiàn)缺損。至今尚未明確，IIA型膠原是如何對(duì)心臟形態(tài)發(fā)生起作用的，但近期的研究提示，它可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子。眾所周知，包含在IIAmRNA中的II型膠原基因(Col2a-1)的外顯子2，編碼在前-α1(II)膠原鏈的氨基-前肽中的富含半胱氨酸的球形域。在體外試驗(yàn)中顯示，所述富含半胱氨酸的域結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白(如BMP2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1。TGF-β1和BMP-2屬于調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和分化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族。如同TGF-β超家族的其它成員(TGF-β/活化素/結(jié)節(jié)和BMP/GDF/MIS亞家族)，它們不同的生物學(xué)作用是通過(guò)形成I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復(fù)合物，II型受體將I型受體磷酸化和隨后活化Smad蛋白而介導(dǎo)的。受體激活的Smads(R-Smads，Smads1-3、5、8)由I型受體激酶磷酸化，與共同的介體Smads(co-Smads，Smad4)形成異聚復(fù)合物，并易位核中，在那里它們與特定的轉(zhuǎn)錄因子和輔調(diào)節(jié)因子(co-regulators)相互作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。R-Smads2和3應(yīng)答于TGF-β亞家族，而R-Smads1、5和8主要應(yīng)答于BMP亞家族。兩種抑制性Smads(1-Smad)，Smad6和Smad7，通過(guò)與Smad4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活化的R-Smads負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β/BMP信號(hào)傳導(dǎo)，抑制R-Smads的磷酸化，或靶向所述受體使其降解。16，17TGF-β1和BMP-2在心臟發(fā)育的多個(gè)不同方面，特別是在心肌細(xì)胞分化、瓣膜發(fā)生和流出道和隔膜的發(fā)育方面，均起重要的作用。18-21TGF-β1在出生后的心臟中發(fā)揮不同的生物學(xué)活性。它控制主要組織相容性復(fù)合物的表達(dá)，減少由心臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型，導(dǎo)致心臟肥大和增強(qiáng)β-腎上腺素能的信號(hào)傳導(dǎo)。關(guān)于在出生后哺乳動(dòng)物心臟中的BMP-2作用的信息有限。在新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)中，BMP-2通過(guò)激活Smadi途徑發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用和通過(guò)激活磷脂酰肌醇3激酶途徑增強(qiáng)收縮性。22，23臨床上，原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓，一種肺動(dòng)脈中內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的增生加強(qiáng)的疾病，與作用BMP(BMPR-II)的II型受體的突變相關(guān)聯(lián)。24，25近期在Marfan綜合征鼠科動(dòng)物模型的研究也顯示，細(xì)胞外基質(zhì)，在本例中，微纖維蛋白，在調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的活性作用。26，27在人擴(kuò)張的心肌病中，增強(qiáng)的肌束膜的纖維化與I型，III型和VI型膠原含量的增加有關(guān)，V型膠原在心肌的細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中增加。II型膠原在正常心臟或擴(kuò)張的心肌病中不表達(dá)。28II型膠原在肥厚型心肌病人中是否異常表達(dá)還有待研究。多種心肌病和改變收縮性的小鼠模型集中在導(dǎo)致前述的蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、涉及鈣代謝的調(diào)節(jié)蛋白的突變上，和集中在腎上腺素能受體亞單位的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)上。雖然基質(zhì)缺損通常不被認(rèn)為是心肌病可能的病因，細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)組織模型和心肌細(xì)胞分化的概念并不新穎。甚至在伴有III型膠原的定向去除的小鼠中，沒(méi)有心臟異常，且猝死是由于主動(dòng)脈破裂。29因此，在本申請(qǐng)所述的成年191-IIA突變小鼠是用于研究可突然發(fā)生的心肌病誘的導(dǎo)死亡的非常重要的模型。Taussig-Bing畸形(TBA)是罕見的但復(fù)雜的先天性心臟病，其包括伴肺動(dòng)脈下心室隔膜缺損(VSD)的右心室雙出口(DORV)。主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干移位。TBA是僅次于法樂(lè)氏四聯(lián)癥(TetralogyofFallot)的DORV的最常見的變型?；糡BA的嬰兒常常表現(xiàn)充血性心力衰竭和肺動(dòng)脈高壓。其診斷是合并相關(guān)聯(lián)的血管缺損諸如冠狀動(dòng)脈畸形、主動(dòng)脈下狹窄、主動(dòng)脈弓縮窄或中斷。目前推薦的治療是在單次手術(shù)中完全糾正，特別是包括動(dòng)脈調(diào)轉(zhuǎn)手術(shù)，VSD修補(bǔ)，主動(dòng)脈梗阻的矯正性修補(bǔ)和畸形的冠狀動(dòng)脈的移位。因此，對(duì)于這些血管缺損的詳細(xì)繪圖對(duì)矯正性手術(shù)的成功至關(guān)重要。TOGA是最常診斷的新生兒紫紺性心臟缺損復(fù)合癥(ref)和包含心室大動(dòng)脈不協(xié)調(diào)(ventriculoarterialdiscordance)。人TBA或TOGA的遺傳學(xué)集中在有關(guān)左-右不對(duì)稱或內(nèi)臟異位綜合征的候選基因上。三個(gè)人類基因的突變與TOGA相關(guān)：鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZIC3{DigiIio，M.C.等.Completetranspositionofthegreatarteries：patternsofcongenitalheartdiseaseinfamilialprecurrence.Circulation104，2809-14(2001).}{Belmont，J.W.，Mohapatra，B.，Towbin，J.A.&Ware，S.M.Moleculargeneticsofheterotaxysyndromes.CurrOpinCardiol19，216-20(2004).}、CFC1(humanCRYPTICgene){Goldmuntz，E.等.CFC1mutationsinpatientswithtranspositionofthegreatarteriesanddouble-outletrightventricle.AmJHumGenet70，776-80(2002).}和PROSIT240{Muncke，N.等.MissensemutationsandgeneinterruptioninPROSIT240，anovelTRAP240-likegene，inpatientswithcongenitalheartdefect(transpositionofthegreatarteries).Circulation108，2843-50(2003).}。這些臨床發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在用基因技術(shù)去除(geneticablation)Zic3的小鼠模型{Purandare，S.M.等.Acomplexsyndromeofleft-rightaxis，centralnervoussystemandaxialskeletondefectsinZic3mutantmice.Development129，2293-302(2002).}、潛在的(EGF-CFC){Gaio，U.等.Aroleofthecrypticgeneinthecorrectestablishmentoftheleft-rightaxis.CurrBiol9，1339-42(1999).}和TRAP220{Ito，M.，Yuan，C.X.，Okano，H.J.，Darnell，R.B.&Roeder，R.G.InvolvementoftheTRAP220componentoftheTRAP/SMCCcoactivatorcomplexinembryonicdevelopmentandthyroidhormoneaction.MolCell5，683-93(2000).}中得到驗(yàn)證。在此，發(fā)明人描述在C57/BL6遺傳背景上帶有IIA突變的小鼠，是TBA和TOGA的新的小鼠模型。在人COL2A1基因中的突變是顯性的，導(dǎo)致具有從出生前致死到輕微畸形的嚴(yán)重的疾病譜的軟骨發(fā)育異常。在外顯子2中的顯性的突變已在施蒂克勒綜合征(SticklerSyndrome)和還伴有眼睛缺損的瓦格納氏綜合征(Wagner′sSyndromes)中被發(fā)現(xiàn){Richards，A.J.等.COL2A1exon2mutations：relevancetotheSticklerandWagnersyndromes。BrJOphthalmol84，364-71(2000).}{VanDerHout，A.H.等.OccurrenceofdeletionofaCOL2A1alleleasthemutationinSticklerSyndromeshowsthatacollagentypeIIdosageeffectunderliesthissyndrome.HumMutat20，236(2002).}{Donoso，L.A.等.Identificationofastopcodonmutationinexon2ofthecollagen2A1geneinalargesticklersyndromefamily.AmJOphthalmol134，720-7(2002).}{Donoso，L.A.等.ClinicalvariabilityofSticklersyndrome：roleofexon2ofthecollagenCOL2A1gene.SurvOphthalmol48，191-203(2003).}{Gupta，S.K.，Leonard，B.C.，Damji，K.F.&Bulman，D.E.Aframeshiftmutationinatissue-specificalternativelysplicedexonofcollagen2A1inWagner′svitreoretinalvitreoretinaldegeneration.AmJOphthalmol133，203-10(2002).}。然而，沒(méi)有紫紺性先天性心臟缺損的報(bào)告或與Col2a1基因突變系統(tǒng)性相關(guān)。僅有一例來(lái)自一家醫(yī)院的尸檢研究報(bào)告，2個(gè)患II型膠原疾病的軟骨發(fā)育不良的嬰兒的心臟隔膜缺損{Potocki，L，Abuelo，D.N.&Oyer，CE.Cardiacmalformationintwoinfantswithhypochondrogenesis.AmJMedGenet59，295-9(1995).}。鑒于未治療的紫紺性先天性心臟病的發(fā)病率和死亡率臨床意義重大，IIA前膠原可作為新的標(biāo)記用于先天性心臟病復(fù)合癥的出生前篩查。作為在心臟形態(tài)發(fā)生中BMP依賴的Nkx2.5表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，IIA前膠原可作為用于心肌再生療法的生長(zhǎng)因子的新的傳遞系統(tǒng)。了解這些心血管缺損在IIA無(wú)效突變體中的細(xì)胞機(jī)制，對(duì)闡明治療或預(yù)防紫紺性心臟疾病復(fù)合癥的新策略將是極為重要的。發(fā)明概述本發(fā)明提供兩個(gè)系的經(jīng)遺傳工程改造的小鼠，其中前膠原IIA基因的外顯子2與loxP序列側(cè)翼鄰接(flanked)，并且該外顯子2通過(guò)與表達(dá)Cre-重組酶的雜交小鼠而缺失。外顯子2的缺失導(dǎo)致IIA轉(zhuǎn)錄物的缺失。這進(jìn)而導(dǎo)致心血管缺損的雙重表現(xiàn)，其中一個(gè)主要是C57/BL6遺傳背景的譜系死于嚴(yán)重的先天性心臟病(IIA-/-)，而在遠(yuǎn)系繁殖的遺傳背景(C57BL6/ICR/129)下的另一個(gè)譜系發(fā)展為以心肌細(xì)胞肥大、雜亂排列(disarray)和瓣膜纖維化(191-IIA)為特征的肥厚型心肌病。本發(fā)明提供篩選用于減少肥大、雜亂排列和纖維化的藥物的方法，以及通過(guò)將所述藥物給予或者191-IIA成年小鼠或者IIA-/-突變的胚胎減少心血管形成模式結(jié)構(gòu)的缺損。這樣的藥物可以是合成的或天然發(fā)現(xiàn)的激素、生長(zhǎng)因子、肽類或由適合用于基因轉(zhuǎn)移的載體攜帶的基因。本發(fā)明還提供從心臟或主動(dòng)脈的原代細(xì)胞培養(yǎng)物和衍生于敲除小鼠的永久的細(xì)胞系。來(lái)自由191-IIA小鼠的永久的或原代細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞，被用于篩選改善或消除肥大、增殖或纖維化過(guò)程的藥物。圖的簡(jiǎn)述圖1191-IIA小鼠的系譜pedigree上欄的框圖概述了191-IIA小鼠中的猝死的自然史。下欄的框圖顯示在這些不同齡的小鼠中發(fā)現(xiàn)的四例心臟肥大的實(shí)例。圖2191.1心臟的H&E染色ACE-來(lái)自野生型小鼠。BDF-來(lái)自191.1雄性鼠，于2個(gè)月齡死亡的ColIIA的純合子無(wú)效突變體。AB-來(lái)自野生型(A)和突變體(B)的心臟的兩室的短軸面圖像。突變體的左心室壁較不致密，因此比野生型的左心室壁厚。CD-右心室(RV)，100x總放大率。在突變體的RV壁厚度增加。EF-側(cè)LV壁，400x總放大率。在野生型中心肌細(xì)胞為大小均勻，而在心肌中顯示平行方向排列(E)，突變體心肌以心肌細(xì)胞肥大和雜亂排列為特征(F)。圖3191.3心臟的H&E染色AC-分別為野生型小鼠的主動(dòng)脈瓣(AV)和二尖瓣(MV)。BD-于3個(gè)月齡死亡的191.3雄性鼠的AV和MV。在突變體中，兩種瓣膜均出現(xiàn)纖維變性。所有的框圖用400x總放大率。比例，一格-20μm。圖4大齡191-IIA小鼠的H&E染色AB-來(lái)自于8個(gè)月齡死亡的254.66雄性小鼠的LV側(cè)壁。注意到多細(xì)胞結(jié)構(gòu)(hypercellularity)。C-254.66的RV。注意到多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和心肌細(xì)胞肥大。D-來(lái)自于15個(gè)月齡死亡的191.29雄性小鼠的LV側(cè)壁。比較圖2F、4A和4B，此小鼠的心肌細(xì)胞并不紊亂無(wú)序。所有框圖用400x總放大率。比例，一格-20μm。圖5IIAmRNA的正常表達(dá)模式和IIA-/-小鼠的繁殖A-正常發(fā)育的心臟中IIAmRNA的不對(duì)稱分布。用IIA-特異性探針制作原位雜交的野生型胚胎的整體標(biāo)本(Wholemount)(WISH)。在2-體節(jié)配對(duì)階段(E8.0)，IIAmRNA在心半月瓣(cardiaccrescent)中有很強(qiáng)的表達(dá)。在10-體節(jié)配對(duì)階段(E8.5)，IIAmRNA在初始心臟管道回路(loopingprimitivehearttube)中仍有很強(qiáng)的表達(dá)。在27-體節(jié)配對(duì)階段(E9.5)，IIAmRNA在心球(bulbouscordis)和流出道中，接著是在左心室中表達(dá)最高，在流入道(心房)中發(fā)現(xiàn)最低水平。B-Col2a1定位和目標(biāo)載體的示意圖，其中外顯子2被插入由loxP位點(diǎn)側(cè)翼連接的Neo基因中斷(disrupted)。所述Neo基因隨后被Cre-介導(dǎo)的重組切除。C，D，E-靶向性缺失分別由DNA印跡法、RT-PCR和WISH證實(shí)。圖6新生鼠IIA-/-突變體中的血管缺損從左至右，顯示從胸的頭端至尾端的橫斷面?？驁D(A-C)來(lái)自WT新生小鼠?？驁D(D-L)來(lái)自IIA-/-突變體。A，B-在WT，肺動(dòng)脈(p)起自右心室(rv)和位于主動(dòng)脈(a)的前面和頭端。主動(dòng)脈彎向氣管(t)的左側(cè)和產(chǎn)生右鎖骨下動(dòng)脈(rs)和右頸動(dòng)脈(rc)、左頸動(dòng)脈(c)和左鎖骨下動(dòng)脈(Is)。C-心房間隔膜將右和左心房(箭頭處)分隔開，而心室間隔膜(ivs)將左心室(Iv)與右心室(rv)分隔開。注意右心室壁比左心室壁薄。D-F-伴DORV的不完全TOGA的實(shí)例，和肺動(dòng)脈下的VSD。D-在IIA-/-突變體中，產(chǎn)生頭部血管的主動(dòng)脈(a)，在肺動(dòng)脈(p)的前面?；蔚墓跔顒?dòng)脈(星號(hào)*)起自升主動(dòng)脈。E-冠狀動(dòng)脈離開(箭頭)之處的主動(dòng)脈(a)，完全起自RV。大動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(pda)連接左降主動(dòng)脈(da)。F-肺動(dòng)脈(p)在主動(dòng)脈的尾端并且均起自LV和RV。肺瓣膜(pv)正覆蓋瓣膜下心室隔膜缺損(箭頭處)。G-完全TOGA的實(shí)例，此處主動(dòng)脈(a)起自RV。肺動(dòng)脈(p)向尾端和后面易位(transposed)并且完全起自LV。H-...