專利名稱：以空殼病毒為模板制備單分散高分子納米球的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物材料和納米高分子合成技術交叉應用領域，特別是以天然的微生物體為“容器”來制造聚合物納米材料。它可以獲得傳統(tǒng)納米材料制備方法所難以得到的單分散產物，并可望產生大量規(guī)整粒子組裝起來所形成的協同效應。
背景技術：
納米材料的制備多采用溶膠-凝膠法、復合醇鹽法、微乳液法、氣相沉積法、等離子法、原位聚合法、分子離子插層法等。所有這些方法都因為微環(huán)境的漲落，而不能使材料在大小尺寸和外部形狀上完全保持一致。納米粒在粒徑上呈現一個分布，其平均粒徑雖處在納米范圍內，而最大與最小粒徑卻可能有較大的差別，產物實際上是各種尺度粒子的混合物。此外，上述方法制備的納米材料基本上是球形，或者因微環(huán)境的干擾而產生不規(guī)則的類球體?，F有的聚合物微球制備方法大多能提供微米級的顆粒。雖然，人們已經能夠制成納米級的聚合物微球，但一般難以控制粒徑的均一程度。制備不同數量級的超細顆粒通常需要不同的操作手段，或者需要極其精確和苛刻的反應條件才能完成。
在自然界，存在著一些具有規(guī)則的微型結構的物質。例如，C60的類似足球的籠形結構，碳納米管的管狀結構，環(huán)糊精和杯芳烴的杯子結構，冠醚和環(huán)肽的環(huán)狀結構等。但是，它們每一種化合物均只有一種固定的尺寸和形狀，而且有些因尺寸太小而不能作為聚合物合成的模板，還有些因沒有適宜的孔道而難以捕捉和封裝有機分子。
病毒，作為一種天然的半生命體微生物，其大小在10～300nm之間，恰處于納米級的范圍內。病毒粒由中心的核酸(RNA或DNA)和蛋白質外殼所構成。如果除去內部的核酸，不同的病毒大大小小的蛋白質“籠子”可廣泛提供尺寸各異的納米反應容器。研究者可以通過選擇不同的病毒粒來制備指定大小的納米粒子。此外，同種病毒具有完全相同的尺度和形狀，這意味著以同種空殼病毒粒為模板，合成出大小和外形完全相同的納米材料。
如，Meldrum等人發(fā)現儲鐵蛋白可用于空間約束的礦化反應(見Meldrum，F.C.Heywood，B.R.&Mann，S.Science，1992，257522.)。Douglas和Young用病毒粒對無機礦物質鎢酸鹽和釩酸鹽進行了封裝和礦化，并將聚茴香腦磺酸引入空殼病毒中，從而阻礙了病毒粒的礦化(見Douglas，T.&Young，M.Nature，1998，393152)。但這兩種方法僅僅是將現成的物質裝入病毒空腔中，而沒有發(fā)生化學變化。

發(fā)明內容本發(fā)明目的是解決現有技術不能使制備的納米材料在大小尺寸和外部形狀上完全保持一致的問題，提供一種以空殼病毒為模板制備單分散高分子納米球的方法。該方法以結構熟知的植物空殼病毒為模板，在其空腔中進行高分子的合成，制備指定尺寸和形狀、且粒度均一的聚合物納米粒子。
本發(fā)明以空殼病毒為模板制備單分散高分子納米球，該納米球的組成為2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物；共聚物具有交聯結構；外部形狀為球狀；尺寸在納米級范圍內；其具體制備過程如下——病毒自組裝和純化在Tris-鹽酸緩沖液中懸浮0.5～5.0mg/ml的空殼豇豆退綠斑駁病毒外殼蛋白質，在4℃下將懸浮液透析10～20h，使空殼病毒顆粒組裝起來；組裝的混合物載入10～40％蔗糖梯度，并用超速離心轉子在38,000rpm下離心4～6h；梯度分層，收集280nm紫外吸收峰的層份；——單體的封裝在5℃下，在10～20m1的Tris-鹽酸緩沖液(0.05M)中，將25～50mg空殼豇豆退綠斑駁病毒分散在15～24mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、13～21mg的N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和2～4mg的過硫酸鉀-亞硫酸氫鈉溶液中進行孵化3～5h；然后用鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液降低溶液的pH值，并用大量鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液洗滌；樣品隨后載入如前所述的10～40％蔗糖梯度，進行超速離心分離；收集280nm吸收峰的梯度餾分；——聚合物的合成在N2保護下，溫度在5℃下，病毒內部的單體聚合與交聯而固化；升溫至60～80℃，使聚合物熟化；向體系中加入8～12mol/l的尿素；樣品隨后載入如前所述的10～40％蔗糖梯度，進行超速離心分餾，洗滌并濃縮產物，得到單分散高分子納米球。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果由于病毒尺度一般均在納米級的范圍內，將病毒內部的RNA或DNA去除，剩余的蛋白質外殼內就會留下一個空腔，這個空腔具有納米級的體積和特定的形狀，如果使某種單體在這一空腔內聚合，所形成的聚合物在尺度上與病毒空腔吻合，在形狀上與空腔互補；無須精準的反應環(huán)境就可制備出與病毒相匹配的高分子納米粒子。同時病毒是多種多樣的，它們在尺寸和形狀上具有很大的差別，采用本發(fā)明方法可以制備出不同尺寸和形狀的高分子納米粒子。本發(fā)明以二十面體對稱的植物空殼病毒作為制備高分子納米球的模板，在堿性環(huán)境中，衣殼表面有60個直徑約為2nm的孔洞通向病毒內部；在酸性介質中，這些孔道則會閉合起來，可在病毒內部形成相對封閉的聚合體系。單體分子在病毒內部就會以共價鍵連接起來，形成一個完整的網狀結構。這些衣殼可來源于去除核酸基因組的病毒，也可來源于基因工程所表達的衣殼蛋白質的組裝體。采用本發(fā)明方法可以得到與空殼病毒空腔尺寸和形狀相匹配，且粒度均一的聚合物納米粒子。

圖1是以空殼病毒為模板高分子納米球的合成示意圖；圖2是聚合物納米球的透射電子顯微鏡圖像。
具體實施方式
實施例11.病毒自組裝和純化在Tris-鹽酸緩沖液(0.05M)中懸浮0.5mg/ml的空殼豇豆退綠斑駁病毒外殼蛋白質，在4℃下將懸浮液透析15h，使空殼病毒顆粒組裝起來。組裝的混合物載入10％蔗糖梯度，并用超速離心轉子在38,000rpm下離心4h。梯度分層，收集280nm紫外吸收峰的層份。
2.單體的封裝在5℃下，在10ml的Tris-鹽酸緩沖液(0.05M)中，將25mg空殼豇豆退綠斑駁病毒分散在15mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、13mg的N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和2mg的過硫酸鉀-亞硫酸氫鈉溶液中進行孵化3h。然后用鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液(0.05M)降低溶液的pH值，并用大量鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液洗滌。樣品隨后載入如前所述的10％蔗糖梯度，進行超速離心分離。收集280nm吸收峰的梯度餾分。
3.聚合物的合成在N2保護下，溫度在5℃下，病毒內部的單體聚合與交聯而固化。升溫至60℃，使聚合物熟化。向體系中加入8mol/l的尿素。樣品隨后載入如前所述的10％蔗糖梯度，進行超速離心分餾。洗滌并濃縮，得到高分子納米球產物。如圖2所示，將單體染色，以100nm為單位的透射電鏡觀察病毒對聚合物的封裝。
實施例21.病毒自組裝和純化在Tris-鹽酸緩沖液中懸浮1.0mg/ml的空殼豇豆退綠斑駁病毒外殼蛋白質，在4℃下將懸浮液透析10h，使空殼病毒顆粒組裝起來；組裝的混合物載入20％蔗糖梯度，并用超速離心轉子在38,000rpm下離心5h；梯度分層，收集280nm紫外吸收峰的層份；2.單體的封裝在5℃下，在15ml的Tris-鹽酸緩沖液(0.05M)中，將35mg空殼豇豆退綠斑駁病毒分散在20mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、18mg的N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和3mg的過硫酸鉀-亞硫酸氫鈉溶液中進行孵化4h；然后用鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液降低溶液的pH值，并用大量鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液洗滌；樣品隨后載入如前所述的30％蔗糖梯度，進行超速離心分離；收集280nm吸收峰的梯度餾分；3.聚合物的合成在N2保護下，溫度在5℃下，病毒內部的單體聚合與交聯而固化；升溫至70℃，使聚合物熟化；向體系中加入10mol/l的尿素；樣品隨后載入如前所述的20％蔗糖梯度，進行超速離心分餾，洗滌并濃縮產物，得到單分散高分子納米球。
實施例31.病毒自組裝和純化在Tris-鹽酸緩沖液中懸浮5.0mg/ml的空殼豇豆退綠斑駁病毒外殼蛋白質，在4℃下將懸浮液透析20h，使空殼病毒顆粒組裝起來；組裝的混合物載入40％蔗糖梯度，并用超速離心轉子在38,000rpm下離心6h；梯度分層，收集280nm紫外吸收峰的層份；2.單體的封裝在5℃下，在20ml的Tris-鹽酸緩沖液(0.05M)中，將50mg空殼豇豆退綠斑駁病毒分散在24mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、21mg的N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和4mg的過硫酸鉀-亞硫酸氫鈉溶液中進行孵化5h；然后用鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液降低溶液的pH值，并用大量鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液洗滌；樣品隨后載入如前所述的40％蔗糖梯度，進行超速離心分離；收集280nm吸收峰的梯度餾分；3.聚合物的合成在N2保護下，溫度在5℃下，病毒內部的單體聚合與交聯而固化；升溫至80℃，使聚合物熟化；向體系中加入12mol/l的尿素；樣品隨后載入如前所述的40％蔗糖梯度，進行超速離心分餾，洗滌并濃縮產物，得到單分散高分子納米球。
權利要求
1.一種以空殼病毒為模板制備單分散高分子納米球的方法，其特征是該納米球的組成為2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸與N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺共聚物；共聚物具有交聯結構；外部形狀為球狀；尺寸在納米級范圍內；其具體制備過程如下——病毒自組裝和純化在Tris-鹽酸緩沖液中懸浮0.5～5.0mg/ml的空殼豇豆退綠斑駁病毒外殼蛋白質，在4℃下將懸浮液透析10～20h，使空殼病毒顆粒組裝起來；組裝的混合物載入10～40％蔗糖梯度，并用超速離心轉子在38,000rpm下離心4～6h；梯度分層，收集280nm紫外吸收峰的層份；——單體的封裝在5℃下，在10～20ml的Tris-鹽酸緩沖液(0.05M)中，將25～50mg空殼豇豆退綠斑駁病毒分散在15～24mg的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、13～21mg的N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺和2～4mg的過硫酸鉀-亞硫酸氫鈉溶液中進行孵化3～5h；然后用鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液降低溶液的pH值，并用大量鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液洗滌；樣品隨后載入如前所述的10～40％蔗糖梯度，進行超速離心分離；收集280nm吸收峰的梯度餾分；——聚合物的合成在N2保護下，溫度在5℃下，病毒內部的單體聚合與交聯而固化；升溫至60～80℃，使聚合物熟化；向體系中加入8～12mol/l的尿素；樣品隨后載入如前所述的10～40％蔗糖梯度，進行超速離心分餾，洗滌并濃縮產物，得到單分散高分子納米球。
全文摘要
一種以空殼病毒為模板制備單分散高分子納米球的方法。解決現有技術難以制備在尺寸和形狀上完全一致的納米材料的問題。本發(fā)明以二十面體的植物空殼豇豆退綠斑駁病毒為模板，將單體2－丙烯酸氨基－2－甲基－1－丙烷磺酸和交聯劑N，N’－亞甲基雙丙烯酰胺充滿空殼病毒的內部空腔。在病毒的空間限制下進行聚合反應，制備出交聯型聚2－丙烯酸氨基－2－甲基－1－丙烷磺酸高分子化合物。在與空殼病毒脫離后，產物在尺度上具有單分散性，并與病毒內腔直徑相當，且在形狀上與病毒的球形空腔互補。該方法可為利用不同的病毒分子設計指定大小和形狀的納米高分子顆粒提供了一條途徑。
文檔編號C08F220/56GK1800229SQ20051001645
公開日2006年7月12日 申請日期2005年11月29日 優(yōu)先權日2005年11月29日
發(fā)明者黃積濤, 鄭嗣華, 張嘉琪, 黃衛(wèi)洪, 謝秀榮 申請人:天津理工大學