專利名稱：一種聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法。
20世紀(jì)隨著石油化學(xué)工業(yè)的發(fā)展，合成塑料產(chǎn)品同人們的日常生活愈來愈密切，使合成塑料工業(yè)目前成為人類社會經(jīng)濟的一大主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，給人類社會帶來了一定的繁榮。然而化學(xué)合成塑料制品的廢棄物，卻成為地球上一種無法處理的“白色垃圾”，給人類有限的生存環(huán)境帶來嚴(yán)重的污染。因此，尋求一種理想的可被生物降解的塑料來替換石油化學(xué)合成塑料，就顯得極為重要。用微生物生產(chǎn)可降解性塑料----聚羥基烷酸(簡稱PHA)，是替代化學(xué)合成塑料的一類熱塑性材料。
PHA許多微生物在非平衡生長條件下合成的細(xì)胞內(nèi)碳源和能源的貯藏物質(zhì)，其分子通式可表述為 其中m=1,2或3，在大多數(shù)情況下m=1即β-羥基烷酸。n為單體的數(shù)目，R則代表側(cè)鏈，多為不同的鏈長的正烷酸，也可以是支鏈的、不飽和的或帶取代基的烷酸，多數(shù)微生物產(chǎn)生的PHA中的R為甲基即聚β-聚羥基丁酸(poly-β-hydroxybutyrate簡稱PHB)PHB是分布最廣、發(fā)現(xiàn)最早的，是PHA中的主要成員，關(guān)于PHA的分子結(jié)構(gòu)和PHA顆粒狀況方面的大量研究集中于PHB。在PHB中，n=600-2500，分子量為6000-250000。熔點為180℃,PHB分子經(jīng)X-射線分析表明PHB由多個D型3HB單元組成，呈右手α-螺旋結(jié)構(gòu)，螺距為0.596nm，每圈有兩個β-羥基丁酸組成。由于R基的不同，目前已發(fā)現(xiàn)了90多種不同單體組成的PHA，根據(jù)單體中碳原子的數(shù)目可以將PHA分為短鏈PHA,(short-chain-length PHA,scl PHA)，單體為含3-5個碳原子的羥基脂肪酸即PHB和P(HB-CO-HV)(聚β-羥基丁酸與β-羥基戊酸的共聚物)；另一類為中鏈PHA(medium-chain-lengthPHA,mcl PHA)，單體為含6-14個碳原子的羥基脂肪酸。
PHA除具有與化學(xué)合成塑料相類似的理化性質(zhì)外，還具有可完全降解性，其制品同化學(xué)合成塑料一樣，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。但不同的是PHA制品的廢棄物不但可以完全降解，消除“白色污染”，而且降解物還可作為農(nóng)用肥料，對農(nóng)業(yè)發(fā)展大有好處。同時，PHA除具有可完全降解性外，生物合成還賦予它好的生物相容性、光學(xué)活性、壓電性、無毒性和天然性等優(yōu)良性狀。因此，它也是醫(yī)學(xué)上醫(yī)療植入和組織工程用最具應(yīng)用前景的可降解性醫(yī)用高分子材料。因此，PHA的開發(fā)研究一直引起世界科技界的關(guān)注。
目前國外對這一產(chǎn)品的研究，在理論上對微生物合成PHA的遺傳背景、代謝途徑，調(diào)控機制，PHA的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等已研究清楚。而且從應(yīng)用上也獲得了幾株高產(chǎn)PHA的優(yōu)良菌株及這些菌株的小規(guī)模生產(chǎn)工藝。另英國、韓國、美國亦有產(chǎn)品問世。從生產(chǎn)成本上看，目前PHA的生產(chǎn)成本太高，在占領(lǐng)市場上，無法與化學(xué)合成塑料相競爭。因此，降低PHA的生產(chǎn)成本，就成為目前該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵課題。
80年代英國帝國化學(xué)公司(ICI)就工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)PHB的技術(shù)和經(jīng)濟問題評估中，選取固氮菌、甲基營養(yǎng)菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌作為首選菌株，但在評估中，因甲基營養(yǎng)菌PHB產(chǎn)率中等，PHB分子量小，提取較困難，故被放棄；固氮菌雖PHB胞內(nèi)產(chǎn)率高，分子量又大，但由于它生長中還產(chǎn)多糖，而降低了PHB的比產(chǎn)率也被淘汰；最終選擇了真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌。因為該菌株不但PHB含量高，分子量大，而且能利用各種較經(jīng)濟的碳源。自此以后真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌就成為全世界開發(fā)研究生產(chǎn)PHB的主要菌株，于是全世界也掀起了一股真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的研究熱。經(jīng)過十多年的研究，人們以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌為出發(fā)菌株，對PHB的遺傳背景、代謝途徑、調(diào)控機制、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)已研究清楚，使真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌目前成為最具應(yīng)用前景的一株產(chǎn)PHB的優(yōu)良菌株，但其產(chǎn)率仍沒有超過80％。
Page.W.J在Applied and Environmental Microbiology(1992,58:2866-2873)雜志中研究了采用固氮菌以葡萄糖為主要碳源，以戊酸、庚酸、壬酸等為輔助碳源合成P(HB-CO-HV)，以甜菜糖蜜和戊酸為碳源，38h到40h在2.5升發(fā)酵罐中得到19-22g P(HB-CO-HV),HV組分8.5-23mol％。Page.w.J在Appliedand Environmental Microbiology(1993,59:4236-4244)雜志中研究了采用固氮菌以葡萄糖為碳源，加0.1％魚蛋白胨，在2.5升發(fā)酵罐中47h后，PHB占細(xì)胞干重79％，達32克/升；用甜菜糖蜜為碳源36h達66％,PHB為22克/升。
本發(fā)明的目的是提供一種PHA的高積累生產(chǎn)方法，并且使積累的PHA易于提取，以克服現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)率低、成本高的不足。
使用的微生物用來生產(chǎn)本發(fā)明所述的聚羥基烷酸的微生物是①圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)G-3(以下簡稱G-3菌株)，其于1999年5月2日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC N0:M 99006。②巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)G-6(以下簡稱G-6菌株)，已經(jīng)由他人在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC AB92075，此菌株也可以從陜西省微生物研究所獲得。
誘變改造G-3菌株將30℃培養(yǎng)16h的圓褐固氮菌菌液，離心去除上清液，用PH=6.0、0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌菌體2次，再用此緩沖液配成108細(xì)胞/ml菌懸液，加入化學(xué)誘變劑亞硝基胍(NTG)液使終濃度為600μg/ml,30℃水浴處理30min，間歇搖動，離心除去NTG，再用磷酸緩沖液洗1次，重懸在同樣體積的緩沖液中，取1ml懸液加入50X 5min的小試管內(nèi)，將試管置于激光束前方，從側(cè)面照射菌懸液，激光器功率20mw，波長λ=632.8nm，擴束光斑直徑0.3cm，照射距離30cm，照射時間15min，照射后的菌液作適當(dāng)稀釋后涂布平皿，30℃培養(yǎng)28-32h，挑單菌落接斜面，經(jīng)上述誘變重復(fù)多次后，最后通過初篩和復(fù)篩獲得一株產(chǎn)莢膜較弱的突變株，編號為固氮菌G-3菌株，該突變株除上述特性外，還表現(xiàn)出對葡萄糖利用能力減弱，而在蔗糖培養(yǎng)基中生長繁殖速度較快，利用蔗糖能力非常強的特性。
上述圓褐固氮菌G-3的生物學(xué)特性固氮菌G-3在無氮培養(yǎng)基上生長旺盛，菌落為圓形，中凸，初起為乳白色，不粘，不光滑，老令時菌落為淺咖啡色，菌落較粘，有皺紋。G-3菌株發(fā)酵液的粘度比原始固氮菌低，且產(chǎn)生莢膜的時間比原菌株晚10多個小時，菌體易分離。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)G-3菌株與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)G-6菌株混合培養(yǎng)生產(chǎn)聚羥基烷酸，G-6菌株主要是利用G-3菌株在培養(yǎng)過程中積累的多糖進行生長。
混合培養(yǎng)能解決G-3菌株因培養(yǎng)液中還原糖濃度過高，粘度過大而引起的代謝阻遏作用，因為圓褐固氮菌在生長繁殖過程中能產(chǎn)生多糖物質(zhì)作為莢膜的主要組分，在采用圓褐固氮菌進行分批補糖發(fā)酵過程中，補糖量高時上述莢膜物質(zhì)積累增加，將影響發(fā)酵體系的氧和營養(yǎng)物質(zhì)傳遞，而且還原糖過高將引起反饋阻遏，抑制菌的繼續(xù)增殖，而巨大芽孢桿菌G-6在生長繁殖過程中，通過自身的代謝活動能產(chǎn)生一種聚糖酶而分泌到胞外，此酶能將環(huán)境中的聚糖降解成單糖或雙糖，作為芽孢菌自身的營養(yǎng)物質(zhì)而利用，并將多余的糖作為碳源在體外以PHA的形式積累起來。G-3菌株在利用蔗糖的情況下產(chǎn)生的大量聚糖物質(zhì)，可作為G-6菌株生長所需的碳源，而G-6菌株在利用蔗糖物質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)進行繁殖的同時降低了發(fā)酵液的粘度，改善了發(fā)酵液的傳質(zhì)，為G-3菌株解除了生化反應(yīng)的反饋抑制，提高了蔗糖的利用率。
發(fā)酵過程中菌體還原糖濃度隨菌體的生物量的增加而增加，但在培養(yǎng)初期，10h開始補糖并沒有影響到菌體的生物量增加，但當(dāng)菌體培養(yǎng)到28h時還原糖濃度達6％時，補糖只能增加發(fā)酵液的粘度，發(fā)酵無法進行下去，這時菌體的生物量只能達到20g/L左右，這時如果接入G-6菌株，通過菌株繁殖就可利用還原糖而降低發(fā)酵液粘度，使補糖能進一步進行下去，促進菌體生長增加培養(yǎng)過程的生物量。
巨大芽孢桿菌G-6菌株適宜的培養(yǎng)條件。實驗分兩組進行，第一組在BM液體培養(yǎng)基中接入G-6菌株；第二組將G-3菌株在液體固氮菌培養(yǎng)基下培養(yǎng)至26h的培養(yǎng)物滅菌后，接入G-6菌株，兩組均在30℃條件下進行搖床培養(yǎng)，并每隔一定時間測其各組培養(yǎng)物的OD600值，由表1可見，G-6菌株在G-3菌株的滅活培養(yǎng)液中，在無任何碳源物質(zhì)加入的情況下比第一組生長良好，即G-6菌株更適合于在G-3菌株培養(yǎng)液中進行生長繁殖，其碳源可能是G-3菌株在胞外組成莢膜的多糖組分。表1第一組與第二組的結(jié)果對比時間(h) 4.59 12 15 18第一組 1.82.42.83.02.9(OD600值)第二組 1418 20 22 18.8注第二組實驗中接入G-6菌株的PH為6.5，同時補入NH4NO3單獨和混合培養(yǎng)G-3菌株與G-6菌株的生長和PHA的積累。G-3菌株先在2％蔗糖為碳源的液體選擇培養(yǎng)基(以0.1％蛋白胨為氮源)培養(yǎng)至26h，其間分兩次補入1.5g蔗糖，再接入10％G-6菌株種子培養(yǎng)物，同時加0.05％NH4NO3和0.05％蛋白胨培養(yǎng)至42h，對照分別為相同條件下的G-3菌株和G-6菌株的單獨培養(yǎng)。結(jié)果如下表2所示。表2單獨和混合培養(yǎng)G-3菌株與G-6菌株的生長和PHA的積累菌株 培養(yǎng)時間 生物量 PHA含量(％)YX/SRSG-34214.8 80 0.373.2％G-6161.2 21 0.051.5％G-3+G-6 4217.9 81 0.450.24％注YX/S為Yg生物量/g蔗糖，RS還原糖

圖1為混合培養(yǎng)物細(xì)胞形態(tài)；圖2為G-6菌株單獨培養(yǎng)物細(xì)胞形態(tài)；圖3為G-3菌株單獨培養(yǎng)物細(xì)胞形態(tài)；由表2、圖1、圖2和圖3可見，混合培養(yǎng)有利于G-3菌株提高生物量和PHA的轉(zhuǎn)化率。G-6菌株的混合培養(yǎng)物細(xì)胞形態(tài)(圖1)比G-6單獨培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)生長好(圖2)；而G-3菌株在混合培養(yǎng)時由于降低多糖物質(zhì)對其繁殖的抑制作用，并且發(fā)酵液的粘度下降，傳質(zhì)效果改變，有利于其生長繁殖，因此可見，也比單獨培養(yǎng)G-3菌株生長良好，說明這兩株菌具有良好、穩(wěn)定的配伍性，可以建立一種互惠共生關(guān)系。
G-3菌株接入2％的蔗糖培養(yǎng)液中，在30℃、攪拌速度200rpm下培養(yǎng)26h后，接入G-6菌株，接入量為15％，并同時補加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3，向上述混合液中間歇補加30％蔗糖，測殘?zhí)沁_0.2-0.1％，放罐收集菌體，離心、干燥得干菌體，提取PHA。
PHA的提取可以采用以下三種方法1、CHCl3-H2O提取法發(fā)酵液經(jīng)4000rpm,20min離心后，收集細(xì)胞，水洗二次，無水乙醇洗脫一次，90℃干燥至恒重，轉(zhuǎn)至回流提取器中，加入80倍體積的CHCl3溶液，在55℃下攪拌8小時，加入少量蒸餾水，劇烈攪拌1小時，濾膜過濾，收集有機相，減壓濃縮回收CHCl3，濃縮液用冷甲醇沉淀，過濾、棄濾液，過濾產(chǎn)物干燥得PHA純品。
2、NaClO-CHCl3兩相萃取法發(fā)酵液經(jīng)4000rpm，20min離心后，收集細(xì)胞，水洗二次，無水乙醇洗脫一次，90℃干燥至恒重，向菌體中加入25倍體積的NaClO-CHCl3溶液在55℃下攪拌，4000rpm,30min離心，分為三層，用移液管吸取有機相，向有機相中加水，劇烈攪拌30min，靜止使分層，過濾、取有機相，減壓濃縮，濃縮液用冷甲醇沉淀，過濾、棄濾液，自然干燥，得PHA純品。
3、SDS-NaClO法發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)100℃加熱處理1分鐘后，迅速冷卻55℃，水洗三次，然后進行冷凍處理，收集菌體，向菌體中加入1％(W/V)SDS溶液，55℃攪拌下水浴15min，用3倍體積水洗滌，4000rpm離心20分鐘，55℃下加入30％NaClO(V/V)作用30min，立即用10倍體積水洗滌，4000rpm離心20min，得沉淀再次用3倍體積水洗滌，4000rpm離心20分鐘后，干燥得PHA白色粉末。
發(fā)酵過程中參數(shù)檢測分析方法1、還原糖測定方法。使用721分光光度計，使用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法。
2、蔗糖測定方法。Roe比色法。
3、生物量的測定法。
A、菌體濃度發(fā)酵液稀釋后用721分光光度計測600nm處OD值。
B、菌體干重發(fā)酵液經(jīng)離心(4000rpm/min)，再離心水洗1-2次，乙醇離心洗脫一次，90℃恒溫干燥，至恒重，冷卻后稱量。
4、PHA含量的測定法，使用硫酸降解測定PHA法。
A、PHA紫外吸收(209nm)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取系列標(biāo)準(zhǔn)PHB(sigma產(chǎn)品)，經(jīng)100℃15分鐘濃硫酸降解后，等梯度稀釋，在209nm處測定紫外吸收，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
B、樣品的測定稱取干菌體，加濃硫酸100℃作用15分鐘后，稀釋測其209nm的紫外吸收，經(jīng)查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出PHA的濃度，最后計算出PHA占菌體干重的百分含量。
本發(fā)明消除了固氮菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的莢膜多糖物質(zhì)，提高了菌體的生物量，進而增高PHA的比產(chǎn)率，降低了生產(chǎn)成本。運用本混合培養(yǎng)方法生產(chǎn)PHA，菌體量即生物量最多達到53g/L，PHA量達42.4g/L，糖的轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在0.34左右，并且解決了圓褐固氮菌發(fā)酵生產(chǎn)PHA產(chǎn)生多糖，增加粘度而降低PHA的比產(chǎn)率問題。G-6菌株在混合培養(yǎng)中不產(chǎn)芽孢，且胞內(nèi)PHA顆粒要比純培養(yǎng)時大的多，PHA分子量大，達百萬數(shù)量級，且PHA顆粒外無被膜，成熟細(xì)胞壁易破碎，這就使后工序提取變得容易。經(jīng)過分析可能的原因是在混合培養(yǎng)中G-3菌株為G-6菌株提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在混合培養(yǎng)期間無限的延長了G-6菌株的生長對數(shù)期，使G-6菌株無法形成芽孢，而將過剩的碳源物質(zhì)貯存在體內(nèi)形成PHA顆粒。
具體實施例方式1、P(HB-CO-HV)的生產(chǎn)將G-3、G-6菌株分別接入2％蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24h。
取G-3菌株上述培養(yǎng)物，以10％的量接入發(fā)酵罐中，并同時補加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3,30℃、200rpm繼續(xù)培養(yǎng)，其間以30％濃度的蔗糖液進行3次間歇補糖，到34h，向發(fā)酵罐內(nèi)加入0.5％的戊酸，并補糖一次，繼續(xù)培養(yǎng)至42h放罐，收集菌體，采用連續(xù)離心法，得濕菌體。
上述濕菌體經(jīng)100℃加熱處理1分鐘后，迅速冷卻至55℃，水洗三次，然后進行冷凍處理(-20℃)，收集菌體，向菌體中加入1％(W/V)SDS溶液，55℃攪拌下水浴15min，用3倍體積水洗滌，4000rpm離心20分鐘，55℃下加入30％NaClO(V/V)作用30min，立即用10倍體積水洗滌，4000rpm離心20min，得沉淀再次用3倍體積水洗滌，4000rpm離心20分鐘后，干燥得P(HB-CO-HV)白色粉末，計算其產(chǎn)率占干細(xì)胞重量的86％。
2、PHB的生產(chǎn)將G-3、G-6菌株分別接入2％蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24h。
取G-3菌株上述培養(yǎng)物，以10％的量接入發(fā)酵罐中，并同時補加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3,30℃、200rpm繼續(xù)培養(yǎng)，其間以30％濃度的蔗糖液進行3次間歇補糖，繼續(xù)培養(yǎng)至42h放罐，收集菌體，采用連續(xù)離心法，得濕菌體。
采用實施例1的提取方法提取PHB。
A、樣品的定性檢測使用Fx-90Q核磁共振儀測1H譜。
檢測條件溶劑CDCl3；溫度55℃；標(biāo)準(zhǔn)TMS；譜寬100HZ；觀察頻率89.55MHZ；觀察偏置54.3KHZ；重復(fù)時間1秒；累加16 X 15次。
檢測樣品為PHA中的P(HB-CO-HV)產(chǎn)品，HB和HV的比例為74∶26。
B、樣品的分子量測定采用粘度法(烏氏粘度計)。
實驗條件溶液濃度C=0.25mg/ml；溫度30℃；溶劑三氯甲烷，流出時間t0=45秒；溶液流出時間t=124秒(四次平均)計算得PHB分子量M=1.5 X 106。
C、熔點和結(jié)晶度的測定采用差示掃描儀(DERKW-ELMER DSCT)測定PHB熔點為166.35℃；PHB結(jié)晶度為57％。
3、將實施例1或2所得的濕菌體經(jīng)過冷凍預(yù)處理(-20℃)，再干燥，直接用此干菌體注塑或模壓加工化妝品盒和一次性包裝袋，使PHA的成本降至每公斤4美元，只有現(xiàn)報道的世界最低成本每公斤16美元的1/4，且所得產(chǎn)品經(jīng)過槍測符合應(yīng)用要求，其檢測結(jié)果見下表。 以上檢測結(jié)果由西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測所檢測。
權(quán)利要求
1.一種聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法，其特征是采用圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)G-3菌株與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)G-6菌株混合培養(yǎng)生產(chǎn)聚羥基烷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法，其特征是G-3菌株接入2％的蔗糖培養(yǎng)液中，在30℃、攪拌速度200rpm下培養(yǎng)26h后，接入G-6菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法，其特征是G-6菌株的接入量為15％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法，其特征是G-6菌株接入同時補加0.05％蛋白胨和0.05％NH4NO3。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法，其特征是向混合液中間歇補加30％蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚羥基烷酸的生產(chǎn)方法,其技術(shù)特征是:采用圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)G－3菌株與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)G－6菌株混合培養(yǎng)生產(chǎn)聚羥基烷酸。本發(fā)明消除了固氮菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的莢膜多糖物質(zhì),提高了菌體的生物量,進而增高PHA的比產(chǎn)率,降低了生產(chǎn)成本,生物量最多達到53g/l,PHA量達42.4g/l,使PHA的成本降至每公斤4美元,只有現(xiàn)報道的世界最低成本每公斤16美元的1/4。
文檔編號C08G63/00GK1302823SQ0011398
公開日2001年7月11日 申請日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月17日
發(fā)明者董兆麟 申請人:西北大學(xué)