專利名稱：改良的用于制備胺與鄰羥基醛的席夫堿加合物的方法以及基于該物質(zhì)的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域涉及具有改善的穩(wěn)定性和其它預(yù)期性能的、包含胺與醛或酮的席夫堿加合物的有機(jī)分子的合成。本發(fā)明特別涉及以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)大量這類加合產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)而有效的方法。上述技術(shù)領(lǐng)域尤其與具有胺組分的那些加合物有關(guān)，所述胺組分是公認(rèn)在動物和人的治療中有價值的蛋白質(zhì)，其中該加合產(chǎn)物具有改善的與其給藥和藥物動力學(xué)有關(guān)的性能。
本發(fā)明是基于這樣一個出乎意料的發(fā)現(xiàn)上面所述的加合產(chǎn)物可以具有定量收率地以一種容易的、可重復(fù)的和可轉(zhuǎn)置的方法生產(chǎn)，該方法是利用冷凍干燥、噴霧干燥或相關(guān)方法來進(jìn)行基礎(chǔ)反應(yīng)；并使該反應(yīng)混合物的pH保持在7.0或更高；同時要求醛反應(yīng)物選自芳族鄰羥基醛。這一發(fā)現(xiàn)廣泛地適用于所有蛋白質(zhì)反應(yīng)物，所述蛋白質(zhì)反應(yīng)物滿足在下文中更詳細(xì)描述的與它們的實(shí)用性有關(guān)的某些標(biāo)準(zhǔn)。例如，本發(fā)明涉及生產(chǎn)一種豬促生長素和芳族鄰羥基醛即鄰香草醛的席夫堿加合物。豬促生長素是一種用于提高豬的飼料效率的生長激素。
背景技術(shù)：
在與本發(fā)明最相關(guān)的領(lǐng)域中，大家都知道胺化合物，尤其是蛋白質(zhì)，可以通過與醛或酮反應(yīng)來提高它的穩(wěn)定性和加工性能。例如，細(xì)胞色素C已經(jīng)以一種容易逆轉(zhuǎn)的方法與水楊醛反應(yīng)，使得可就電荷修飾對蛋白質(zhì)性能的影響進(jìn)行研究。
與科技文獻(xiàn)中的大多數(shù)描述不同，Williams和Jacobs在《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報》154(1968)323-331中的描述涉及席夫堿加合終產(chǎn)物的分離。使水楊醛和細(xì)胞色素c的混合物沉淀，并可從所用的達(dá)到長期平衡的次數(shù)推斷是否已完全轉(zhuǎn)化。該文獻(xiàn)中涉及的加合物的形成可以用以下部分化學(xué)式來說明 其中伯胺是賴氨酸分子上的ε-氨基，它已與水楊醛分子的羰基部分反應(yīng)形成亞胺，可表示為R-(R-)C=N-R。這類亞胺通常稱之為席夫堿，它們的制備一般用酸或堿催化進(jìn)行，或加熱進(jìn)行。一般通過沉淀亞胺、除去水、或二者結(jié)合來推動席夫堿形成反應(yīng)的完成。
作為本領(lǐng)域中這類應(yīng)用的另一個例子是，鐮狀紅細(xì)胞已用各種醛和酮進(jìn)行處理，從而與細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的氨基形成亞胺鍵。參見Zaugg等人，《生物化學(xué)雜志》252(23)(1977)8542-8548。已發(fā)現(xiàn)芳族醛比它們的脂族對應(yīng)物更具反應(yīng)性，而酮是惰性的。環(huán)取代對這種反應(yīng)性的影響符合關(guān)于電子和位阻效應(yīng)的正常預(yù)期結(jié)果。特別是，2,4-二羥基苯甲醛和鄰香草醛顯著增加了血紅蛋白A和S的氧親和性。然而，沒有提示鄰羥基醛將是在生產(chǎn)與蛋白質(zhì)的席夫堿加合物中獲得定量收率所必需的。
在有關(guān)與胺而不是蛋白質(zhì)(例如小分子藥物)的席夫堿加合物的科技文獻(xiàn)中有幾個偶然的例子。Fujiwara等在《化學(xué)與藥學(xué)通報》30(1982)3310和《化學(xué)與藥學(xué)通報》31(4)(1983)1335-1344中提到了頭孢氨芐(一種抗生素頭孢菌素)和醛的加合物的形成。但是，沒有使用鄰羥基醛的暗示；雖然這些產(chǎn)物是通過將其堿性溶液冷凍干燥而得到的；該參考文獻(xiàn)沒有提示本發(fā)明的制備方法和由此得到的定量收率。
在此以前，席夫堿已在用于確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量以及測量蛋白質(zhì)中的伯氨基位點(diǎn)(N-末端加上賴氨酸殘基)數(shù)目的分析操作中使用。參見例如，Le Blanc等，《分析化學(xué)》66(1994)3289-3296，該文涉及溶液中蛋白質(zhì)-酮平衡的電噴射質(zhì)譜研究。其中使用了丙酮，但未提出使用芳族鄰羥基醛。
電噴射質(zhì)譜分析被用于檢驗大蛋白質(zhì)，例如胰島素、遍在蛋白和血紅蛋白，它也可以與本發(fā)明的方法聯(lián)合使用，以提供一種準(zhǔn)確而又精密的手段來確定席夫堿加合物已形成至何種程度。當(dāng)胺為大蛋白質(zhì)時，用于測定醛和胺之間形成的席夫堿的量的傳統(tǒng)方法是無效的，因為這些技術(shù)通常是溶液方法，并且當(dāng)分離的席夫堿加合物溶于水時，會發(fā)生可逆反應(yīng)而導(dǎo)致一個平衡混合物。不過，Le Blanc使用的是丙酮，而沒有提出使用芳族鄰羥基醛。
席夫堿連接的綴合物已被用作導(dǎo)向蛋白與一種或多種診斷或治療劑之間的接頭。參見例如Reed的US 5,633,351。導(dǎo)向蛋白結(jié)合一個確定細(xì)胞群，諸如受體或酶底物，所述治療劑是一種藥物、毒素或放射性核素，而診斷劑是一種放射性核素。有關(guān)的席夫堿鍵具有以下結(jié)構(gòu) 其中“L1”和“L2”是在一端帶有一個酰肼或醛/酮活性基的異雙功能接頭。但是，沒有暗示在pH≥7.0下使用芳族鄰羥基醛以得到定量收率的席夫堿加合終產(chǎn)物。
Clark等在US 5,198,422中提到了一種用于胃腸外給藥的穩(wěn)定化促生長素，其中提到優(yōu)選的芳族醛是2-羥基-3-甲氧基苯甲醛，即鄰香草醛。然而，Clark等僅提到了當(dāng)產(chǎn)物以結(jié)晶形式分離時所得到的促生長素生長激素的治療益處。雖然一般性地提到使用冷凍干燥進(jìn)行分離，但很清楚，Clark等意圖的分離方法是“干燥”型方法，即涉及長時間干燥的方法，所舉的例子是在真空烘箱中干燥過夜。所以，該參考文獻(xiàn)沒有教導(dǎo)本發(fā)明的制備方法。
在科技文獻(xiàn)中僅有有限的文章涉及通過噴霧干燥制備席夫堿加合物。參見，例如，Tomlinson等，《食品化學(xué)》48(1993)373-379，該文獻(xiàn)提到噴霧干燥葡萄糖和甘氨酸的水溶液。此方法生產(chǎn)出一種可用于食品著色的褐色粉末。所涉及的實(shí)際化學(xué)方法是美拉德反應(yīng)或“棕黃”反應(yīng)，其中蛋白質(zhì)的氨基與糖的羥基反應(yīng)，形成褐色色素。
上述Tomlinson等人提到并以之為基礎(chǔ)的是Baines等的早期工作，見US 4,886,659,該專利也涉及用于食品化學(xué)的有色化合物的生產(chǎn)。Baines等提示，可以從美拉德起始物開始在非常短暫的噴霧干燥反應(yīng)條件下生產(chǎn)出顏料，例如，在所有的水蒸發(fā)而有效地終止反應(yīng)之前的反應(yīng)時間小于10秒，有時小于1秒。
該文中也提到使用一個固定噴嘴或一個旋轉(zhuǎn)圓盤，調(diào)節(jié)它們的設(shè)置以控制液滴大小、干燥顆粒的大小和其它液滴特性。反應(yīng)溫度據(jù)信接近于出口的空氣溫度。還提到預(yù)先加熱水溶液，例如不超過60℃。在加入噴霧干燥器之前，產(chǎn)物的水分含量為3.5-15％重量。還提到了一個旋轉(zhuǎn)圓盤式噴霧干燥器，其圓盤旋轉(zhuǎn)速率為35,000-40,000rpm。
但是，Tomlinson等人和Baines等人沒有提示本發(fā)明的制備方法，因為他們關(guān)注的是美拉德反應(yīng)，這是一個在任何方面都與本發(fā)明方法完全不同的方法。美拉德反應(yīng)通常是不可逆的，它導(dǎo)致低聚物的形成。這些特性限制了美拉德反應(yīng)在深色顏料制備過程中的有用性。
Dhont,《Proc.Int.Symp.Aroma Research,Zeist》(1975)193-194中提到了有關(guān)諸如從大豆蛋白質(zhì)得到的那些合成食品的芳構(gòu)化的工作。其中提到將白蛋白和香草醛的溶液冷凍干燥，這樣，加入的香草醛有大約90％被蛋白質(zhì)結(jié)合，盡管還注意到蛋白質(zhì)通過包封或吸附保留了一些香草醛。其中提出了席夫堿的形成，但是，香草醛不是一種鄰羥基醛，并且反應(yīng)物沒有完全轉(zhuǎn)化成席夫堿。因此，Dhont所采用的方法既不同于本發(fā)明的方法，也沒有對本發(fā)明的方法作出提示。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于制備席夫堿縮合加合終產(chǎn)物的新的改良方法，該終產(chǎn)物的組分包含一種對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)和一種芳族鄰羥基醛。本發(fā)明的制備方法基本上能定量形成縮合加合物并提高終產(chǎn)物的總收率。
本發(fā)明的方法還涉及一種容易的、可重復(fù)的、可轉(zhuǎn)置的、有效而又經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)縮合加合終產(chǎn)物的方法。所述方法包含將上述組分一起混合在pH7.0或更高pH值下的含水環(huán)境中而形成一種反應(yīng)混合物。該反應(yīng)混合物的溶劑是水，即反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)，包括在反應(yīng)過程中形成的縮合的水，所述反應(yīng)發(fā)生在能有效推動所述縮合反應(yīng)實(shí)質(zhì)上完成的條件下，縮合反應(yīng)的實(shí)質(zhì)完成是通過除去在所述縮合反應(yīng)過程中存在的約97.0％-約99.9％重量的水，優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時保持該縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性，而所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
上述縮合反應(yīng)也可以在減少水分的條件下進(jìn)行，由此加快水的去除速率和提高所去除的總量。條件是，與通過除去存在的約97.0％-約99.9％重量的水來推動縮合反應(yīng)完成的目標(biāo)相一致，在縮合加合終產(chǎn)物中所存在的水分的量將相當(dāng)于該終產(chǎn)物重量的3.0％-0.001％，優(yōu)選為2.0％-3.0％重量，以所述終產(chǎn)物的重量計?？s合反應(yīng)完成后，所存在的水分的量可以降至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，或者甚至低至0.03％-0.01％重量，以終產(chǎn)物的重量計。另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性需要時，也可以存在實(shí)質(zhì)上更高含量的水分，該水分的含量在3.0％-20.0％重量范圍內(nèi)，優(yōu)選為5.0％-15.0％重量，更優(yōu)選為8.0％-12.0％重量，以終產(chǎn)物的重量計。
用于上述縮合方法的芳族鄰羥基醛優(yōu)選包含一個或多個下式化合物 其中R1和R4獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2；-S(=O)2N(R7)(R9)；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9和-N(R7)(R9)，其中R7是氫或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中定義R1和R4的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；?；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；和X和Y獨(dú)立地為N，或分別為CHR2或CHR3，其中R2和R3獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氫或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定義R2和R3的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；缓捅?C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；優(yōu)選的是，R1和R4獨(dú)立地為氫；羥基；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR7或-N(R7)(R9)，其中R7是氫或(C1-C2)烷基，R9是(C1-C2)；更優(yōu)選R1和R4獨(dú)立地為氫；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基或甲氨基，在這種情況下R7為氫而R9為甲基。優(yōu)選的是，當(dāng)R1和R4定義為烷基并被取代時，僅有選自以下成員的一個取代基羥基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；更優(yōu)選所述單個取代基選自羥基、甲氧基和二甲氨基。
優(yōu)選的是，X或Y之一為N而另一個分別為CHR2或CHR3；更優(yōu)選X為CHR2,Y為CHR3，其中R2和R3優(yōu)選獨(dú)立地為氫；羥基；鹵素；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR11；-S(=O)2N(R11)(R13)；或-N(R11)(R13)，其中R11優(yōu)選為氫或(C1-C2)烷基，R13為(C1-C2)烷基；更優(yōu)選R2和R3獨(dú)立地為氫；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基；或甲氨基，在這種情況下R11為氫，R13為甲基。
優(yōu)選當(dāng)R2和R3定義為烷基并被取代時，僅有選自以下成員的一個取代基羥基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
首選的是，所述鄰羥基醛包含鄰香草醛；水楊醛；2,3-二羥基苯甲醛；2,6-二羥基苯甲醛；2-羥基-3-乙氧基苯甲醛；或吡哆醛；它們可以用下列結(jié)構(gòu)式表示 鄰香草醛 水楊醛 2,3-二羥基苯甲醛 2,6-二羥基苯甲醛 吡哆醛 2-羥基-3-乙氧基苯甲醛另外，該席夫堿縮合加合終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組分包含一個對動物具有有益活性的肽，所述有益活性包括有作為用于生產(chǎn)食品的動物生長促進(jìn)劑的效用，以及作為用于治療和預(yù)防多種疾病和不利狀態(tài)的獸醫(yī)產(chǎn)品的治療效用。該蛋白質(zhì)組分也具有作為治療和預(yù)防人的疾病和不利狀態(tài)的治療劑的效用。
該蛋白質(zhì)組分在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是伯胺，并可以具有少至兩個氨基酸直到數(shù)百個氨基酸甚至多到上千個以上氨基酸。所述蛋白質(zhì)組分和如本文中規(guī)定形成的縮合加合終產(chǎn)物公認(rèn)具有治療動物和人的價值。
以下特定蛋白質(zhì)尤其適用于本發(fā)明
內(nèi)源性的和合成的蛋白質(zhì)阿片樣止痛劑和拮抗劑，包括腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽，它們是μ、κ和δ阿片樣物質(zhì)受體亞型的選擇性和非選擇性興奮劑和拮抗劑，包括[Leu5]和[Met5]腦啡肽；強(qiáng)啡肽A和B；α-和β-新內(nèi)啡肽；[D-Ala2,MePhe4,-Gly(ol)5]腦啡肽(DAMGO)；[D-Pen2,D-Pen5]腦啡肽(DPDPE)；[D-Ser2,Leu5]腦啡肽-Thr6(DSLET)；[D-Ala2,D-Leu5]腦啡肽(DADL)；D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)；[D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-ol]腦啡肽(FK-33824)；Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]δ啡肽Ⅰ；Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]δ啡肽Ⅱ；Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(morphiceptin)；Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017)；和[D-Ala2,Leu5,Cys6]腦啡肽；內(nèi)分泌物，包括為響應(yīng)選自組織損害、病毒感染和變態(tài)反應(yīng)的炎癥事件而由蛋白水解反應(yīng)產(chǎn)生的緩激肽和胰激肽，其中所述蛋白質(zhì)局部見效而導(dǎo)致疼痛、血管舒張、血管通透性增加和前列腺素合成，其中所述蛋白質(zhì)具有興奮劑和拮抗劑活性，可用于治療男性不育，用于癌癥化療劑越過血腦屏障釋放，和用于治療疼痛、哮喘和其它慢性炎癥疾病，包括Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(緩激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脫-Arg9-緩激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脫-Arg10-胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(脫-Arg9-[Leu8]-緩激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-緩激肽)；和[D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)，其中Hyp是反式-4-羥基-Pro；Thi是β-(2-噻吩基)-Ala；Tic是[D]-1,2,3,4-四氫喹啉-3-基-羰基；Oic是(3as,7as)-八氫吲哚-2-基-羰基；對分別介導(dǎo)加壓應(yīng)答和抗利尿應(yīng)答的加壓素受體亞型V1和V2有效的蛋白質(zhì)，包括在充血性心力衰竭、高血壓、手術(shù)后腸梗阻和腹部膨脹的治療中有益的V1拮抗劑，用于通過控制多尿和煩渴來治療中樞性尿崩癥的V2興奮劑，以及用于治療出血性疾病包括威勒布蘭特病的V2興奮劑，包括特異性天然產(chǎn)生的加壓素樣肽下式表示的精氨酸加壓素(AVP) 和賴氨酸加壓素([Lys8]-AVP)；合成加壓素肽V1a-選擇性興奮劑[Phe2,Ile2,Orn8]AVP；V1b-選擇性興奮劑脫氨基[D-3-(3’-吡啶基)-Ala2]AVP；V2-選擇性興奮劑去氨加壓素(dDAVP)和脫氨基[Val4,D-Arg8]AVP；以及肽拮抗劑，包括下式表示的V1a-選擇性拮抗劑d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP 和V1b-選擇性拮抗劑dp[Tyr(Me)2]AVP；以及V2-選擇性拮抗劑脫Gly-NH29-d(CH2)5[D-Ile2,Ile4]AVP和d(CH2)5[D-Ile2,Ile4,Ala-NH29]AVP；用作胃液分泌的一種指示劑的五肽胃泌素，化學(xué)式為N-叔丁氧羰基-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2；用于治療胃腸道腫瘤的癥狀、其它療法難以治療的腹瀉、能動性障礙和胃腸出血的奧曲肽，化學(xué)式為L-半胱氨酸酰胺-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-羥基-1-(羥甲基)丙基]-，環(huán)(2→7)-二硫化物，[R-(R*,R*)]-；用作免疫抑制劑的抗體試劑，包括抗胸腺細(xì)胞球蛋白；鼠單克隆抗體-CD3單克隆抗體；和Rh0(D)免疫球蛋白；以及用于治療免疫缺損狀態(tài)的蛋白質(zhì)免疫刺激劑，包括免疫球蛋白；由白細(xì)胞產(chǎn)生并具有各種各樣免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，包括干擾素，集落刺激因子和白介素，特別是α-干擾素；干擾素-γ(IFN-γ)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；和白介素-1(IL-1)至白介素-12(IL-12)；涉及調(diào)節(jié)成熟血細(xì)胞不斷被替換的過程的造血生長因子，它們可用于治療原發(fā)性血液疾病，并可在嚴(yán)重感染的治療和對經(jīng)受化療或骨髓移植的病人的處理中用作佐劑，具體包括生長因子，包括紅細(xì)胞生成素(EPO)；干細(xì)胞生長因子(SCF)；白介素(IL-1-12)；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)；P1XY321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)；和血小板生成素；用于溶解病理性血栓和血管損傷部位的血纖蛋白沉積物的溶栓蛋白，包括鏈激酶；組織纖溶酶原激活物(t-PA)；和尿激酶；垂體前葉激素和調(diào)節(jié)它們的使用的下丘腦因子，包含(a)促生長激素，包括生長激素(GH)，促乳素(Prl)和胎盤催乳激素(PL)；(b)糖蛋白激素，包括促黃體素(LH)，促濾泡激素(FSH)和促甲狀腺素(TSH)；和(c)POMC衍生激素，包括促腎上腺皮質(zhì)素(ACTH)，α-促黑激素(α-MSH)，β-促黑激素(β-MSH)，β-促脂解素(β-LPH)和γ-促脂解素(γ-LPH)；調(diào)節(jié)所述激素釋放的下丘腦因子，包括生長激素釋放激素(GHRH)，促黃體素釋放激素(LHRH)，胰島素樣生長因子(IGF-1和IGF-2)，促生長素抑制素和促性腺素釋放激素(GnRH)；用作生長激素缺陷兒童的替代療法的生長激素，包括促生長素抑制素，促生長素抑制素的合成類似物，奧曲肽；用于生殖疾病的診斷和不育癥治療的促性腺激素，包括LH,FSH和絨毛膜促性腺激素(GC)，包括尿促卵泡素，一種用于誘導(dǎo)排卵的基本上已除去了大多數(shù)LH的人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG)，和戈那瑞林，一種用于刺激促性腺激素分泌的合成人GnRH；合成GnRH興奮劑，包括用于治療對性類固醇減少敏感的內(nèi)分泌紊亂的亮丙瑞林，組氨瑞林，那法瑞林和戈舍瑞林；
促甲狀腺素(TSH)，其分泌受促甲狀腺素釋放激素(TRH)的控制，用于甲狀腺機(jī)能減退患者的激素替代療法和非中毒性甲狀腺腫患者或?qū)谞钕侔┻M(jìn)行了治療后的患者的TSH抑制療法；用于治療胰島素依賴性糖尿病患者和非胰島素依賴性糖尿病患者的胰島素；在葡萄糖和酮體代謝的調(diào)節(jié)中具有生理學(xué)作用的胰高血糖素，它可用于治療嚴(yán)重低血糖，也可由放射學(xué)家用于抑制胃腸道；用于阻斷分泌內(nèi)分泌物的腫瘤中的激素釋放的促生長素抑制素，及其合成類似物-奧曲肽，所述腫瘤包括胰島瘤，胰高血糖素瘤，血管活性腸多肽腫瘤，類癌腫瘤和生長激素瘤；降鈣素，一種特定作用于破骨細(xì)胞以抑制骨吸收的激素，它可用于處理高鈣血和增加的骨骼重建疾病，包括佩吉特?。挥糜谥委熂怪怨琴|(zhì)疏松癥患者的甲狀旁腺素；阿地白介素，125-L-絲氨酸-2-133-白介素2，用作抗腫瘤劑和免疫刺激劑；阿糖苷酶，一種497個氨基酸的單體糖蛋白和人胎盤組織β-葡糖腦苷脂酶的修飾型，可用作葡糖腦苷脂酶的補(bǔ)充劑；丙賴促皮質(zhì)肽，一種合成的促腎上腺皮質(zhì)素類似物1-β-Ala-17[L-2,6-二氨基-N-(4-氨基丁基)己酰胺]-α1-17-促腎上腺皮質(zhì)素；阿克伐司，一種527個氨基酸的絲氨酸蛋白酶，其序列與血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的天然的蛋白酶的序列相同，可用作纖溶酶原激活物；阿韋舒托，一種通過基因工程使CD4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的頭178個氨基酸經(jīng)兩個接頭殘基與假單胞菌屬外毒素A的氨基酸1-3和253-613相連而得到的合成嵌合蛋白，可用作抗病毒劑；amlintide，一種37個氨基酸的蛋白質(zhì)，可用作抗糖尿病劑；阿莫胃泌素N-羧基-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-苯基-L-丙氨酸酰胺；anakinraN2L-Met-白介素1受體拮抗劑，可用作治療炎性腸病的非甾族抗炎藥和抑制劑；醋酸阿那立肽，心房肽激素-21(鼠)，N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-，醋酸鹽，用作抗高血壓劑和利尿劑；血管緊張素胺，血管緊張素Ⅱ，1-L-Asn-5-L-Val-，用作血管收縮藥；抑肽酶，一種有58個氨基酸的胰腺胰蛋白酶抑制劑，用作酶抑制劑(蛋白酶)；阿法拉新，1-琥珀酰胺酸-5-L-Val-8-(L-2-苯基甘氨酸)血管緊張素Ⅱ，用作抗高血壓藥；鞣酸精氨加壓素，加壓素，8-L-Arg-，鞣酸鹽，用作抗利尿劑；門冬托星，催產(chǎn)素，4-L-Asn-，用作抗生素，由淺灰鏈霉菌產(chǎn)生；阿托西班，催產(chǎn)素，1-(3-巰基丙酸)-2-(0-乙基-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-，用作一種催產(chǎn)素拮抗劑；阿伏帕星，一種從純白鏈霉菌得到的糖肽類抗生素；basifungin,N-[(2R,3R)-2-羥基-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-別-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-羥基-N-L-MeValα1-內(nèi)酯，用作抗真菌劑；becaplermin，重組人血小板衍生生長因子B，一種在氨基酸組成和生物活性方面與內(nèi)源性人PDGF-BB同型二聚體類似的由基因工程釀酒酵母產(chǎn)生的重組蛋白，用于通過促進(jìn)間充質(zhì)衍生細(xì)胞的增殖來治療慢性皮膚潰瘍；bivalirudin，一種具有20個氨基酸的抗凝劑，抗血栓形成劑；卡貝縮宮素，1-丁酸-2-[3-(對甲氧苯基)-L-Ala]催產(chǎn)素；卡古縮宮素，1-丁酸-6-(L-2-氨基丁酸)-7-甘氨酸催產(chǎn)素；藍(lán)肽，5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-硫代-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-酰胺，用作胃液分泌刺激劑；cetermin，具有112個氨基酸的轉(zhuǎn)化人生長因子β2；cilmostim,1-233-集落刺激因子1(人克隆p3ACSF-69蛋白部分)，環(huán)(7→90),(48→139),(102→146)-三(二硫化物)二聚體，用作生血劑(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)；多粘菌素E甲磺酸鈉，一種用作抗細(xì)菌劑的粘菌素A組分；可的瑞林，ovine triflutate，促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(綿羊)，三氟乙酸鹽，用作腎上腺皮質(zhì)缺乏和庫欣綜合征的診斷助劑，和用作一種促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素；替可克肽，醋酸二十四肽促皮質(zhì)素，α1-24-促腎上腺皮質(zhì)素，用作促腎上腺皮質(zhì)激素；環(huán)孢菌素，一種含有11個氨基酸和在6位上的3-羥基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酰部分的環(huán)蛋白，用作免疫抑制劑；dacliximab(Ro-24-7375)，一種由四個經(jīng)二硫鍵連接的亞單位組成的、分子量約為150kD的人源化抗TAC單克隆抗體，用作免疫抑制劑；daclizumab；達(dá)托霉素，一種蛋白質(zhì)抗細(xì)菌劑；地西盧定，包含63個氨基酸的來自醫(yī)用水蛭的63-脫磺基水蛭素，用作抗凝劑；地洛瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；醋酸去氨加壓素，加壓素，1-(3-巰基丙酸)-8-D-Arg-，一醋酸鹽，三水合物，包含9個氨基酸，用作抗利尿劑；包含10個氨基酸的醋酸地肽利司，用作LHRH拮抗劑；度莫瑞林，27-L-Leu-44a-Gly生長激素釋放因子(人)；依降鈣素，1-丁酸-7-(L-2-氨基丁酸)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala降鈣素(鮭)；emoctakin，有兩個Cys橋的包含72個氨基酸的白介素8(人)；依泊丁α，一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的165個氨基酸的糖蛋白，由已插入了人促紅細(xì)胞生成素基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞產(chǎn)生，用作抗貧血和補(bǔ)血劑；厄索夫明，包含157個氨基酸的重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，是一種從人胎盤分離并在大腸桿菌中克隆和表達(dá)的非糖基化蛋白，用作傷口愈合劑；苯賴加壓素是包含9個氨基酸的加壓素，2-L-Phe-8-L-Lys，用作血管收縮藥；非爾司亭，一種175個氨基酸的單鏈多肽，非糖基化的，由大腸桿菌表達(dá)，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；高血糖素，一種29個氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病藥；醋酸戈那瑞林，包含10個氨基酸的促黃體激素釋放因子醋酸酯的二醋酸鹽，用作性腺促進(jìn)物質(zhì)；戈舍瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；組氨瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；imiglucerase,495-L-組氨酸葡糖神經(jīng)酰胺酶胎盤同工酶蛋白，用作葡糖腦苷脂酶的酶補(bǔ)充劑；胰島素，去丙氨酸的，是一種通過除去胰島素B鏈C-末端的丙氨酸而制得的胰島素衍生物，用作抗糖尿病藥；干擾素α-2a，包含165個氨基酸的干擾素αA(人白細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來源的)，用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；干擾素α-2b，包含165個氨基酸的干擾素α2b(人白細(xì)胞克隆Hif-SN206蛋白質(zhì)部分來源的)，也用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；干擾素β-1a，一種從含有人干擾素β的人工改造基因的培養(yǎng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)的、由166個氨基酸殘基組成的糖基化多肽，也用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；干擾素β-1b，一種從大腸桿菌生產(chǎn)的、由165個氨基酸殘基組成的非糖基化多肽，也用作免疫調(diào)節(jié)劑；干擾素γ-1b,1-139干擾素γ(人淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來源的)，N2-L-Met，用作抗腫瘤劑和免疫調(diào)節(jié)劑；iroplact，包含71個氨基酸殘基、有兩個Cys橋的N-甲硫氨酰血小板因子4(人亞單位)；lanoteplase，一種通過缺失纖連蛋白樣和EGF樣結(jié)構(gòu)域并使Asn117突變?yōu)镚ln117而從人t-PA衍生得到的組織纖溶酶原激活物蛋白，通過在哺乳動物宿主細(xì)胞中編碼肽序列的DNA序列的表達(dá)而制得，用作纖溶酶原激活物和溶栓劑；包含8個氨基酸和一個二硫鍵的醋酸蘭瑞肽，用作抗腫瘤劑；來諾拉提，一種通過表達(dá)來自于人口腔鱗狀上皮細(xì)胞系-mRNA的人粒細(xì)胞集落刺激因子-cDNA而在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的、由174個氨基酸殘基組成的糖蛋白，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；醋酸黃體瑞林，一種包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；莫拉司亭，一種包含127個氨基酸的集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白質(zhì)部分來源的)，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；莫羅德明，一種表皮生長因子(鼠唾液腺)；醋酸那法瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；nagrestipen，包含69個氨基酸、有兩個二硫鍵的26-L-丙氨酸淋巴因子MiP 1α(人克隆pAT 464炎癥巨噬細(xì)胞)；胃酶抑制劑，N-(3-甲基-1-氧丁基)-L-Val-L-Val-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酰-L-Ala-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，用作胃蛋白酶抑制劑；pramlintide，一種包含37個氨基酸和有一個二硫鍵的蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病藥；人胰島素原，包含86個氨基酸殘基、有三個二硫鍵的胰島素原(豬)，用作抗糖尿病藥；沙莫司亭，集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白質(zhì)部分)，23-L-Leu，一種從釀酒酵母表達(dá)的、127個氨基酸殘基的單鏈糖基化多肽，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；天然產(chǎn)生的和合成的、包括重組衍生的人和動物促生長素(生長激素)，尤其是牛和豬促生長素；牛瑞生長素，促生長素(牛來源的)，1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-谷氨酰胺]-，包含191個氨基酸，用作催乳劑，尤其是獸醫(yī)應(yīng)用；豬丙氨生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-丙氨酰-生長激素，總共包含191個氨基酸，用作激素(生長，豬)；人蛋氨生長素，促生長素(人)，N-L-Met-，包含具有兩個二硫鍵的191個氨基酸，用作生長激素；促生長素，一種具有從人腦垂體前葉得到的主要生長刺激激素的正常結(jié)構(gòu)的、包含191個氨基酸的單鏈多肽，用作生長激素；促生長素，可以以重組形式獲得；牛亮氨生長素，促生長素(牛)，127-L-Leu-，牛垂體促生長素中的四個天然產(chǎn)生的分子變體之一，用作催乳劑；豬諾生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190個氨基酸，用作豬生長激素；牛蛋氨生長素，促生長素(牛)，1-L-Met-127-L-Leu-，包含191個氨基酸，用作獸醫(yī)生長刺激劑；豬蛋氨生長素，促生長素(豬重組體)C979H1527N265O287S8；塞泊生長素，促生長素(豬重組體)C938H1465N257O278S6；牛度生長素，促生長素(牛重組體)C1020H1596N274O302S9；替普羅肽，緩激肽增效劑B，2-L-Trp-3-去-L-Leu-4-去-L-Pro-8-L-谷氨酰胺-，包含9個氨基酸，用作血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑；特立帕肽，一種包含34個氨基酸的蛋白質(zhì)，用作骨吸收抑制劑和骨質(zhì)疏松癥治療佐劑；thymalfasin，包含28個氨基酸的胸腺素α1(牛)，用作抗腫瘤劑，用于治療肝炎和傳染病，以及用作疫苗增強(qiáng)劑；胸腺噴丁，一種用作免疫調(diào)節(jié)劑的五肽；曲普瑞林，促黃體激素釋放因子(豬)，6-D-Trp，包含10個氨基酸，用作抗腫瘤劑；包含具有一個二硫鍵的8個氨基酸的伐普肽，用作抗腫瘤劑；包含具有一個二硫鍵的9個氨基酸的、8-L-Arg-或8-L-Lys-型加壓素，用作抗利尿激素；肌紅蛋白；血紅蛋白；β-乳球蛋白；免疫球蛋白-G(IgG)；抗血友病因子(因子Ⅷ)；溶菌酶；遍在蛋白；血小板活化因子(PAF)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；腫瘤壞死因子-β(TNF-β)；巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)；肝素；嗜伊紅性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)；重組因子Ⅸ；非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤的單克隆抗體；干擾素α，用于治療丙型肝炎；和用于治療創(chuàng)傷和燒傷的成纖維細(xì)胞衍生的人造皮膚。
能有效推動本發(fā)明方法的縮合反應(yīng)實(shí)質(zhì)完成的條件包括能使存在的水從液相變?yōu)闅庀嗷蚬滔嘤纱藦乃隹s合反應(yīng)的環(huán)境中除去水的那些。為了使本發(fā)明的方法獲得成功，所述條件還必須具有可量測性的特征，即，容易且有效地適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的能力，還必須有再現(xiàn)性，即，最終結(jié)果沒有實(shí)質(zhì)偏差地連續(xù)進(jìn)行生產(chǎn)的能力。因此，所述條件是使必需輸入該方法中的能量優(yōu)化以最有效地將發(fā)生縮合反應(yīng)的含水環(huán)境中的水(包括所述縮合反應(yīng)本身產(chǎn)生的水)和起始反應(yīng)物以及縮合加合終產(chǎn)物分離開的那些。
在0℃以上的溫度下，優(yōu)化輸入到該方法中的能量的條件包括(a)按照保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求，將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物加熱至最高溫度；(b)按照保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求，將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物細(xì)分成最小液滴；和(c)給由此形成的所述液滴提供關(guān)于它們所從中通過的惰性氣體的最高比速，這應(yīng)符合保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求。
另外，將反應(yīng)混合物加熱至溫度為25℃-125℃，優(yōu)選為40℃-120℃，更優(yōu)選為50℃-115℃，仍更優(yōu)選為60℃-110℃，首選為75℃-105℃，同時通過在需要時應(yīng)用抬高的壓力而使該含水環(huán)境保持為液相。但是，鑒于反應(yīng)物中有一種是蛋白質(zhì)，因此通常更有利的是利用較低的、即降低的壓力。降低的壓力容許本質(zhì)上相同量的能量輸入該系統(tǒng)中，同時使該系統(tǒng)中保持較低的溫度，從而使反應(yīng)混合物從液體變?yōu)闅庀?。因此，?yīng)當(dāng)理解，必須作出關(guān)于反應(yīng)混合物允許經(jīng)受的任何高溫的警告。在多數(shù)情況下，上面所提到的溫度的最高值可以僅僅維持非常短暫的時間，通常是幾秒鐘左右。當(dāng)反應(yīng)物或終產(chǎn)物的熔點(diǎn)低至足以對它們的加工造成問題的時候，可選地借助于減壓使反應(yīng)混合物維持較低的溫度證明是有益的，甚至是必需的。
另外，將在所述含水環(huán)境中的反應(yīng)混合物分成平均直徑為1.0μm-5.0mm的液滴，優(yōu)選為10μm-1.0mm，更優(yōu)選為100μm-900μm，仍更優(yōu)選為200μm-800μm，首選為300μm-700μm。
所述液滴經(jīng)受的比速為0.1m/秒-5.0m/秒，優(yōu)選為0.2m/秒-4.0m/秒，更優(yōu)選為0.3m/秒-3.0m/秒，仍更優(yōu)選為0.4m/秒-2.0m/秒，首選為0.5m/秒-1.0m/秒。
在0℃及0℃以下的溫度下，所述優(yōu)化輸入該方法的能量的條件包括(a)將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物冷卻至溫度低到足以使所述含水環(huán)境中存在的所有非結(jié)合液態(tài)水實(shí)質(zhì)凍結(jié)的程度，所述溫度符合保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求；(b)使所述由此冷卻后的在所述凍結(jié)的含水環(huán)境中的反應(yīng)混合物在通入惰性氣體的條件下經(jīng)受降低的壓力，這應(yīng)符合保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求。
另外，將反應(yīng)混合物冷卻至溫度為-110℃至0℃，優(yōu)選為-45℃至-5℃，更優(yōu)選為-40℃至-10℃，仍更優(yōu)選為-35℃至-15℃，首選為-30℃至-20℃，同時保持該含水環(huán)境為固相。
在所述含水環(huán)境中的所述冷卻的反應(yīng)混合物經(jīng)受的降低的壓力為5.0mmHg絕對壓力-0.0001mmHg絕對壓力，優(yōu)選為1.0mmHg絕對壓力-0.0005mmHg絕對壓力，更優(yōu)選為0.5mmHg絕對壓力-0.001mmHg絕對壓力，仍更優(yōu)選為0.2mmHg絕對壓力-0.005mmHg絕對壓力，首選為0.1mmHg絕對壓力-0.01mmHg絕對壓力。
本發(fā)明的縮合反應(yīng)過程也可以在減少水分的條件下進(jìn)行，由此加快水分的去除速率和提高所去除的總量。這與通過去除已存在或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水來推動該縮合反應(yīng)完成的目標(biāo)是一致的，以確保轉(zhuǎn)化成所述縮合加合終產(chǎn)物的速率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。與該目標(biāo)一致，該縮合加合終產(chǎn)物中存在的水分的量將相當(dāng)于3.0％-0.001％重量，以終產(chǎn)物的重量計，優(yōu)選為2.0％-3.0％重量，以所述終產(chǎn)物的重量計。進(jìn)一步達(dá)到的是，在縮合反應(yīng)完成之后，所存在的水分的量可能降低至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，甚至低至0.03％-0.01％重量，以終產(chǎn)物的重量計。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性需要時，也可以存在實(shí)質(zhì)上更高含量的水分，該含量在3.0％-20.0％重量范圍內(nèi)，優(yōu)選為5.0％-15.0％重量，更優(yōu)選為8.0％-12.0％重量，以終產(chǎn)物的重量計。
上述制備方法(包括縮合反應(yīng)方法)可以在減少水分的條件下進(jìn)行，由此加快水的去除速率和提高所去除的總量。這一方法與通過去除已存在或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水來推動該縮合反應(yīng)完成的目標(biāo)是一致的。但是，該縮合加合終產(chǎn)物中存在的水分的量必須符合保持所述終產(chǎn)物完整性的要求。因此，該加合終產(chǎn)物中水分的含量最好是在3.0％-20.0％重量的范圍內(nèi)，優(yōu)選為4.0％-15.0％重量，更優(yōu)選為5.0％-10.0％重量，以終產(chǎn)物的重量計。例如，當(dāng)產(chǎn)物為羊促生長素時，該終產(chǎn)物中存在的水分的量為6.0％-9.0％重量。
將上述條件應(yīng)用于本發(fā)明的制備方法將有效地去除所述縮合反應(yīng)過程中存在的約97.0％-99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物完整性的要求，且所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
另外，起始反應(yīng)物也可以作為水溶液就在縮合加合終產(chǎn)物以液滴形式分散之前或?qū)嵸|(zhì)上與其同時而彼此完全接觸。這種水溶液形式的完全混合是通過機(jī)械作用實(shí)現(xiàn)的，該機(jī)械作用足以使所述起始反應(yīng)物彼此接觸，同時又不會使所述縮合加合物的蛋白質(zhì)組分機(jī)械降解。有一些關(guān)于選擇具有溫和作用的機(jī)械混合設(shè)備以避免溶液中產(chǎn)生顯著水平的剪切應(yīng)力的準(zhǔn)則。例如，熟練技術(shù)人員可以選擇帶有攪拌棒、攪拌槳或其它類型攪拌器的固定式混合容器；帶有攪拌工具的料槽形式的連續(xù)混合裝置，它包含一個與整個料槽的搖擺聯(lián)合運(yùn)轉(zhuǎn)的緩慢移動的螺桿或擋板；套管式裝置，其中反應(yīng)混合物裝在中心管中，兩個管子之間的環(huán)隙中是逆向流動的加熱介質(zhì)，通過在中心管中一個帶有葉片的旋轉(zhuǎn)軸進(jìn)行攪拌；帶有用于加熱的排管的攪拌反應(yīng)容器，其中的下降管中安裝有葉輪，通過強(qiáng)制循環(huán)提高向反應(yīng)混合物的熱傳遞；濃縮反應(yīng)混合物的混合設(shè)備；以及帶有一個保持在低壓下的攪拌反應(yīng)室的真空反應(yīng)器。
上面所提及的水溶液形式的完全混合也可以通過反乳劑的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)，其中所述起始反應(yīng)物已作為連續(xù)相(即所述反乳劑的溶劑相)和分散相(即所述反乳劑的水相)中的溶質(zhì)而彼此分離。所述反乳劑的轉(zhuǎn)化是通過使所述反乳劑迅速分布到一個含水系統(tǒng)中而實(shí)現(xiàn)的，該含水系統(tǒng)與分散相是相同的。然后，如下文中進(jìn)一步描述的那樣，利用上述任何一種混合方法得到的縮合加合終產(chǎn)物可以在環(huán)境條件下以液滴形式分散。
起始反應(yīng)物也可以以液滴形式彼此完全接觸，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的形成就在所述終產(chǎn)物以液滴形式分散之前或?qū)嵸|(zhì)上與其同時發(fā)生。所述起始反應(yīng)物以液滴形式完全混合是通過直接單獨(dú)噴灑每種所述起始反應(yīng)物形式的機(jī)械作用實(shí)現(xiàn)的，以這種方式，所述液滴彼此最大程度地混合、碰撞和接觸。用于該方法的噴灑器械可包括足以傳遞所需能量的機(jī)械或液壓泵裝置，所述能量是將含有所述起始反應(yīng)物的水流分成要去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水所需要的尺寸大小的液滴所必需的，同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且也是確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率所必需的，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。所述泵裝置可以與一個噴嘴裝置聯(lián)合使用，由此將機(jī)械剪切力施加于所述起始反應(yīng)物的所述水流，結(jié)果所述水流被接連分成更小的液滴，直到液滴達(dá)到所需大小為止。
也可以使用包含氣流發(fā)生器和用于分散其中的所述起始反應(yīng)物的所述水流以使其成為具有所需液滴大小的液滴的裝置的噴灑器械。所述氣體實(shí)質(zhì)上對于所述起始反應(yīng)物和所述縮合加合終產(chǎn)物來說是惰性的，其中包括空氣、氮?dú)饣蚝?，它們已被壓縮至一定壓力，該壓力足夠高，以得到具有夾帶所述起始反應(yīng)物的所述液滴和確保其最大程度地混合、接觸和碰撞所需的體積和速度的氣流，所述液滴的夾帶及其最大程度的混合、接觸與碰撞足以去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且足以確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
用于本發(fā)明方法的噴灑器械包括上述氣流發(fā)生器和有關(guān)的分散裝置與上面所述的液壓泵裝置和有關(guān)的噴嘴裝置的任何適當(dāng)?shù)慕M合。
按照本發(fā)明，所述起始反應(yīng)物以液滴形式完全混合也可以通過一個快速旋轉(zhuǎn)的圓盤形式的機(jī)械作用實(shí)現(xiàn)，包含所述每一種起始反應(yīng)物的水流指向該圓盤表面的上方。可以對每種起始反應(yīng)物使用一個單獨(dú)的圓盤，或者使用一個已制成能適應(yīng)所述兩種起始反應(yīng)物水流的單個圓盤。所述每種水流以從所述圓盤的邊緣以液滴形式推進(jìn)的方式通過所述圓盤。所述旋轉(zhuǎn)圓盤的速率可以變化，以傳遞足夠的能量將所述每種水流分成具有能使所述液滴最大程度地混合、碰撞和接觸的大小和速率的液滴。所述起始反應(yīng)物的混合實(shí)質(zhì)上發(fā)生在關(guān)于溫度、濕度和壓力進(jìn)行調(diào)節(jié)的環(huán)境條件下，以去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且能確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
本發(fā)明的范圍內(nèi)包括在實(shí)質(zhì)上的室溫條件下進(jìn)行上述制備方法。但是，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，對所述實(shí)質(zhì)上的環(huán)境條件進(jìn)行了重要的修改，以提高水從所述縮合反應(yīng)和所得加合終產(chǎn)物中去除的速率和總量。具體地講，所述修改包括在本文中提供的所述制備方法的一些或全部過程中加熱所述起始反應(yīng)物的水流和對這些起始物水流進(jìn)行加工的器械裝置。因此，反應(yīng)的速率和向縮合加合終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的量實(shí)質(zhì)上提高了。
也可以通過在與所述制備方法有關(guān)的器械或原料的不同部分施加電場來修改制備方法，由此使得所涉及的所述起始反應(yīng)物液滴的混合、碰撞和接觸增加到最大程度，并使所述縮合加合終產(chǎn)物的收率實(shí)質(zhì)提高。
有一些器械裝置和加工步驟可以置于實(shí)質(zhì)降低的壓力條件下，特別是那些與所述起始反應(yīng)物的反應(yīng)有關(guān)的裝置和步驟，從而使反應(yīng)物實(shí)現(xiàn)最大程度的混合、接觸和碰撞，由此足以去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且足以確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
可以利用流化床裝置來提高水從縮合加合終產(chǎn)物液滴中去除的速率和程度，以及提高所述縮合加合終產(chǎn)物液滴的收率，使其等于或高于約98.5％重量，以所述起始反應(yīng)物的重量計。
本發(fā)明還涉及新的由本發(fā)明的上述制備方法生產(chǎn)的物質(zhì)的組合物，它包含席夫堿縮合加合物，該加合物的組分包括蛋白質(zhì)和芳族鄰羥基醛，其中所述組分已在一定條件下形成一個反應(yīng)混合物并得到了縮合加合終產(chǎn)物，所述條件能使有效地去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且能確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。本發(fā)明還提供了所述液滴形式的物質(zhì)的組合物，該液滴的平均直徑在約0.1μm-約10.0μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約1.0μm-約5.0μm，更優(yōu)選為約2.0μm-約4.0μm，首選為約2.5μm-約3.5μm。
本發(fā)明物質(zhì)的新組合物包括其中其所述蛋白質(zhì)組分可以對動物給藥并在給藥后被吸收、有利地利用、代謝和清除(即從所述動物體內(nèi)消除)的那些。所述蛋白質(zhì)組分可能在其與芳族鄰羥基醛反應(yīng)形成本發(fā)明的改良席夫堿縮合加合物之前就具有這類特性；然而，這種縮合加合物的形成將顯著增強(qiáng)這類性能和特性，并由此提供一種合適的蛋白質(zhì)候選物，如果沒有經(jīng)過這種增強(qiáng)作用的話，它本來可能會是不適宜的。
所述蛋白質(zhì)組分具有在其給藥的特定動物體內(nèi)產(chǎn)生有益效用的能力，該特定動物是用其進(jìn)行治療的最普通的一員。所述蛋白質(zhì)組分包括具有對動物或?qū)游锏氖褂糜幸娴钠渌锘钚缘牡鞍踪|(zhì)，包括蛋白質(zhì)激素，諸如用于調(diào)節(jié)動物(通常是用作食品生產(chǎn)原料的家養(yǎng)牲畜)生長的促生長素，對這類動物給藥的促生長素具有增加飼料的利用效率和減少這類原料動物進(jìn)入市場所需的時間的有益效用。還包括使用本發(fā)明的方法改進(jìn)的蛋白質(zhì)，改進(jìn)的方面是它們長期儲藏的穩(wěn)定性以及增加的對動物以胃腸外固體植入物這種方式給藥的機(jī)會。進(jìn)一步還包括公認(rèn)的具有作為動物和人的治療劑功效的蛋白質(zhì)，以及可以與本發(fā)明的方法一起使用的蛋白質(zhì)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種制備包含鄰羥基醛和蛋白質(zhì)的席夫堿縮合加合物的方法，該方法體現(xiàn)了對本領(lǐng)域中此前已知的用于生產(chǎn)這種類型的加合產(chǎn)物的制備方法的顯著改善。不僅體現(xiàn)在本發(fā)明的制備方法能更容易地重復(fù)、更有效、收率高并具有轉(zhuǎn)置能力(即對按比例擴(kuò)大生產(chǎn)的適應(yīng)能力)，而且該方法的縮合加合終產(chǎn)物還體現(xiàn)了對使用過去的制備方法生產(chǎn)的產(chǎn)品的顯著而令人驚奇的改善。本發(fā)明的縮合加合終產(chǎn)物直接產(chǎn)生于本發(fā)明的改善的縮合方法，該方法本身具有令人驚奇地更好的重復(fù)性、效率、高收率和轉(zhuǎn)置能力(即對按比例擴(kuò)大生產(chǎn)的適應(yīng)能力)。
如文中所示，本發(fā)明涉及對在科技文獻(xiàn)中描述的席夫堿縮合方法的顯著改善。這類方法的代表是Clark等在US 5198422中提及的，其中制備的是包含生長激素尤其是豬促生長素pST和芳香醛的穩(wěn)定復(fù)合物，最終的復(fù)合物產(chǎn)品作為結(jié)晶產(chǎn)物從水溶液中分離得到，據(jù)稱該結(jié)晶產(chǎn)物能使所述生長激素長時間釋放。
在Clark等的方法中將最終的復(fù)合物產(chǎn)品從水溶液中分離出來的特定操作涉及通過蒸發(fā)一段實(shí)質(zhì)長的時間而除去含水溶劑，之后通過將其從進(jìn)行反應(yīng)的容器器壁上刮除下來而回收得到該產(chǎn)物。Clark等的方法難以控制，經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)物降解，并且事實(shí)上不可能按比例地進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)。產(chǎn)物降解的強(qiáng)烈可能性是將反應(yīng)混合物(含有尤其是作為縮合加合終產(chǎn)物組分的經(jīng)常會降解的蛋白質(zhì)以及起始反應(yīng)物的濃水溶液)長時間保持在抬高的溫度下的直接結(jié)果。與之相比，本發(fā)明的制備方法，尤其是涉及噴霧干燥和冷凍干燥的實(shí)施方式，將起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物在水溶液中的停留時間縮短到了最小程度。Clark等提到了通過冷凍干燥(即凍干)去除含水溶劑，但他們的意思似乎是決不試圖采用該方法。因此，技術(shù)人員不可能對這種工藝操作有任何合理的預(yù)期。Clark等沒有提示使用鄰羥基醛和維持pH在7.0或以上在本發(fā)明方法中的臨界性。即使技術(shù)人員執(zhí)行了Clark等的這種凍干操作，正如剛剛描述的蒸發(fā)過程那樣，它也將是一個以長時間干燥為特征的過程，會直接導(dǎo)致上述與重復(fù)性、產(chǎn)品質(zhì)量和擴(kuò)大生產(chǎn)能力有關(guān)的加工問題。
然而，Clark等的工作得到了在那之前在長期儲藏穩(wěn)定性和產(chǎn)品總體純度方面次最佳的改良產(chǎn)物，嚴(yán)重限制了它們在動物治療中的有用性。當(dāng)該產(chǎn)物是固體植入物顆粒或是用于通過滴注或插入要進(jìn)行治療的動物的皮膚下或肌肉組織內(nèi)而進(jìn)行胃腸外給藥的有關(guān)形式時，這具有特別不利的影響。盡管Clark等的方法能在產(chǎn)品穩(wěn)定性方面取得一些改善，但顯然沒有可行的方式來將這樣一種方法按比例擴(kuò)大到能有效而又經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行適宜的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的水平，因為要使含水溶劑完全蒸發(fā)，需要消耗大量的能量和花費(fèi)很長的時間。
因此，在本領(lǐng)域中仍然存在克服目前用于制備這類席夫堿縮合加合產(chǎn)物的方法的現(xiàn)有缺點(diǎn)的需要，以及克服用早期的基本不令人滿意的方法生產(chǎn)的不穩(wěn)定的加合產(chǎn)物的缺點(diǎn)的需要。正是從滿足了本領(lǐng)域中的這些需要這個意義上來說，本發(fā)明的方法應(yīng)當(dāng)受到關(guān)注。
在克服科技文獻(xiàn)中提及的方法和產(chǎn)品的缺點(diǎn)方面，可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的要點(diǎn)在于可以利用非常容易、可重復(fù)和可轉(zhuǎn)置(即，能有效地適應(yīng)于以實(shí)質(zhì)更大的規(guī)模進(jìn)行)的方法去除含水溶劑，例如噴霧干燥方法，并因此使該方法適于按比例地擴(kuò)大進(jìn)行，從而以有效而又經(jīng)濟(jì)的工業(yè)水平進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明制備方法的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物的必需的非蛋白質(zhì)組分是芳族鄰羥基醛，下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述了它們的類型。
席夫堿縮合加合產(chǎn)物最初在本領(lǐng)域中的應(yīng)用是為了克服與產(chǎn)物在相關(guān)堿性蛋白中的穩(wěn)定性有關(guān)的問題。所述問題的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)產(chǎn)物逐漸變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(即，構(gòu)型)被破壞的直接結(jié)果，甚至所述蛋白質(zhì)的二級和一級結(jié)構(gòu)的某些方面也會有一些變性，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的物理性能發(fā)生改變，所述蛋白質(zhì)具有的生物活性顯著喪失。這種蛋白質(zhì)和羰基化合物的席夫堿綴合物已在本領(lǐng)域中用于試圖得到更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，例如上面所提及的Clark等的努力，據(jù)稱已得到了能長時間釋放形式的促生長素。導(dǎo)致席夫堿加合物形成的基礎(chǔ)縮合反應(yīng)是一個平衡反應(yīng)，它可以用以下圖解等式表示 席夫堿縮合反應(yīng)是一個平衡反應(yīng)，并且在上述等式中不會明顯向右移動，這些事實(shí)預(yù)示了即使用Clark等的方法也未能避免的問題，即，大量的有關(guān)蛋白質(zhì)不是加合物的形式，因此因變性導(dǎo)致了它們結(jié)構(gòu)的破壞，結(jié)果使得生物活性(在這種情況下是生長促進(jìn)活性)喪失。
席夫堿縮合反應(yīng)的另一個方面是已對反應(yīng)的進(jìn)行造成了一個堿性障礙物，尤其是由于那個方法已由Clark等人進(jìn)行。這個問題涉及醛組分(包括芳族鄰羥基醛)在長時間的干燥加工過程中的升華到了實(shí)質(zhì)性程度。這種升華的程度可能達(dá)到了反應(yīng)混合物最初的總?cè)┖康娜种换蚋唷＿@種起始反應(yīng)物的明顯損失不僅導(dǎo)致終產(chǎn)物的收率不可避免地降低，而且也導(dǎo)致了其它一些問題，這些問題中許多是由未反應(yīng)的蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物造成的。未反應(yīng)的蛋白質(zhì)在干燥加工過程中因變性而受到降解，所得副產(chǎn)物進(jìn)一步增加了操作的復(fù)雜化，例如，它們沉淀并粘著在本文中別處所描述的加工裝置的熱交換表面。與這些結(jié)果相反，本發(fā)明的方法導(dǎo)致了非常高的收率，幾乎完全消除了醛組分升華的問題。
盡管除去如上述等式右側(cè)所示通過縮合形成的水，根據(jù)質(zhì)量作用定律將在理論上推動該反應(yīng)的完成，但除去縮合的水卻成了個大問題，因為該反應(yīng)是在水溶液中發(fā)生的。有效地除去縮合的水意味著除去該反應(yīng)的含水環(huán)境中存在的所有水。本領(lǐng)域現(xiàn)在已開始意識到了席夫堿縮合加合物形成的這種固有的問題，但是在本發(fā)明提供解決這個問題的方法之前，科技文獻(xiàn)中還沒有就其解決提出任何建議。
本發(fā)明的第一個方面是本發(fā)明取得成功的一個必需要素，即是使用芳族鄰羥基醛作為反應(yīng)形成席夫堿縮合加合物的兩個關(guān)鍵組分之一。用于本發(fā)明的縮合方法的芳族鄰羥基醛優(yōu)選包含一個或多個下式化合物 其中R1和R4獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9；-S(=O)2N(R7)(R9)和-N(R7)(R9)，其中R7是氫或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中
定義R1和R4的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；?；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；和X和Y獨(dú)立地分別是N,O,S,CHR2或CHR3，條件是X和Y不可以同時都選自O(shè)和S；其中R2和R3獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氫或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定義R2和R3的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；?；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，R1和R4獨(dú)立地選自氫；羥基；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR7和-N(R7)(R9)，其中R7是氫或(C1-C2)烷基，R9是(C1-C2)。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1和R4獨(dú)立地選自氫；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基或甲氨基。在這個特定實(shí)施方案中，R7為氫而R9為甲基。同樣優(yōu)選的是，當(dāng)R1和R4定義為烷基并被取代時，僅有選自以下成員的一個取代基羥基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。甚至更優(yōu)選的是，所述單個取代基選自羥基、甲氧基和二甲氨基。
另外，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，X和Y獨(dú)立地選自N,CHR2或CHR3；在本發(fā)明的更優(yōu)選方面，X或Y之一為N而另一個分別為CHR2或CHR3。在本發(fā)明中仍更優(yōu)選的是，X為CHR2而Y為CHR3，其中R2和R3優(yōu)選獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR11；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11優(yōu)選為氫或(C1-C2)烷基，R13為(C1-C2)烷基。在本發(fā)明中甚至更優(yōu)選的是，R2和R3獨(dú)立地選自氫；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基；和甲氨基。在后一種情況下，R11為氫，R13為甲基。
本發(fā)明中優(yōu)選的是，當(dāng)R2和R3定義為烷基并被取代時，僅有選自以下成員的一個取代基羥基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
為了進(jìn)一步說明涉及尤其適用于此的特定芳族鄰羥基醛的本發(fā)明的這個方面，接下來給出一張表，表中列出了這類優(yōu)選醛的各個基團(tuán)
在上面列舉的適合并優(yōu)選用于本發(fā)明制備方法及其產(chǎn)品的芳族鄰羥基醛物質(zhì)中，根據(jù)它們在所述方法中的可用性、成本、有效性和簡易性及效率，并根據(jù)它們生產(chǎn)在隨時間的穩(wěn)定性和保持最初的生物活性水平方面具有最佳預(yù)期特性的改良產(chǎn)品的能力，有幾種是最為優(yōu)選的。所述最優(yōu)選的種類包括水楊醛；2,3-二羥基苯甲醛；2,6-二羥基苯甲醛；鄰香草醛；和吡哆醛；它們可以用下列結(jié)構(gòu)式表示 鄰香草醛水楊醛2,3-二羥基苯甲醛 2,6-二羥基苯甲醛吡哆醛2-羥基-3-乙氧基苯甲醛上面已描述了作為本發(fā)明成功必需要素的本發(fā)明的第一個方面，即，使用芳族鄰羥基醛作為反應(yīng)形成改良的席夫堿縮合加合物的兩個關(guān)鍵組分之一。因此，下面將詳細(xì)描述第二個組分-蛋白質(zhì)，按照本發(fā)明制備方法的過程，它與所述芳族鄰羥基醛反應(yīng)形成本發(fā)明的改良的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物。
用作本發(fā)明的改良席夫堿縮合加合物的第二個組分的蛋白質(zhì)必須符合幾個要求才能判定它適合這種應(yīng)用。首先，對蛋白質(zhì)的定義沒有嚴(yán)格的限制，可以僅僅基于其大小而不是別的什么。蛋白質(zhì)的分子量或質(zhì)量用道爾頓或千道爾頓(kDs)表示，并且它可以包含少至兩個氨基酸，多至數(shù)百個甚至千個以上的氨基酸。一種典型的蛋白質(zhì)質(zhì)量為30,000道爾頓。不過，重要的是，候選蛋白質(zhì)應(yīng)能對動物給藥并在給藥后被吸收、有益地利用、代謝和清除(即，從所述動物體內(nèi)消除)。最好是所述蛋白質(zhì)候選物在與芳族鄰羥基醛反應(yīng)形成本發(fā)明的改良席夫堿縮合加合物之前就具有這樣的特性；然而，這種縮合加合物的形成將顯著增強(qiáng)這類性能和特性，并由此使其成為一種適宜的蛋白質(zhì)候選物，若沒有這種增強(qiáng)作用的話，本來它可能是不合適的。
適用于形成本發(fā)明的席夫堿縮合加合物的蛋白質(zhì)候選物的另一個主要特性是，它能對用其給藥的特定動物產(chǎn)生有益的效用。這種有益效用是最普通的一種治療效用，無論是對動物還是對人給藥。本文中所用的術(shù)語“動物”是指動物王國及其主要組成部分中的所有成員，它們滿足本發(fā)明提出的關(guān)于具有與其給藥有關(guān)的有益效用的蛋白質(zhì)的其它要求。本文中所用的“有益效用”通常是指對特定動物的有益活性，以及因此給人帶來的在動物飼養(yǎng)業(yè)中的經(jīng)濟(jì)報酬。不過，這種表述的含義也可延伸至對特定動物不利或有害、但相反可能給人帶來經(jīng)濟(jì)利益的活性。這類活性將包括各種殺蟲活性，例如，抑制破壞重要經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物的或傷害對人有價值的家養(yǎng)動物的害蟲的生長和繁殖或完全將其消滅。因此，具有經(jīng)濟(jì)重要性的所有主要門及其亞門下的動物都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，例如，節(jié)肢動物門的脊椎動物，包括昆蟲類(昆蟲綱)、蜘蛛和螨類(蛛形綱)以及甲殼動物(甲殼綱)；或脊椎動物亞門的脊椎動物，包括哺乳動物類(哺乳綱)、鳥爬行動物類(爬行綱)、兩棲動物(兩棲綱)和魚；以及軟體動物門的無脊椎動物，包括蛤和蝸牛；或環(huán)節(jié)動物門的無脊椎動物，包括蚯蚓和水蛭；或棘皮動物門的無脊椎動物，包括海星和海膽；或線蟲綱的無脊椎動物，包括犬惡絲蟲。
適用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以具有對動物或?qū)游锏氖褂糜幸娴钠渌锘钚裕@些活性通?？赡懿辉谛再|(zhì)上歸類為治療活性。例如，蛋白質(zhì)激素如促生長素用于調(diào)節(jié)動物(通常是用作食品生產(chǎn)原料的家養(yǎng)牲畜)的生長，并且對這類動物給藥的促生長素具有增加飼料的利用效率和減少這類原料動物進(jìn)入市場所需的時間的有益效用。這種蛋白質(zhì)激素的使用具有清楚而明確的并不與其治療直接相關(guān)的商業(yè)和經(jīng)濟(jì)利益。
屬于蛋白質(zhì)并且目前已在商業(yè)上開發(fā)應(yīng)用的身體功能的其它激素和調(diào)節(jié)劑也可以借助于本發(fā)明的方法進(jìn)行改善。這種改善是提高它們的加合縮合水平，以及提高它們的收率，從而增加了它們以胃腸外固體植入物這種方式對動物給藥的機(jī)會。
不過，可以與本發(fā)明的方法一起使用的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是公認(rèn)的具有作為動物和人的治療劑功效的那些。這些蛋白質(zhì)已得到應(yīng)用或已被積極地開發(fā)用于各種各樣的治療用途。以下段落中的描述不僅將使我們清楚地看到有大量這類蛋白質(zhì)，而且會看到當(dāng)所有這些蛋白質(zhì)用本發(fā)明的方法制備成改良的席夫堿縮合加合物時，因改善的長期穩(wěn)定性和生物活性的保存而帶來的益處。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)制備成顆?；蝾愃朴趯⒂米饔糜诰忈尳o藥的植入儲存體形式時，這一點(diǎn)尤其真實(shí)。
有一大組蛋白質(zhì)內(nèi)源性的和合成的阿片樣止痛劑和拮抗劑，它們已被有機(jī)地分成不同的三類，分別叫做腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽。這些蛋白質(zhì)是μ、κ和δ阿片樣物質(zhì)受體亞型的選擇性和非選擇性興奮劑和拮抗劑，具有主要作為止痛劑的治療效用。具體的蛋白質(zhì)包括[Leu5]和[Met5]腦啡肽；強(qiáng)啡肽A和B；α-和β-新內(nèi)啡肽；[D-Ala2,MePhe4,-Gly(ol)5]腦啡肽(DAMGO)；[D-Pen2,D-Pen5]腦啡肽(DPDPE)；[D-Ser2,Leu5]腦啡肽-Thr6(DSLET)；[D-Ala2,D-Leu5]腦啡肽(DADL)；D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)；[D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-ol]腦啡肽(FK-33824)；Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]δ啡肽Ⅰ；Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]δ啡肽Ⅱ；Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(morphiceptin)；Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017)；和[D-Ala2,Leu5,Cys6]腦啡肽。
有一組歸類為內(nèi)分泌物的蛋白質(zhì)，包括緩激肽和胰激肽，它們是為響應(yīng)炎癥事件諸如組織損害、病毒感染和變態(tài)反應(yīng)而由一系列蛋白水解反應(yīng)產(chǎn)生的。這些蛋白質(zhì)局部見效并導(dǎo)致疼痛、血管舒張、血管通透性增加和前列腺素合成。具有興奮劑和拮抗劑活性的這些蛋白質(zhì)及它們的類似衍生物是潛在的治療劑，可用于治療男性不育，用于癌癥化療劑越過血腦屏障釋放，和用于治療疼痛、哮喘和其它慢性炎癥疾病。具體的這類蛋白質(zhì)包括Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(緩激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脫-Arg9-緩激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脫-Arg10-胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(脫-Arg9-[Leu8]-緩激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-緩激肽)；和[D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE140)，其中Hyp是反式-4-羥基-Pro；Thi是β-(2-噻吩基)-Ala；Tic是[D]-1,2,3,4-四氫喹啉-3-基-羰基；Oic是(3as,7as)-八氫吲哚-2-基-羰基。
加壓素和影響水的腎保存和對分別介導(dǎo)加壓應(yīng)答和抗利尿應(yīng)答的加壓素受體亞型V1和V2具有選擇性的這類蛋白質(zhì)類似物的產(chǎn)生的相關(guān)試劑對體液同滲重摩的調(diào)節(jié)已導(dǎo)致了大量具有不同活性的治療劑。例如V1拮抗劑可能在充血性心力衰竭、高血壓和手術(shù)后腸梗阻和腹部膨脹的治療中是有益的。V2興奮劑可用于通過控制多尿和煩渴來治療中樞性尿崩癥，和治療出血性疾病如威勒布蘭特病。具體的天然產(chǎn)生的加壓素樣肽包括下式表示的精氨酸加壓素(AVP) 和賴氨加壓素([Lys8]-AVP；合成加壓素肽V1a-選擇性興奮劑[Phe2,Ile2,Orn8]AVP；V1b-選擇性興奮劑脫氨基[D-3-(3’-吡啶基)-Ala2]AVP；V2-選擇性興奮劑去氨加壓素(dDAVP)和脫氨基[Val4,D-Arg8]AVP；以及肽拮抗劑，諸如下式表示的V1a-選擇性拮抗劑d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP 和V1b-選擇性拮抗劑dp[Tyr(Me)2]AVP；以及V2-選擇性拮抗劑脫Gly-NH29-d(CH2)5[D-Ile2,Ile4]AVP，和d(CH2)5[D-Ile2,Ile4,Ala-NH29]AVP。
五肽胃泌素是一種用作胃液分泌指示劑的蛋白質(zhì)診斷助劑，其具有下列化學(xué)式N-叔丁氧羰基-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。
奧曲肽是一種促生長素抑制素的合成類似物，它可用于治療胃腸道腫瘤的癥狀、其它療法難以治療的腹瀉、各種能動性障礙和胃腸出血。奧曲肽可以作為醋酸鹽和雙羥萘酸鹽獲得，它具有下列結(jié)構(gòu)L-半胱氨酸酰胺-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-羥基-1-(羥甲基)丙基]-，環(huán)(2→7)二硫化物，[R-(R*,R*)]-。
許多用作免疫抑制劑的抗體試劑已批準(zhǔn)用于臨床。先進(jìn)的雜交瘤技術(shù)允許從連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞大量生產(chǎn)這類抗體，從而產(chǎn)生高純度和特異性的抗體制劑，這些制劑可用作標(biāo)準(zhǔn)化藥物試劑。這類抗體試劑包括抗胸腺細(xì)胞球蛋白；鼠單克隆抗體-CD3單克隆抗體；和Rh0(D)免疫球蛋白。已開發(fā)用于治療免疫缺損狀態(tài)的蛋白質(zhì)免疫刺激劑包括免疫球蛋白。
細(xì)胞因子是一組由白細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生并具有各種免疫調(diào)節(jié)作用的多樣蛋白。目前公認(rèn)的主要細(xì)胞因子由干擾素，集落刺激因子和白介素組成。這些種類的細(xì)胞因子的具體實(shí)例包括α-干擾素；干擾素-γ(IFN-γ)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；和白介素-1(IL-1)至白介素-12(IL-12)。
造血生長因子是一組與調(diào)節(jié)成熟血細(xì)胞不斷被替換的過程有關(guān)的激素樣糖蛋白。這些蛋白質(zhì)的臨床應(yīng)用包括治療原發(fā)性血液疾病和在嚴(yán)重感染的治療以及對經(jīng)受化療或骨髓移植的病人的處理中用作佐劑。這類生長因子的具體實(shí)例包括紅細(xì)胞生成素(EPO)；干細(xì)胞生長因子(SCF)；白介素(IL-1-12)；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)；P1XY321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)；和血小板生成素。
溶栓藥物可用于溶解病理性血栓和血管損傷部位的血纖蛋白沉積物，它們包括象鏈激酶；組織纖溶酶原激活物(t-PA)；和尿激酶這樣的蛋白質(zhì)。
垂體前葉激素和調(diào)節(jié)它們的使用的下丘腦因子是具有治療用途的蛋白質(zhì)。垂體前葉激素可分成三類(a)促生長激素，包括生長激素(GH)，催乳素(Pr1)和胎盤催乳激素(PL)；(b)糖蛋白激素，包括促黃體素(LH)，促濾泡激素(FSH)和促甲狀腺素(TSH)；和(c)POMC衍生激素，包括促腎上腺皮質(zhì)素(ACTH)，α-促黑激素(α-MSH)，β-促黑激素(β-MSH)，β-促脂解素(β-LPH)和γ-促脂解素(γ-LPH)。調(diào)節(jié)所述激素釋放的下丘腦因子包括生長激素釋放激素(GHRH)，促黃體素釋放激素(LHRH)，胰島素樣生長因子(IGF-1和IFG-2)，促生長素抑制素和促性腺素釋放激素(GnRH)。
生長激素在生長激素缺陷的兒童中用作替代療法。促生長素抑制素是一種抑制生長激素釋放的下丘腦物質(zhì)，但它只有很短的半壽期。已在上面描述過的其合成類似物-奧曲肽，可用于治療因生長激素過度分泌而導(dǎo)致的肢端肥大癥。促性腺激素包括LH,FSH和絨毛膜促性腺激素(GC)，它們可用于診斷。CG可用于檢測是否懷孕，而LH和FSH可用于診斷幾種生殖疾病。這些蛋白質(zhì)促性腺激素也在醫(yī)療上用于治療不育(孕)癥。例如，尿促卵泡素是一種人絕經(jīng)期促性腺素(hMG)或已除去了大多數(shù)LH而得到的尿促性素制劑，因此是主要的FSH。尿促卵泡素可用于誘導(dǎo)排卵。戈那瑞林是一種用于治療性地刺激促性腺激素分泌的合成人GnRH制劑。另一方面，合成GnRH興奮劑，例如亮丙瑞林，組氨瑞林，那法瑞林和戈舍瑞林，可用于治療各種對性類固醇減少敏感的內(nèi)分泌疾病。
甲狀腺功能是由促甲狀腺素(TSH)調(diào)節(jié)的，這是一種糖蛋白，其分泌受促甲狀腺素釋放激素(TRH)的控制。TSH的治療應(yīng)用是用于甲狀腺機(jī)能減退患者的激素替代療法和非毒性甲狀腺腫患者或?qū)谞钕侔┻M(jìn)行了治療后的患者的TSH抑制療法。
蛋白質(zhì)胰島素是用于治療事實(shí)上所有胰島素依賴性糖尿病(IDDM)患者和許多非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)患者的支柱性藥物。也可以使用能從皮下部位更迅速吸收的胰島素的合成類似物。而且，還設(shè)計了可持續(xù)數(shù)天或數(shù)周緩慢釋放胰島素的可植入顆粒。胰高血糖素是一種在葡萄糖和酮體代謝的調(diào)節(jié)中具有顯著生理學(xué)作用的蛋白質(zhì)，它可用于治療嚴(yán)重低血糖，也可由放射學(xué)家使用其對胃腸道的抑制作用。已在前面提到過的促生長素抑制素是一種具有較短生物半壽期的激素，這種較短的半壽期限制其主要用于阻斷分泌內(nèi)分泌物的腫瘤(包括胰島瘤，胰高血糖素瘤，血管活性腸多肽腫瘤，類癌腫瘤和生長激素瘤)中的激素釋放。其合成類似物-奧曲肽是更長效的，因此更經(jīng)常用于治療用途。
降鈣素(CT)是一種特定作用于破骨細(xì)胞以抑制骨吸收的激素，它可用于處理高鈣血。CT在增加的骨骼重建疾病如佩吉特病中也是有效的。蛋白質(zhì)甲狀旁腺素(PTH)在脊柱性骨質(zhì)疏松癥患者的治療中有潛在價值。
除了上述各類蛋白質(zhì)治療劑以外，以下列舉的各種蛋白質(zhì)組分也已批準(zhǔn)用于人。
阿地白介素，125-L-絲氨酸-2-133-白介素2，用作抗腫瘤劑和免疫刺激劑。
阿糖苷酶是一種497個氨基酸的單體糖蛋白，是人胎盤組織β-葡糖腦苷脂酶的修飾型，可用作葡糖腦苷脂酶的補(bǔ)充劑。
丙賴促皮質(zhì)肽是一種合成的促腎上腺皮質(zhì)素類似物，1-β-Ala-17[L-2,6-二氨基-N-(4-氨基丁基)己酰胺]-α1-17-促腎上腺皮質(zhì)素。
阿克伐司是一種527個氨基酸的絲氨酸蛋白酶，其序列與血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的天然蛋白酶的序列相同，它用作纖溶酶原激活物。
阿韋舒托是利用基因工程使CD4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的頭178個氨基酸經(jīng)兩個接頭殘基與假單胞菌屬外毒素A的氨基酸1-3和253-613相連而得到的一種合成嵌合蛋白，它用作抗病毒劑。
amlintide是一種37個氨基酸的蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病劑。
阿莫胃泌素是N-羧基-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-苯基-L-丙氨酸酰胺。
anakinra是N2-L-Met-白介素1受體拮抗劑，用作非類固醇抗炎藥和用于治療炎性腸病的抑制劑。
醋酸阿那立肽是心房肽激素-21(鼠)，N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-，醋酸鹽，它用作抗高血壓劑和利尿劑。
血管緊張素酰胺是血管緊張素Ⅱ，1-L-Asn-5-L-Val-，用作血管收縮藥。
抑肽酶是一種有58個氨基酸的胰腺胰蛋白酶抑制劑，用作酶抑制劑(蛋白酶)。
阿法拉新是1-琥珀酰胺酸-5-L-Val-8-(L-2-苯基甘氨酸)血管緊張素Ⅱ，用作抗高血壓藥。
鞣酸精氨加壓素是加壓素，8-L-Arg-，鞣酸鹽，用作抗利尿劑。
門冬托星是一種由淺灰鏈霉菌生產(chǎn)的抗生素，它是催產(chǎn)素，4-L-Asn-。
阿托西班是催產(chǎn)素，1-(3-巰基丙酸)-2-(0-乙基-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-，用作催產(chǎn)素拮抗劑。
阿伏帕星是從純白鏈霉菌得到的一種糖肽類抗生素。
basifungin是一種抗真菌劑，結(jié)構(gòu)為N-[(2R,3R)-2-羥基-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-別-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-羥基-N-L-MeValα1-內(nèi)酯。
becaplermin是重組人血小板衍生生長因子B，它是一種在氨基酸組成和生物活性方面與內(nèi)源性人PDGF-BB同型二聚體類似的由遺傳工程化釀酒酵母生產(chǎn)的重組蛋白，用于通過促進(jìn)間充質(zhì)衍生細(xì)胞的增殖來治療慢性皮膚潰瘍。
bivalirudin是一種具有20個氨基酸的抗凝劑，抗血栓形成劑。
卡貝縮宮素是1-丁酸-2-[3-(對甲氧苯基)-L-Ala]縮宮素。
卡古縮宮素是1-丁酸-6-(L-2-氨基丁酸)-7-甘氨酸縮宮素。
藍(lán)肽是一種結(jié)構(gòu)為5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-硫代-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-酰胺的胃液分泌刺激劑。
cetermin是具有112個氨基酸的轉(zhuǎn)化人生長因子β2。
cilmostim是1-233-集落刺激因子1(人克隆p3ACSF-69蛋白部分)，環(huán)(7→90),(48→139),(102→146)-三(二硫化物)二聚體，用作生血劑(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)。
多粘菌素E甲磺酸鈉是一種用作抗細(xì)菌劑的粘菌素A組分。
可的瑞林Ovine Triflutate是促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(綿羊)，三氟乙酸鹽，它用作腎上腺皮質(zhì)缺乏癥和庫欣綜合征的診斷助劑，和用作一種促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素。
替可克肽是醋酸二十四肽促皮質(zhì)素，α1-24-促腎上腺皮質(zhì)素，用作促腎上腺皮質(zhì)激素。
環(huán)孢菌素是一種含有11個氨基酸和在6位上的3-羥基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酰部分的環(huán)蛋白，用作免疫抑制劑。
dacliximab(Ro-24-7375)是一種由四個經(jīng)二硫鍵連接的亞單位組成的、分子量約為150kD的人源化抗TAC單克隆抗體，用作免疫抑制劑。類似的免疫抑制劑蛋白是daclizumab。
達(dá)托霉素是一種蛋白質(zhì)抗細(xì)菌劑。
地西盧定是包含63個氨基酸的來自醫(yī)用水蛭的63-脫磺基水蛭素，用作抗凝劑。
地洛瑞林是包含9個氨基酸的促黃體素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑。
醋酸去氨加壓素是加壓素，1-(3-巰基丙酸)-8-D-Arg-，一醋酸鹽，三水合物，包含9個氨基酸，用作抗利尿劑。
醋酸地肽利司包含10個氨基酸，用作LHRH拮抗劑。
度莫瑞林是27-L-Leu-44a-Gly生長激素釋放因子(人)。
依降鈣素是1-丁酸-7-(L-2-氨基丁酸)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala降鈣素(鮭)。
emoctakin是包含有兩個Cys橋的72個氨基酸的白介素8(人)。
依泊丁α是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的165個氨基酸的糖蛋白，由已插入了人紅細(xì)胞生成素基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)。它用作抗貧血劑和補(bǔ)血劑。
厄索夫明是包含157個氨基酸的重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，是一種從人胎盤分離并在大腸桿菌中克隆和表達(dá)的非糖基化蛋白。它用作傷口愈合劑。
苯賴加壓素是包含9個氨基酸的加壓素，2-L-Phe-8-L-Lys，用作血管收縮藥。
非爾司亭是一種175個氨基酸的單鏈多肽，它是非糖基化的，由大腸桿菌表達(dá)，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑。
高血糖素是一種29個氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病藥。
醋酸戈那瑞林是包含10個氨基酸的促黃體激素釋放因子的二醋酸鹽，用作性腺刺激物質(zhì)。
戈舍瑞林是包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑。
組氨瑞林是包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑。
imiglucerase是495-L-組氨酸葡糖基神經(jīng)酰胺酶胎盤同工酶蛋白，用作葡糖腦苷脂酶的酶補(bǔ)充劑。
去丙氨酸的胰島素是一種通過除去胰島素B鏈C-末端的丙氨酸而制得的胰島素衍生物，用作抗糖尿病藥。
干擾素α-2a是包含165個氨基酸的干擾素αA(人白細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來源的)，用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。干擾素α-2b是包含165個氨基酸的干擾素α2b(人白細(xì)胞克隆Hif-SN206蛋白質(zhì)部分來源的)，也用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。干擾素β-1a是一種從含有工程化的人干擾素β基因的培養(yǎng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)的、由166個氨基酸殘基組成的糖基化多肽，它也用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。干擾素β-1b是一種從大腸桿菌生產(chǎn)的、由165個氨基酸殘基組成的非糖基化多肽，也用作免疫調(diào)節(jié)劑。干擾素γ-1b是1-139干擾素γ(人淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來源的)，N2-L-Met，它用作抗腫瘤劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
iroplact是包含具有兩個Cys橋的71個氨基酸殘基的N-甲硫氨酰血小板因子4(人亞單位)。
lanoteplase是一種通過缺失纖連蛋白樣和EGF樣結(jié)構(gòu)域并使Asn117突變?yōu)镚ln117而從人t-PA衍生得到的組織纖溶酶原激活物蛋白。該蛋白通過在編碼肽序列的DNA序列的哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)而生產(chǎn)，該蛋白用作纖溶酶原激活物和溶栓劑。
醋酸蘭瑞肽包含8個氨基酸和一個二硫鍵。該蛋白用作抗腫瘤劑。
來諾拉提是一種通過表達(dá)來自于人口腔鱗狀上皮細(xì)胞系-mRNA的人粒細(xì)胞集落刺激因子-cDNA而在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的、由174個氨基酸殘基組成的糖蛋白。該蛋白用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑。
醋酸黃體瑞林是一種包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑。
莫拉司亭是一種包含127個氨基酸的集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白質(zhì)部分來源的)，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑。
莫羅德明是一種表皮生長因子(鼠唾液腺)。
醋酸那法瑞林是包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑。
nagrestipen是包含69個氨基酸并具有兩個二硫鍵的26-L-丙氨酸淋巴因子MiP1α(人克隆pAT 464炎癥巨噬細(xì)胞)。
胃酶抑制劑是N-(3-甲基-1-氧丁基)-L-Val-L-Val-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酰-L-Ala-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，它用作胃蛋白酶抑制劑。
pramlintide是一種包含37個氨基酸和有一個二硫鍵的蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病藥。
人胰島素原是包含86個氨基酸殘基并有三個二硫鍵的胰島素原(豬)，用作抗糖尿病藥。
沙莫司亭是集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白質(zhì)部分)，23-L-Leu-，一種從釀酒酵母表達(dá)的、127個氨基酸殘基的單鏈糖基化多肽，它用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑。
牛瑞生長素是促生長素(牛來源的)，1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-谷酰胺]-，包含191個氨基酸，用作催乳劑，尤其是用于獸醫(yī)。
豬丙氨生長素是促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-丙氨酰-生長激素，總共包含191個氨基酸，用作激素(生長，豬)。
人蛋氨生長素是促生長素(人)，N-L-Met-，包含具有兩個二硫鍵的191個氨基酸，用作生長激素。
促生長素，有時也稱之為腺垂體生長激素，GH，垂體生長激素，垂體前葉生長激素，垂體生長激素和促生長的生長激素，是一種促進(jìn)身體生長、刺激蛋白質(zhì)合成和調(diào)節(jié)糖和脂質(zhì)代謝的特異性合成代謝蛋白物質(zhì)。促生長素是在下丘腦激素促生長素釋放素和促生長素抑制素的調(diào)節(jié)下由垂體前葉分泌的。來自不同物質(zhì)的促生長素生長激素，其氨基酸序列、抗原性、等電點(diǎn)、和它們可以產(chǎn)生生物應(yīng)答的動物的范圍是不同的。
對于人，促生長素是一種具有從人垂體前葉得到的主要生長刺激激素的正常結(jié)構(gòu)的、包含191個氨基酸的單鏈多肽，它用作生長激素。促生長素也可以以重組形式獲得。本文中所用的術(shù)語“促生長素”意欲包括天然產(chǎn)生的和合成的，包括重組衍生的人和動物促生長素(生長激素)，尤其是牛和豬促生長素。甲硫氨酰人生長激素C995H1537N263O301S8是用重組DNA在細(xì)菌中產(chǎn)生的，它含有天然激素的完全氨基酸序列再加上一個N-末端甲硫氨酸(methione)。
牛促生長素有四種天然產(chǎn)生的分子變體，其中之一叫做牛亮氨生長素。有幾種變體已利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，包括牛瑞生長素，C987H1550N268O291S9；牛蛋氨生長素，C978H1537N265O286S9；和牛度生長素，C1020H1596N274O302S9。
利用重組DNA技術(shù)已生產(chǎn)了天然豬促生長素的幾種變體，包括豬丙氨生長素，C977H1527N265O287S7；豬諾生長素，C938H1469N255O275S7；豬蛋氨生長素，C979H1527N265O287S8；和塞泊生長素，C938H1465N257O278S6。
牛亮氨生長素是促生長素(牛)，127-L-Leu-，它是牛垂體促生長素中的四個天然分子變體之一，用作催乳劑。
豬諾生長素是促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190個氨基酸，用作豬生長激素。
牛蛋氨生長素是促生長素(牛)，1-L-Met-127-L-Leu-，包含191個氨基酸，用作獸用生長刺激劑。
豬蛋氨生長素是一種重組豬促生長素，C979H1527N265O287S8。
塞泊生長素是一種重組豬促生長素，C938H1465N257O278S6。
牛度生長素是一種重組牛促生長素，C1020H1596N274O302S9，它用作獸用生長刺激劑。
替普羅肽是緩激肽增效劑B，2-L-Trp-3-去-L-Leu-4-去-L-Pro-8-L-谷酰胺-，包含9個氨基酸，用作血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。
特立帕肽是一種包含34個氨基酸的蛋白質(zhì)，用作骨吸收抑制劑和骨質(zhì)疏松癥治療佐劑。
thymalfasin是包含28個氨基酸的胸腺素α1(牛)，用作抗腫瘤劑，用于治療肝炎和傳染病，以及用作疫苗增強(qiáng)劑。
胸腺噴丁是一種用作免疫調(diào)節(jié)劑的五肽。
曲普瑞林是促黃體激素釋放因子(豬)，6-D-Trp，包含10個氨基酸，用作抗腫瘤劑。
伐普肽包含具有一個二硫鍵的8個氨基酸，用作抗腫瘤劑。
8-L-Arg-或8-L-Lys-型加壓素包含具有一個二硫鍵的9個氨基酸，用作抗利尿激素。
生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)展和生物技術(shù)研究工具及方法的使用使得更多不同類型的基于蛋白質(zhì)的治療劑進(jìn)入了臨床試驗并最終投放市場。例如，考慮以下蛋白質(zhì)制劑肌紅蛋白；血紅蛋白；β-乳球蛋白；免疫球蛋白-G(IgG)；抗血友病因子(因子Ⅷ)；溶菌酶；遍在蛋白；血小板活化因子(PAF)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；腫瘤壞死因子-β(TNF-β)；巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)；肝素；和嗜伊紅性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)。另外，最近已批準(zhǔn)的基于蛋白質(zhì)的藥物包括血小板生長因子，重組因子Ⅸ，非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤的單克隆抗體，用于治療丙型肝炎的改良干擾素α，和用于治療創(chuàng)傷和燒傷的成纖維細(xì)胞衍生的人造皮膚。
上面已詳細(xì)描述了用于本發(fā)明制備方法(包括其中所涉及的上述縮合方法)的起始反應(yīng)物的組成，下面的段落將詳細(xì)描述本發(fā)明制備方法本身。
本發(fā)明的制備方法提供了如本文中所定義的新的改良席夫堿縮合加合終產(chǎn)物。所述方法包括首先產(chǎn)生一個包含蛋白質(zhì)和芳族鄰羥基醛起始反應(yīng)物的反應(yīng)混合物。該反應(yīng)混合物是通過使蛋白質(zhì)組分反應(yīng)物和芳族鄰羥基醛組分反應(yīng)物在一個含水環(huán)境中彼此充分接觸而制備的。
本文中所用的詞語“起始反應(yīng)物”、“組分反應(yīng)物”和“反應(yīng)物”是指反應(yīng)形成席夫堿縮合加合物的蛋白質(zhì)和芳族鄰羥基醛實(shí)體。
短語“在一個含水環(huán)境中”表示反應(yīng)混合物的溶劑是水，并表示這是反應(yīng)發(fā)生的介質(zhì)。因此，在該反應(yīng)過程中形成的縮合的水也成為該“含水環(huán)境”的一個不可分的部分。
當(dāng)起始反應(yīng)物混合在一起形成反應(yīng)混合物后，本發(fā)明的制備方法立即繼續(xù)進(jìn)行席夫堿縮合反應(yīng)。本文中所用的詞語“席夫堿縮合反應(yīng)”是指有機(jī)化學(xué)和有機(jī)化合物合成領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的反應(yīng)?；镜南驂A縮合反應(yīng)可以用圖解表示如下
其中 =以片段形式顯示的蛋白質(zhì)，因其至少一個氨基酸具有伯氨基，該伯氨基顯示與該蛋白質(zhì)片段相連。重要的是要注意，席夫堿加合物的形成是一個平衡反應(yīng)，該反應(yīng)也可能導(dǎo)致加合物分離為它的構(gòu)成組分，并且這種分解反應(yīng)的速度可能與一開始導(dǎo)致縮合加合物形成的基本反應(yīng)的速度同樣迅速。
本發(fā)明制備方法的縮合過程實(shí)質(zhì)上被推動完成。本文中所用的詞語“實(shí)質(zhì)上完成”的意思是，該反應(yīng)是一個定量的，即，完全進(jìn)行完或幾乎完全進(jìn)行完的反應(yīng)。本發(fā)明制備方法的縮合反應(yīng)是通過除去已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水而定量進(jìn)行的，除去水的同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并可確保向所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化速率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
本文中所用的與本發(fā)明的方法實(shí)施方案相聯(lián)系的術(shù)語“制備方法”的含義包括席夫堿縮合反應(yīng)，以及為了推動所述反應(yīng)完成而采取的工藝步驟。整個方法的后一部分是通過實(shí)質(zhì)上除去反應(yīng)混合物的含水環(huán)境中的所有的水而實(shí)現(xiàn)的。
對于本文中所述的制備方法，能有效地推動所述縮合反應(yīng)實(shí)質(zhì)完成的條件包括能將存在的水從液相改變?yōu)闅庀嗷蚬滔?，由此將其從所述縮合反應(yīng)的即時環(huán)境中除去的那些。在本發(fā)明的方法中，所述條件還必須具有可量測性的特征，即，容易且有效地適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的能力，還必須有再現(xiàn)性，即，最終結(jié)果沒有實(shí)質(zhì)偏差地連續(xù)進(jìn)行的能力。既然存在于其含水溶劑中的反應(yīng)混合物是在室溫或低于水的沸點(diǎn)的高溫下制成的，存在的水自然將是液相的。為了推動該反應(yīng)完成，必須從反應(yīng)混合物的即時環(huán)境中完全而又快速地除去水。這一點(diǎn)不能簡單地通過將縮合加合終產(chǎn)物與含水溶劑分離并棄去后者而達(dá)到。反應(yīng)是處于平衡的，并且沒有沉淀產(chǎn)物形成，這些事實(shí)都對這種方法造成了障礙。
在本發(fā)明的制備方法中采取了兩種手段。一種，是將水轉(zhuǎn)化為蒸汽或氣體并除去，例如通過噴霧干燥，本發(fā)明的這種實(shí)施方式被看作是在0℃以上的溫度下發(fā)生。另一種手段是，將水轉(zhuǎn)化為固體并除去，例如通過冷凍干燥，本發(fā)明的這種實(shí)施方式被看作是在0℃或0℃以下的溫度下發(fā)生。
本發(fā)明的制備方法中采取的第一種手段是通過將水從液相轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嗷蛘羝喽鴮⑵涑?。這樣一個步驟通常非常迅速地完成。當(dāng)水從液相轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嗷蛘羝鄷r，會涉及到水的蒸發(fā)。于是，需要向該過程中輸入能量以滿足水的蒸發(fā)潛熱(LHE)，LHE就是水從液態(tài)轉(zhuǎn)化為汽態(tài)時每單位重量的水吸收的熱能的量。所需能量可以從等式LHE=0.02T2/E進(jìn)行計算，該等式中，T是水的熱力學(xué)標(biāo)度沸點(diǎn)，E是溶液的分子沸點(diǎn)升高值。一個相關(guān)的數(shù)值是比汽化潛熱(SLHV)，它是在不改變溫度的條件下將1克物質(zhì)從液體轉(zhuǎn)化為蒸汽所需的焦耳數(shù)。對于在100℃下的水，該值為2257J。
本發(fā)明制備方法進(jìn)行的條件是使必需輸入該方法的能量優(yōu)化以最有效地將發(fā)生縮合反應(yīng)的含水環(huán)境中的水(包括由所述縮合反應(yīng)本身產(chǎn)生的水)和起始反應(yīng)物以及縮合加合終產(chǎn)物分離開的那些。
本文中所用的短語“輸入該方法的能量”是指單獨(dú)或集合輸入的所有形式的能量，也指它們在本發(fā)明制備方法中的應(yīng)用，這種應(yīng)用使得含水環(huán)境中的水從液相轉(zhuǎn)變?yōu)槠嗷蚬滔?。其中包括首先是原子熱，它是?克水從0℃升高至1℃所需的熱能的量。一個相關(guān)的概念是分子熱，它是使1摩爾水升高1℃所需的熱能的量，即，比熱X分子量。這種熱能的輸入將使反應(yīng)混合物及其含水環(huán)境升高至所需溫度。
其次輸入的熱能是滿足蒸發(fā)熱所需的熱能，它已在上面的討論中詳細(xì)描述過了。之后，必須向存在于其含水環(huán)境中的反應(yīng)混合物施加機(jī)械能以進(jìn)行噴霧干燥步驟，在該步驟中水被完全蒸發(fā)。因此，在0℃以上的溫度下，優(yōu)化輸入該方法的能量的條件包括(a)按照保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地進(jìn)行所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求，將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物加熱至最高溫度。
本文中所用的與可以使用的溫度的上限有關(guān)的表述蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性”的意思實(shí)質(zhì)是，起始物和/或產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組分在進(jìn)行了這樣的加熱后沒有受到任何明顯的降解，所述加熱即，將使生物活性產(chǎn)生任何損失的變性作用，或?qū)⒏蓴_終產(chǎn)物(例如作為固體顆粒的皮下或胃腸外儲存體的終產(chǎn)物)從其給藥部位的釋放、尤其是持續(xù)釋放的變性作用。
根據(jù)進(jìn)行本發(fā)明的制備方法(包括縮合反應(yīng))而說的“效率和經(jīng)濟(jì)最佳地”的意思是，當(dāng)選擇反應(yīng)混合物的溫度和本文中所述的大量其它工藝參數(shù)時，必須對進(jìn)行所述方法的條件加以適當(dāng)?shù)目紤]，目的是得到最有效的可能的方法，以及在滿足其它選擇的同時以最低的成本得到終產(chǎn)物的方法。因此，如果該方法的其它效能在品質(zhì)上是相稱的，并且只要所得方法是一個與“最好地獲得”相一致的經(jīng)濟(jì)的方法，就應(yīng)該堅持選擇能提供最高收率終產(chǎn)物的工藝參數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員正好能平衡這些要求，以使該方法的各方面達(dá)到最佳。
因此，考慮到上述所有因素的影響，所述反應(yīng)混合物一般加熱至溫度為25℃-125℃，優(yōu)選為40℃-120℃，更優(yōu)選為50℃-115℃，仍更優(yōu)選為60℃-110℃，首選為75℃-105℃，同時通過在需要時應(yīng)用抬高的壓力而使該含水環(huán)境保持為液相?？梢酝ㄟ^使用抬高的壓力使溫度達(dá)到水的環(huán)境沸點(diǎn)、即100℃以上，同時又使該含水環(huán)境仍為液相。
在0℃以上的溫度下，該制備方法的下一個步驟包括(b)按照保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求，將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物細(xì)分成最小液滴。
在上述步驟的上下文中，保持蛋白質(zhì)的完整性某種程度上將取決于該蛋白質(zhì)的大小。因此，非常大的蛋白質(zhì)可能使在該步驟中有用的液滴的平均直徑變大。不過，在所述含水環(huán)境中的反應(yīng)混合物一般分成平均直徑為1.0μm-5.0mm的液滴，優(yōu)選為10μm-1.0mm，更優(yōu)選為100μm-900μm，仍更優(yōu)選為200μm-800μm，首選為300μm-700μm。
本發(fā)明的制備方法包括這樣一種實(shí)施方式，其中所述起始反應(yīng)物以液滴形式彼此完全接觸，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的形成就發(fā)生在所述終產(chǎn)物以液滴形式分散之前或與其基本同時發(fā)生。所述起始反應(yīng)物以液滴形式完全混合是通過足以使所述起始反應(yīng)物彼此完全接觸、同時又不會使所述縮合加合物的蛋白質(zhì)組分機(jī)械降解的機(jī)械作用實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本文中所述的必須考慮的各種參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能對特定的機(jī)械混合設(shè)備作出選擇。
最重要的因素之一是有關(guān)蛋白質(zhì)組分的性質(zhì)和該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性經(jīng)歷降解之前它在水溶液中能承受的剪切應(yīng)力的量。這可以使用常規(guī)的結(jié)構(gòu)完整性試驗來確定，諸如，利用電泳來測量所選用的機(jī)械混合設(shè)備對將要使用的蛋白質(zhì)的所述完整性的作用(如果有的話)。由于較大的肽能經(jīng)受可賦予結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的各種因素的多種重疊效應(yīng)的能力，使得所給蛋白質(zhì)對水溶液中的機(jī)械剪切應(yīng)力的抗性大體上不能得到完全預(yù)示，因此這類常規(guī)試驗可能是必需進(jìn)行的。另一方面，通過選擇具有溫和作用的機(jī)械混合設(shè)備可以從一開始就避免這些問題。考慮到要避免溶液中產(chǎn)生顯著水平的剪切應(yīng)力后再來選擇設(shè)備，經(jīng)常將避免對上述任何試驗的需要。
熟練技術(shù)人員將容易地想到許多適宜的機(jī)械混合設(shè)備。例如，混合容器可以是固定的并利用轉(zhuǎn)動或其它運(yùn)動形式的元件如攪拌棒、攪拌槳或其它類型攪拌器通過輕柔攪拌來進(jìn)行混合。當(dāng)希望連續(xù)進(jìn)行縮合過程時，可以采用一個料槽形式的混合裝置，其中起始反應(yīng)物從一端加入，而反應(yīng)混合物和縮合加合終產(chǎn)物從另一端出來。在這樣的裝置中可以使用一個在溶液中緩慢轉(zhuǎn)動的螺桿來進(jìn)行攪拌，并使終產(chǎn)物升高從而離開正在加熱的表面，由此使其通過溶液分布并使其通過料槽緩慢運(yùn)輸。整個料槽的搖擺也可以與擋板聯(lián)合使用，以增加溶液在料槽中的停留時間。這兩種類型的混合設(shè)備的特點(diǎn)都是具有低的傳熱系數(shù)，通過使用套管式裝置可以達(dá)到更迅速的熱交換，在該套管式裝置中，反應(yīng)混合物裝在中心管中，同時兩個管子之間的環(huán)隙中有逆向流動的加熱介質(zhì)。在這種類型的裝置中，經(jīng)常通過使用一個在中心管中旋轉(zhuǎn)并帶有刮擦熱傳遞表面的葉片的軸來進(jìn)行攪拌，葉片刮擦熱傳遞表面可以得到高傳熱系數(shù)。
混合設(shè)備在設(shè)計上可以是更被動的，并且不利用熱傳遞，諸如一種攪拌反應(yīng)容器。對于大規(guī)模生產(chǎn)，可以使用排管進(jìn)行加熱，而下降管必須足夠大以適應(yīng)反應(yīng)混合物的流動，并且下降管中通常安裝有葉輪，通過強(qiáng)制循環(huán)增加向反應(yīng)混合物的熱傳遞。其中重要的是對終產(chǎn)物進(jìn)行嚴(yán)格控制的連續(xù)方法可以使用濃縮反應(yīng)混合物的混合設(shè)備進(jìn)行。在一個真空反應(yīng)器中，一般將把熱的濃縮反應(yīng)混合物加入保持在低壓下的攪拌反應(yīng)室中?？梢允乖摲磻?yīng)混合物沸騰并絕熱冷卻至相當(dāng)于該容器操作壓力的沸點(diǎn)。
適用于本發(fā)明方法的另一種混合設(shè)備類型是利用反應(yīng)混合物的物流，這種物流是通過例如液壓泵產(chǎn)生的，該液壓泵使所述物流中產(chǎn)生足夠的湍流來確保各組分的完全混合。所選用的機(jī)械作用還可以采取單獨(dú)噴灑每種起始反應(yīng)物的形式，以這種方式，所述液滴達(dá)到彼此最大程度地混合、碰撞和接觸。在該方法中可以使用包括足以傳遞將含有所述起始反應(yīng)物的水流分成在上述大小范圍內(nèi)的液滴所需的能量的簡單的機(jī)械或液壓泵裝置的噴灑器械，液滴的這種大小范圍是要去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水所必需的，同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并可確保向所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
上述泵裝置可以與一個噴嘴裝置聯(lián)合使用，由此將機(jī)械剪切力施加于含有起始反應(yīng)物的水溶液的物流，結(jié)果，所述物流被不斷分成更小的液滴，直到達(dá)到所需液滴大小為止。
在本發(fā)明的制備方法中也可以使用包含氣流發(fā)生器和用于分散其中的所述起始反應(yīng)物的所述水流以使其成為具有所需液滴大小的液滴形式的裝置的噴灑器械。特別是，所述氣體實(shí)質(zhì)上對于所述起始反應(yīng)物和所述縮合加合終產(chǎn)物來說是惰性的。所述氣體由空氣、氮?dú)饣蚝饨M成，其中，該氣體已被壓縮至一定壓力，該壓力足夠高，以得到具有夾帶所述起始反應(yīng)物的所述液滴和確保其最大程度地混合、接觸和碰撞所需的體積和速度的氣流，所述液滴的產(chǎn)生及其最大程度的混合、接觸與碰撞足以去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且足以確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
適合用于本發(fā)明方法的噴灑器械包括上述氣流發(fā)生器和有關(guān)的分散裝置與上面所述的機(jī)械或液壓泵裝置和有關(guān)的噴嘴裝置的任何適當(dāng)?shù)慕M合。當(dāng)包括反應(yīng)混合物的含水環(huán)境的溫度要保持在水的正常沸點(diǎn)、即100℃以上時，這可以通過將該系統(tǒng)保持在抬高的壓力下來實(shí)現(xiàn)，將其保持在抬高的壓力下將以可預(yù)測方式抬高水在該系統(tǒng)中的沸點(diǎn)。還應(yīng)當(dāng)理解，一旦反應(yīng)混合物和含水系統(tǒng)已作為小液滴通過噴灑器械射出，所述液滴的溫度就將立即顯著下降。例如，通過使用抬高的壓力有可能使反應(yīng)混合物和含水環(huán)境在噴灑器械的入口部分保持115℃的溫度，而一旦該反應(yīng)混合物和含水系統(tǒng)已離開該噴灑器械的噴嘴裝置，就會觀察到它們的溫度已下降至80℃。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述起始反應(yīng)物以液滴形式完全混合是通過旋轉(zhuǎn)的圓盤形式的機(jī)械作用實(shí)現(xiàn)的，包含所述每一種起始反應(yīng)物的水流指向該圓盤的上方?？梢詫γ糠N起始反應(yīng)物使用一個單獨(dú)的圓盤，或者使用一個已制成能適應(yīng)所述兩種起始反應(yīng)物水流的單個圓盤。所述每種水流以從所述圓盤的邊緣以液滴形式推進(jìn)的方式通過所述圓盤；所述旋轉(zhuǎn)圓盤的速率可以變化，以傳遞足夠的能量將所述每種水流分成具有能使所述液滴最大程度地混合、碰撞和接觸的大小和速率的液滴。
所述起始反應(yīng)物的混合發(fā)生在已就溫度、濕度和壓力進(jìn)行了調(diào)節(jié)的條件下，以去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且能確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。例如，溫度一般將落在上述范圍內(nèi)，其中所述反應(yīng)混合物一般加熱至25℃-125℃，優(yōu)選為40℃-120℃，更優(yōu)選為50℃-115℃，仍更優(yōu)選為60℃-110℃，首選為75℃-105℃，同時在需要時通過應(yīng)用降低的壓力使該含水環(huán)境保持為液相。
也可以在一個器械中安裝旋轉(zhuǎn)圓盤，其中有可能通過使用例如真空泵裝置維持降低的壓力，盡管這不是一種典型的布置方式。如上所述，這種抬高的壓力可以用于提高反應(yīng)混合物和含水系統(tǒng)的沸點(diǎn)。這類旋轉(zhuǎn)圓盤式噴霧器的一個例子是可從丹麥的Niro Atomizer得到的Niro移動式噴霧干燥器。該設(shè)備有一個柱高為600mm、直徑為800mm的室，其有一個錐度為60°角的錐形底板。當(dāng)其在大氣壓下運(yùn)轉(zhuǎn)時，圓盤的速率范圍將是35,000-40,000rpm，干燥空氣的流速將為80kg/小時。
上述加熱反應(yīng)混合物和含水環(huán)境與在其分離成小液滴的過程中向其中輸入的機(jī)械能結(jié)合在一起，將有效地激勵其中的水分子，使它們變?yōu)闅怏w或汽相。為了進(jìn)一步促進(jìn)水從反應(yīng)混合物及含水環(huán)境中的去除，優(yōu)選另外使用空氣流來帶走汽化的水。從運(yùn)動的空氣流直接輸入能量增強(qiáng)了水的汽化作用，且一般空氣流的速度越高，對汽化作用的增強(qiáng)效果越大。汽化作用的增強(qiáng)通過使用具有高溫(例如75℃-150℃，優(yōu)選為90℃-110℃)的空氣流可進(jìn)一步得到提高。加熱的空氣給汽化過程提供了另外的能量。水的汽化還可以通過使用加熱的干燥(即濕度低的)空氣流進(jìn)一步加強(qiáng)，干燥可以提高該熱氣流包含更多水蒸氣的能力。該熱空氣流的濕度優(yōu)選為1％-20％相對濕度，優(yōu)選為2％-10％相對濕度。
因此，本發(fā)明制備方法的最后一個步驟如下(c)給由此形成的所述液滴提供關(guān)于它們所從中通過的惰性氣體的最高比速，這符合保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法(包括所述縮合反應(yīng))的要求。
針對反應(yīng)混合物和含水環(huán)境的液滴以及形成的縮合加合終產(chǎn)物的液滴而提到的“它們所從中通過的惰性氣體”的意思是指對所述終產(chǎn)物來說為惰性的任何氣體?？梢允褂孟蟮?dú)夂秃膺@類普通氣體，它們?nèi)菀撰@得并且在這些情況下是惰性的。不過，在實(shí)踐中，通常將難以找到一個比環(huán)境氣體更適宜的惰性氣體?？諝庖沧钣锌赡芊闲屎徒?jīng)濟(jì)最佳地完成本發(fā)明制備方法的要求。
所述液滴經(jīng)受的比速為0.1m/秒-5.0m/秒，優(yōu)選為0.2m/秒-4.0m/秒，更優(yōu)選為0.3m/秒-3.0m/秒，仍更優(yōu)選為0.4m/秒-2.0m/秒，首選為0.5m/秒-1.0m/秒。這個速度考慮了可能與所述液滴的物流一起、相對、交叉或成任何角度流動的惰性氣流的相對速度。
完成了上述過程后，在所述含水環(huán)境中的反應(yīng)混合物有可能分成平均直徑為1.0μm-5.0mm的液滴，優(yōu)選為10μm-1.0mm，更優(yōu)選為100μm-900μm，仍更優(yōu)選為200μm-800μm，首選為300μm-700μm。不言而喻，液滴越小，水的汽化和從反應(yīng)混合物及含水環(huán)境中的去除越有效。這主要是因為水分子的表面積大大膨脹，使得它們可以從液相轉(zhuǎn)變?yōu)槠?，并且被周圍的惰性氣流帶走?br> 在減少水分以加快水的去除速率的條件下也可能完成這些縮合過程。這將有助于推動該縮合反應(yīng)完成，并符合在縮合加合終產(chǎn)物中存在的水分的量為3.0％-0.001％重量(以該終產(chǎn)物的重量計)、優(yōu)選為2.0％-3.0％重量(以所述終產(chǎn)物的重量計)的要求。不過，也可能進(jìn)一步除去更多量的水分以提供一個更為干燥的不會結(jié)塊并具有改善的穩(wěn)定性和其它加工性能的終產(chǎn)物。因此，該縮合加合終產(chǎn)物中存在的水分的量可低至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，或者甚至低至0.03％-0.01％重量，以終產(chǎn)物的重量計。另一方面，必須注意，如果終產(chǎn)物完全脫水的話，許多蛋白質(zhì)會顯示出不穩(wěn)定性，因此可能必需在終產(chǎn)物中存在實(shí)質(zhì)更高量的水分。與保持終產(chǎn)物完整性的目標(biāo)一致，終產(chǎn)物中存在的水分的量可以在3.0％-20.0％重量范圍內(nèi)，優(yōu)選為5.0％-15.0％重量，更優(yōu)選為8.0％-12.0％重量，以終產(chǎn)物的重量計。
如上所述，在本發(fā)明的制備方法中采取了兩種手段。在上述第一種手段中，水被轉(zhuǎn)化為蒸汽或氣體并除去，例如通過噴霧干燥，本發(fā)明的這種實(shí)施方式被看作是在0℃以上的溫度下發(fā)生的。在以下段落中描述的第二種手段中，水被轉(zhuǎn)化為固體并除去，例如通過冷凍干燥，本發(fā)明的這種實(shí)施方式被看作是在0℃或0℃以下的溫度下發(fā)生的。
本發(fā)明制備方法中采取的第二種手段是通過將水從液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔喽鴮⑵涑?。這樣一個步驟通常不是象轉(zhuǎn)化為汽相的步驟那樣迅速完成的。當(dāng)水從液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔鄷r，牽涉到水的凍結(jié)，這本質(zhì)上需要從反應(yīng)混合物的含水環(huán)境中除去能量。但是，為了從所述含水環(huán)境中除去能量，即，將其溫度降低并最終使其變?yōu)楣滔?，就必需在本發(fā)明的制備方法中使用能量。例如，這將涉及到使用一個致冷系統(tǒng)或快速熱交換系統(tǒng)并讓其與含水環(huán)境接觸。結(jié)果，就需要向該制備過程中輸入能量，以除去足夠的有關(guān)單位重量的水的熱能，從而降低其溫度并最終使其變?yōu)楣滔唷?br> 實(shí)現(xiàn)上述從所述制備方法的含水環(huán)境中除去熱能的一個方法是通過冷凍干燥或凍干所述含水環(huán)境(包括反應(yīng)混合物)。按照本發(fā)明，這樣一種冷凍干燥過程進(jìn)行的方式是，使所述反應(yīng)混合物冷卻至溫度為-110℃至0℃，優(yōu)選為-45℃至-5℃，更優(yōu)選為-40℃至-10℃，仍更優(yōu)選為-35℃至-15℃，首選為-30℃至-20℃，同時保持該含水環(huán)境為固相，即凍結(jié)的。這個干燥過程本質(zhì)上是這樣一個過程，即首先使含水溶劑凍結(jié)，然后通過在真空環(huán)境中升華將其除去，由此除去該含水溶劑。
為了提高水的去除速率，在含水環(huán)境中的冷卻的反應(yīng)混合物經(jīng)受的降低的壓力為5.0mmHg絕對壓力-0.0001mmHg絕對壓力，優(yōu)選為1.0mmHg絕對壓力-0.0005mmHg絕對壓力，更優(yōu)選為0.5mmHg絕對壓力-0.001mmHg絕對壓力，仍更優(yōu)選為0.2mmHg絕對壓力-0.005mmHg絕對壓力，首選為0.1mmHg絕對壓力-0.01mmHg絕對壓力。這種降低的壓力可以使用各種容量和已知構(gòu)造的真空泵得到。
在進(jìn)行本文中所關(guān)注類型的冷凍干燥過程的常規(guī)方式中，將反應(yīng)混合物水溶液填充到適宜的容器如小瓶中，然后將其置于一個溫度受控的環(huán)境如大干燥室中。有關(guān)的縮合加合終產(chǎn)物最后將被用于治療人和動物的疾病和病況。因此，有效的是以小批量收集方式諸如小瓶加工這類產(chǎn)物，因為這些將各自為完成冷凍干燥過程提供適宜的體積表面積比，并且可以一次加工大量小瓶。
然后將干燥室中的溫度調(diào)節(jié)并保持在大約-40℃，之后反應(yīng)混合物水溶液迅速變成由冰和固體溶質(zhì)組成的固體，即，縮合加合終產(chǎn)物。根據(jù)有關(guān)終產(chǎn)物的不同和所進(jìn)行的冷凍干燥過程的性質(zhì)，冰結(jié)晶，而溶質(zhì)或者結(jié)晶或者變?yōu)椴Ａ钊苜|(zhì)。然后利用真空泵將干燥室抽空，干燥室中的溫度升高至冷凍干燥過程中的冰開始升華為蒸汽的階段，通常稱之為初級干燥步驟。升華產(chǎn)生的水蒸氣通過部分干燥的縮合加合物隨同它一起傳輸?shù)揭粋€冷凝室中，該冷凝室裝備有保持在甚至約-60℃的低溫下的表面，在此，蒸汽冷凝而得以除去。隨著縮合加合產(chǎn)物溫度的提高，初級干燥的速率也提高，但必須注意不得超過保持產(chǎn)物完整性所允許的最高溫度。
初級干燥步驟除去了開始的縮合加合產(chǎn)物中的所有的冰。但是，在產(chǎn)物非晶部分中以溶解狀態(tài)包含的產(chǎn)物中的水分的量仍有相當(dāng)數(shù)量，根據(jù)所述產(chǎn)物的組成，數(shù)值大約為20％-50％重量。這些殘留水的去除在第二干燥階段中完成，該階段一般在抬高的產(chǎn)物溫度下進(jìn)行。不過，這些溫度不會高至本文中所述的本發(fā)明噴霧干燥方法中使用的溫度。正常地，優(yōu)選使用冷凍干燥方法而不是本發(fā)明的噴霧干燥方法，因為前者是在低溫下進(jìn)行的，這更有可能不對含蛋白質(zhì)的終產(chǎn)物產(chǎn)生任何破壞作用。冷凍干燥方法還具有更容易防止微生物和顆粒污染物的優(yōu)點(diǎn)。另一方面，生產(chǎn)時，冷凍干燥方法與噴霧干燥方法相比，有涉及更高的設(shè)備資本成本和更高的能源消耗成本的缺點(diǎn)。不過，對于這兩種類型的方法，終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)性質(zhì)都對保持該終產(chǎn)物的構(gòu)象穩(wěn)定性提出了實(shí)質(zhì)的挑戰(zhàn)。
上面所提到的縮合加合物的非晶形相包含未結(jié)晶的產(chǎn)物溶質(zhì)和未結(jié)晶的水。在實(shí)踐中，水在平衡點(diǎn)時不會結(jié)晶成冰，而且在其將成核和結(jié)晶之前，必須比該點(diǎn)過冷10-15°。所需的過冷的量取決于溶質(zhì)的組成和溫度和在干燥室中的存留時間，以及容器瓶的大小和原料組成和在縮合加合水溶液中存在的可為冰的形成提供異相成核位點(diǎn)的任何顆粒物質(zhì)。在這點(diǎn)上，與最有可能由縮合加合產(chǎn)物組成的用于動物和人的治療劑的生成有關(guān)的無菌、無顆粒的生產(chǎn)場所環(huán)境會對擴(kuò)大生產(chǎn)造成問題。這類環(huán)境限制了顆粒成核位點(diǎn)的機(jī)會，導(dǎo)致需要使加合產(chǎn)物更大程度地過冷，這又會控制所形成的冰晶體的大小。冰的晶體大小是重要的，因為它會控制升華過程中在冰晶體中造成的孔洞或通道的大小，從而影響在升華過程中可得到的這些孔洞的表面積。
最后，這些因素會顯著影響升華的速率以及第二干燥過程的速率。過冷提高10℃可導(dǎo)致初級干燥時間提高一個數(shù)量級。過冷的程度應(yīng)限制在10-15℃，并且在整個干燥室中和對于每個小瓶應(yīng)是均一的。
當(dāng)目的是得到均勻的過冷度和冷凍行為時，為得到最佳結(jié)果而選擇的干燥室溫度和存留時間參數(shù)包括首先將所有縮合加合產(chǎn)物冷卻至0℃以下的溫度，但高于引起成核作用和結(jié)晶作用的溫度，大約是-5℃至-10℃。隨后，干燥室溫度降低至中等水平，以誘導(dǎo)所有容器瓶中的冰結(jié)晶，這大約是-20℃至-30℃。這之后，干燥室溫度充分降低到最低低共熔溫度以下，此時溶質(zhì)結(jié)晶；或者降低到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下，此時溶質(zhì)為非晶形的，這大約是-40℃。一旦該低共熔系統(tǒng)已結(jié)晶，它就完全成為固體，然后就可進(jìn)行初級干燥。
當(dāng)溶質(zhì)系統(tǒng)趨向保持非晶形時，可以采用一個回火或退火方法，其中將縮合加合產(chǎn)物的溫度升高，使其至少比玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高幾度，維持?jǐn)?shù)小時，目的是允許溶質(zhì)結(jié)晶，之后在開始初級干燥之前再次降低干燥室的溫度。還必須注意，在此過程中，冰的形成導(dǎo)致所有溶質(zhì)濃縮，這將包括溶解的鹽，例如，包括當(dāng)縮合加合產(chǎn)物溶解于弱鹽溶液中時。結(jié)果將是NaCl的濃度升高，這最終可能導(dǎo)致所述產(chǎn)物降解。
為了防止產(chǎn)物降解，初級干燥階段在最大允許溫度下進(jìn)行而不是在可能的最高溫度下進(jìn)行。此溫度將是溶質(zhì)是晶體時的低共熔溫度和溶質(zhì)為非晶形時的崩潰溫度或低共熔熔化溫度。在最大允許溫度以上進(jìn)行干燥會導(dǎo)致沒有確切幾何特性的無法接受的產(chǎn)物。最大允許溫度可以容易地利用熱分析法、電阻測量法或產(chǎn)物對溫度的顯微分析來確定，它可以在非常大的范圍內(nèi)變化，且必需作為確立冷凍干燥方法參數(shù)的第一個步驟加以確定。
上述制備方法也可以在減少水分的條件下進(jìn)行，由此加快水的去除速率和提高所去除的總量。這與通過除去已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水來推動縮合反應(yīng)完成的目標(biāo)相一致，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并且可確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
與該目標(biāo)一致，縮合加合終產(chǎn)物中存在的水分的量將相應(yīng)地是該終產(chǎn)物重量的3.0％-0.001％，優(yōu)選為2.0％-3.0％重量，以所述終產(chǎn)物的重量計。不過，縮合反應(yīng)完成后，也可能在需要時從終產(chǎn)物中進(jìn)一步除去更多量的水分，以防止結(jié)塊，提高穩(wěn)定性，改善加工或出于技術(shù)人員顯而易見的其它目的。因此，該縮合加合終產(chǎn)物中存在的水分的量可低至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，或者甚至低至0.03％-0.01％重量，以終產(chǎn)物的重量計。
不過，根據(jù)縮合加合終產(chǎn)物的性質(zhì)，尤其是其蛋白質(zhì)組分的性質(zhì)，可能必需在終產(chǎn)物中存在實(shí)質(zhì)更高量的水分，因為如果除去終產(chǎn)物中的所有水的話，許多蛋白質(zhì)將是不穩(wěn)定的。因此，與保持終產(chǎn)物的完整性相一致，可能希望終產(chǎn)物中存在的水分的量在3.0％-20.0％重量范圍內(nèi)，優(yōu)選為5.0％-15.0％重量，更優(yōu)選為8.0％-12.0％重量，以終產(chǎn)物的重量計。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述以下實(shí)施例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的新方法和產(chǎn)品，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1利用冷凍干燥制備Met-pST和其它醛的縮合加合物將76.1mg鄰香草醛溶解于200ml蒸餾水，從而制得2.50mM鄰香草醛溶液。完全溶解醛需要最小的加熱和聲處理。以類似方式制備香草醛、水楊醛和苯甲醛的水溶液(均為2.50mM)。在室溫下將干燥、凍干的met-pST(21.9mg,21858g/m,1.00μmole)溶于2.00ml的每種醛溶液。用稀氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至8.0(如果需要將pH值調(diào)低，就使用稀醋酸)。終溶液含有1.00μmole蛋白質(zhì)和5.00μmole醛。使該溶液在室溫下放置1小時，然后置于20mL冷凍干燥燒瓶中并在冰箱中在-28℃下冷凍16小時。接著將凍結(jié)的樣品放置在一個歧管冷凍干燥器中，將燒瓶排空。壓力保持＜1.0mm，持續(xù)24小時。然后將燒瓶拿回至大氣壓下，測定回收物質(zhì)的重量。在每種情況下，測得的重量都在關(guān)于醛和蛋白質(zhì)起始物總重的試驗誤差內(nèi)。在這一反應(yīng)規(guī)模下都不能測得醛的任何損失。反相HPLC分析僅顯示有met-pST單體和適宜醛的峰值，單體的回收大于95％。還對每種樣品進(jìn)行了電噴射質(zhì)譜分析。借助聲處理將電噴射樣品溶于0.1％三氟乙酸的2-甲氧基乙醇溶液(～0.1mg/ml)。在進(jìn)行分析前5分鐘內(nèi)配制樣品，因為對照試驗表明，如果使溶液放置更長的時間，將會有部分物質(zhì)發(fā)生水解。
上述制備既提供了落在本發(fā)明范圍內(nèi)的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物，也提供了不在本發(fā)明范圍內(nèi)的加合物，因為它們不是用芳族鄰羥基醛制備的。下表1-A中總結(jié)了每種測試樣品的制備。表1-B顯示了所述每種樣品的分析結(jié)果，包括用于完全形成席夫堿加合物的醛與蛋白的預(yù)計當(dāng)量數(shù)的指示。在上述基礎(chǔ)上確定每種樣品的百分收率。冷凍干燥過程的重量百分收率總是定量在所有醛和蛋白質(zhì)起始物的試驗誤差內(nèi)，因為原料的損失僅來自升華醛，且這僅在使用非鄰羥基醛的時候才發(fā)生，在這種情況下?lián)p失小到甚至無法測量。席夫堿的百分收率相當(dāng)于終產(chǎn)物的質(zhì)量(由于剛才所提到的原因，它總是理論的100％)X轉(zhuǎn)化率。于是，利用電噴射質(zhì)譜法測得醛的實(shí)際平均當(dāng)量數(shù)，將其除以理論基礎(chǔ)上預(yù)測的當(dāng)量數(shù)，就可得到轉(zhuǎn)化率，將結(jié)果乘以100，從而將轉(zhuǎn)化率表示為百分?jǐn)?shù)。由此得到的數(shù)值是使用本發(fā)明制備方法得到的席夫堿轉(zhuǎn)化效率的另一個指示。
最后，在進(jìn)行有關(guān)的試驗操作之前，先測定每種樣品的pH值，以論證保持pH為7.0或更高對獲得高收率的重要性。
表1-A
表1-B
*對于非鄰羥基醛加合物來說，這是唯一一個收率在70％以上的例子。
**對于鄰羥基醛加合物來說，這些是僅有的幾個收率低于90％的例子。
以下實(shí)施例說明了在0℃以上的溫度下進(jìn)行的本發(fā)明的制備方法。
實(shí)施例2利用噴霧干燥制備Met-pST和鄰香草醛的縮合加合物將干燥、凍干的met-pST(45.7μmole)的1.00gm樣品溶于100.0ml蒸餾水。向該溶液中加入鄰香草醛(34.8mg,228.Smmole,5.00當(dāng)量)。通過在40℃下攪拌1小時使鄰香草醛溶解。然后用0.1N氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)至7.50。以2.0ml/分鐘的速度將該樣品加入Buchi 190型小型噴霧干燥器中。將吸氣器設(shè)定在-25mbar，樣品入口溫度為110℃，樣品出口溫度為75℃。產(chǎn)物收集在旋風(fēng)收集器中，利用反相HPLC和電噴射質(zhì)譜法進(jìn)行分析。
上述制備提供了落在本發(fā)明范圍內(nèi)的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物，因為它們都是用鄰香草醛(一種芳族鄰羥基醛)制備的。對于其他醛使用類似的條件。下表2-A中總結(jié)了每種測試樣品的制備。表2-B顯示了每種測試樣品的分析結(jié)果，包括用于完全形成席夫堿加合物的醛與蛋白的預(yù)計當(dāng)量數(shù)的指示。該噴霧干燥過程的重量百分收率總是定量在所有醛和蛋白質(zhì)起始物的試驗誤差內(nèi)，因為原料的損失僅來自升華醛，且這僅在使用非鄰羥基醛的時候才發(fā)生，甚至在這種情況下?lián)p失小到無法測量。席夫堿的百分收率相當(dāng)于終產(chǎn)物的質(zhì)量(由于剛剛所解釋的原因，它總是理論的100％)X轉(zhuǎn)化率。接著，利用電噴射質(zhì)譜法測得醛的實(shí)際平均當(dāng)量數(shù)，將其除以理論基礎(chǔ)上預(yù)測的當(dāng)量數(shù)，就可得到轉(zhuǎn)化率，將結(jié)果乘以100，從而將轉(zhuǎn)化率表示為百分?jǐn)?shù)。
由此得到的數(shù)值是使用本發(fā)明制備方法得到的席夫堿轉(zhuǎn)化效率的另一個指示。上述噴霧干燥方法的質(zhì)量產(chǎn)率較低，這是所述方法以縮小的規(guī)模進(jìn)行的直接結(jié)果。大量終產(chǎn)物最后是附著在干燥器械上而沒有被回收。因此，上述的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率是說明本發(fā)明方法的相對優(yōu)越性的更為準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。
最后，在進(jìn)行有關(guān)的試驗操作之前，先測定每種樣品的pH值，以論證保持pH為7.0或更高對獲得高收率的重要性。
表2-A
表2-B
在上面的數(shù)據(jù)表中，收率值(％)精確至所給數(shù)的5-10％以內(nèi)。應(yīng)注意到，對于所有使用了芳族鄰羥基醛且pH≥7.0的制劑來說，收率≥90％。在上面列出的相關(guān)表中指出了關(guān)于這個觀察結(jié)果的幾個例外。與此相反，當(dāng)使用芳族非鄰羥基醛時，雖然pH與鄰羥基醛樣品同樣都≥7.0，但收率均≤70％。在上面列出的相關(guān)表中指出了關(guān)于這個觀察結(jié)果的唯一一個例外。
上面列出的表1-B中有關(guān)樣品1y至1dd的數(shù)值說明了保持pH值≥7.0對獲得高收率的極其重要性。如果pH都保持≥7.0的話，所有使用芳族鄰羥基醛的這些樣品的收率就可能都≥90％。不過，將pH確立為是從最低3.31開始逐漸升高至最高8.52這一范圍內(nèi)不同的值。收率百分?jǐn)?shù)顯示出相應(yīng)的升高，從最低33％開始有規(guī)律地升高至最高93％。
權(quán)利要求
1.一種用于制備組分包括對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)和芳族鄰羥基醛的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物的改良方法，該方法包含使上述組分一起混合在pH7.0或更高pH值下的含水環(huán)境中而形成一種反應(yīng)混合物，反應(yīng)發(fā)生在能通過除去已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水來有效地推動所述縮合反應(yīng)實(shí)質(zhì)完成的條件下，同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并可確保向所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述芳族鄰羥基醛包含一個或多個下式化合物 其中R1和R4獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2-S(=O)2N(R7)(R9)；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9和-N(R7)(R9)，其中R7是氫或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中定義R1和R4的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；?；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；X和Y獨(dú)立地分別是N,CHR2或CHR3，其中R2和R3獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氫或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定義R2和R3的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述芳族鄰羥基醛包括鄰香草醛；水楊醛；2,3-二羥基苯甲醛；2,6-二羥基苯甲醛；2-羥基-3-乙氧基苯甲醛；或吡哆醛。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)包括選自以下成員的一種或多種內(nèi)源性的和合成的蛋白質(zhì)阿片樣止痛劑和拮抗劑，包括腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽，它們是μ、κ和δ阿片樣物質(zhì)受體亞型的選擇性和非選擇性興奮劑和拮抗劑，包括[Leu5]和[Met5]腦啡肽；強(qiáng)啡肽A和B；α-和β-新內(nèi)啡肽；[D-Ala2,MePhe4,-Gly(ol)5]腦啡肽(DAMGO)；[D-Pen2,D-Pen5]腦啡肽(DPDPE)；[D-Ser2,Leu5]腦啡肽-Thr6(DSLET)；[D-Ala2,D-Leu5]腦啡肽(DADL)；D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)；[D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-ol]腦啡肽(FK-33824)；Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]δ啡肽Ⅰ；Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]δ啡肽Ⅱ；Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(morphiceptin)；Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017)；和[D-Ala2,Leu5,Cys6]腦啡肽；內(nèi)分泌物，包括為響應(yīng)選自組織損害、病毒感染和變態(tài)反應(yīng)的炎癥事件而由蛋白水解反應(yīng)產(chǎn)生的緩激肽和胰激肽，其中所述蛋白質(zhì)局部見效而導(dǎo)致疼痛、血管舒張、血管通透性增加和前列腺素合成，其中所述蛋白質(zhì)具有興奮劑和拮抗劑活性，可用于治療男性不育，用于癌癥化療劑越過血腦屏障釋放，和用于治療疼痛、哮喘和其它慢性炎癥疾病，包括Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(緩激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脫-Arg9-緩激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脫-Arg10-胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(脫-Arg9-[Leu8]-緩激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-緩激肽)；和[D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)，其中Hyp是反式-4-羥基-Pro；Thi是β-(2-噻吩基)-Ala；Tic是[D]-1,2,3,4-四氫喹啉-3-基-羰基；Oic是(3as,7as)-八氫吲哚-2-基-羰基；對分別介導(dǎo)加壓應(yīng)答和抗利尿應(yīng)答的加壓素受體亞型V1和V2有效的蛋白質(zhì)，包括在充血性心力衰竭、高血壓、手術(shù)后腸梗阻和腹部膨脹的治療中有益的V1拮抗劑，用于通過控制多尿和煩渴來治療中樞性尿崩癥的V2興奮劑，以及用于治療出血性疾病包括威勒布蘭特病的V2興奮劑，包括特異性天然產(chǎn)生的加壓素樣肽下式表示的精氨酸加壓素(AVP) 和賴氨酸加壓素([Lys8]-AVP)；合成加壓素肽V1a-選擇性興奮劑[Phe2,Ile2,Orn8]AVP；V1b-選擇性興奮劑脫氨基[D-3-(3’-吡啶基)-Ala2]AVP；V2-選擇性興奮劑去氨加壓素(dDAVP)和脫氨基[Val4,D-Arg8]AVP；以及肽拮抗劑，包括下式表示的V1a-選擇性拮抗劑d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP 和V1b-選擇性拮抗劑dp[Tyr(Me)2]AVP；以及V2-選擇性拮抗劑脫Gly-NH29-d(CH2)5[D-Ile2,Ile4]AVP和d(CH2)5[D-Ile2,Ile4,Ala-NH29]AVP；用作胃液分泌的一種指示劑的五肽胃泌素，化學(xué)式為N-叔丁氧羰基-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2；用于治療胃腸道腫瘤的癥狀、其它療法難以治療的腹瀉、能動性障礙和胃腸出血的奧曲肽，化學(xué)式為L-半胱氨酸酰胺-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-羥基-1-(羥甲基)丙基]-，環(huán)(2→7)-二硫化物，[R-(R*,R*)]-；用作免疫抑制劑的抗體試劑，包括抗胸腺細(xì)胞球蛋白；鼠單克隆抗體-CD3單克隆抗體；和Rh0(D)免疫球蛋白；以及用于治療免疫缺損狀態(tài)的蛋白質(zhì)免疫刺激劑，包括免疫球蛋白；由白細(xì)胞產(chǎn)生并具有各種各樣免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，包括干擾素，集落刺激因子和白介素，特別是α-干擾素；干擾素-γ(IFN-γ)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；和白介素-1(IL-1)至白介素-12(IL-12)；涉及調(diào)節(jié)成熟血細(xì)胞不斷被替換的過程的造血生長因子，它們可用于治療原發(fā)性血液疾病，并可在嚴(yán)重感染的治療和對經(jīng)受化療或骨髓移植的病人的處理中用作佐劑，具體包括生長因子，包括紅細(xì)胞生成素(EPO)；干細(xì)胞生長因子(SCF)；白介素(IL-1-12)；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)；P1XY32l(GM-CSF/IL-3融合蛋白)；和血小板生成素；用于溶解病理性血栓和血管損傷部位的血纖蛋白沉積物的溶栓蛋白，包括鏈激酶；組織纖溶酶原激活物(t-PA)；和尿激酶；垂體前葉激素和調(diào)節(jié)它們的使用的下丘腦因子，包含(a)促生長激素，包括生長激素(GH)，促乳素(Prl)和胎盤催乳激素(PL)；(b)糖蛋白激素，包括促黃體素(LH)，促濾泡激素(FSH)和促甲狀腺素(TSH)；和(c)POMC衍生激素，包括促腎上腺皮質(zhì)素(ACTH)，α-促黑激素(α-MSH)，β-促黑激素(β-MSH)，β-促脂解素(β-LPH)和γ-促脂解素(γ-LPH)；調(diào)節(jié)所述激素釋放的下丘腦因子，包括生長激素釋放激素(GHRH)，促黃體素釋放激素(LHRH)，胰島素樣生長因子(IGF-1和IGF-2)，促生長素抑制素和促性腺素釋放激素(GnRH)；用作生長激素缺陷兒童的替代療法的生長激素，包括促生長素抑制素，促生長素抑制素的合成類似物，奧曲肽；用于生殖疾病的診斷和不育癥治療的促性腺激素，包括LH,FSH和絨毛膜促性腺激素(GC)，包括尿促卵泡素，一種用于誘導(dǎo)排卵的基本上已除去了大多數(shù)LH的人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG)，和戈那瑞林，一種用于刺激促性腺激素分泌的合成人GnRH；合成GnRH興奮劑，包括用于治療對性類固醇減少敏感的內(nèi)分泌紊亂的亮丙瑞林，組氨瑞林，那法瑞林和戈舍瑞林；促甲狀腺素(TSH)，其分泌受促甲狀腺素釋放激素(TRH)的控制，用于甲狀腺機(jī)能減退患者的激素替代療法和非中毒性甲狀腺腫患者或?qū)谞钕侔┻M(jìn)行了治療后的患者的TSH抑制療法；用于治療胰島素依賴性糖尿病患者和非胰島素依賴性糖尿病患者的胰島素；在葡萄糖和酮體代謝的調(diào)節(jié)中具有生理學(xué)作用的胰高血糖素，它可用于治療嚴(yán)重低血糖，也可由放射學(xué)家用于抑制胃腸道；用于阻斷分泌內(nèi)分泌物的腫瘤中的激素釋放的促生長素抑制素，及其合成類似物-奧曲肽，所述腫瘤包括胰島瘤，胰高血糖素瘤，血管活性腸多肽腫瘤，類癌腫瘤和生長激素瘤；降鈣素，一種特定作用于破骨細(xì)胞以抑制骨吸收的激素，它可用于處理高鈣血和增加的骨骼重建疾病，包括佩吉特?。挥糜谥委熂怪怨琴|(zhì)疏松癥患者的甲狀旁腺素；阿地白介素，125-L-絲氨酸-2-133-白介素2，用作抗腫瘤劑和免疫刺激劑；阿糖苷酶，一種497個氨基酸的單體糖蛋白和人胎盤組織β-葡糖腦苷脂酶的修飾型，可用作葡糖腦苷脂酶的補(bǔ)充劑；丙賴促皮質(zhì)肽，一種合成的促腎上腺皮質(zhì)素類似物1-β-Ala-17[L-2,6-二氨基-N-(4-氨基丁基)己酰胺]-α1-17-促腎上腺皮質(zhì)素；阿克伐司，一種527個氨基酸的絲氨酸蛋白酶，其序列與血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的天然的蛋白酶的序列相同，可用作纖溶酶原激活物；阿韋舒托，一種通過基因工程使CD4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的頭178個氨基酸經(jīng)兩個接頭殘基與假單胞菌屬外毒素A的氨基酸1-3和253-613相連而得到的合成嵌合蛋白，可用作抗病毒劑；amlintide，一種37個氨基酸的蛋白質(zhì)，可用作抗糖尿病劑；阿莫胃泌素N-羧基-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-苯基-L-丙氨酸酰胺；anakinraN2-L-Met-白介素1受體拮抗劑，可用作治療炎性腸病的非甾族抗炎藥和抑制劑；醋酸阿那立肽，心房肽激素-21(鼠)，N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-，醋酸鹽，用作抗高血壓劑和利尿劑；血管緊張素胺，血管緊張素Ⅱ，1-L-Asn-5-L-Val-，用作血管收縮藥；抑肽酶，一種有58個氨基酸的胰腺胰蛋白酶抑制劑，用作酶抑制劑(蛋白酶)；阿法拉新，1-琥珀酰胺酸-5-L-Val-8-(L-2-苯基甘氨酸)血管緊張素Ⅱ，用作抗高血壓藥；鞣酸精氨加壓素，加壓素，8-L-Arg-，鞣酸鹽，用作抗利尿劑；門冬托星，催產(chǎn)素，4-L-Asn-，用作抗生素，由淺灰鏈霉菌產(chǎn)生；阿托西班，催產(chǎn)素，1-(3-巰基丙酸)-2-(0-乙基-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-，用作一種催產(chǎn)素拮抗劑；阿伏帕星，一種從純白鏈霉菌得到的糖肽類抗生素；basifungin,N-[(2R,3R)-2-羥基-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-別-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-羥基-N-L-MeValα1-內(nèi)酯，用作抗真菌劑；becaplermin，重組人血小板衍生生長因子B，一種在氨基酸組成和生物活性方面與內(nèi)源性人PDGF-BB同型二聚體類似的由基因工程釀酒酵母產(chǎn)生的重組蛋白，用于通過促進(jìn)間充質(zhì)衍生細(xì)胞的增殖來治療慢性皮膚潰瘍；bivalirudin，一種具有20個氨基酸的抗凝劑，抗血栓形成劑；卡貝縮宮素，1-丁酸-2-[3-(對甲氧苯基)-L-Ala]催產(chǎn)素；卡古縮宮素，1-丁酸-6-(L-2-氨基丁酸)-7-甘氨酸催產(chǎn)素；藍(lán)肽，5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-硫代-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-酰胺，用作胃液分泌刺激劑；cetermin，具有112個氨基酸的轉(zhuǎn)化人生長因子β2；cilmostim,1-233-集落刺激因子1(人克隆p3ACSF-69蛋白部分)，環(huán)(7→90),(48→139),(102→146)-三(二硫化物)二聚體，用作生血劑(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)；多粘菌素E甲磺酸鈉，一種用作抗細(xì)菌劑的粘菌素A組分；可的瑞林，ovine triflutate，促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(綿羊)，三氟乙酸鹽，用作腎上腺皮質(zhì)缺乏和庫欣綜合征的診斷助劑，和用作一種促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素；替可克肽，醋酸二十四肽促皮質(zhì)素，α1-24-促腎上腺皮質(zhì)素，用作促腎上腺皮質(zhì)激素；環(huán)孢菌素，一種含有11個氨基酸和在6位上的3-羥基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酰部分的環(huán)蛋白，用作免疫抑制劑；dacliximab(Ro-24-7375)，一種由四個經(jīng)二硫鍵連接的亞單位組成的、分子量約為150kD的人源化抗TAC單克隆抗體，用作免疫抑制劑；daclizumab；達(dá)托霉素，一種蛋白質(zhì)抗細(xì)菌劑；地西盧定，包含63個氨基酸的來自醫(yī)用水蛭的63-脫磺基水蛭素，用作抗凝劑；地洛瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；醋酸去氨加壓素，加壓素，1-(3-巰基丙酸)-8-D-Arg-，一醋酸鹽，三水合物，包含9個氨基酸，用作抗利尿劑；包含10個氨基酸的醋酸地肽利司，用作LHRH拮抗劑；度莫瑞林，27-L-Leu-44a-Gly生長激素釋放因子(人)；依降鈣素，1-丁酸-7-(L-2-氨基丁酸)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala降鈣素(鮭)；emoctakin，有兩個Cys橋的包含72個氨基酸的白介素8(人)；依泊丁α，一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的165個氨基酸的糖蛋白，由已插入了人促紅細(xì)胞生成素基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞產(chǎn)生，用作抗貧血和補(bǔ)血劑；厄索夫明，包含157個氨基酸的重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，是一種從人胎盤分離并在大腸桿菌中克隆和表達(dá)的非糖基化蛋白，用作傷口愈合劑；苯賴加壓素是包含9個氨基酸的加壓素，2-L-Phe-8-L-Lys，用作血管收縮藥；非爾司亭，一種175個氨基酸的單鏈多肽，非糖基化的，由大腸桿菌表達(dá)，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；高血糖素，一種29個氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病藥；醋酸戈那瑞林，包含10個氨基酸的促黃體激素釋放因子醋酸酯的二醋酸鹽，用作性腺促進(jìn)物質(zhì)；戈舍瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；組氨瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；imiglucerase,495-L-組氨酸葡糖神經(jīng)酰胺酶胎盤同工酶蛋白，用作葡糖腦苷脂酶的酶補(bǔ)充劑；胰島素，去丙氨酸的，是一種通過除去胰島素B鏈C-末端的丙氨酸而制得的胰島素衍生物，用作抗糖尿病藥；干擾素α-2a，包含165個氨基酸的干擾素αA(人白細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來源的)，用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；干擾素α-2b，包含165個氨基酸的干擾素α2b(人白細(xì)胞克隆Hif-SN206蛋白質(zhì)部分來源的)，也用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；干擾素β-1a，一種從含有人干擾素β的人工改造基因的培養(yǎng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)的、由166個氨基酸殘基組成的糖基化多肽，也用作抗腫瘤劑和生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；干擾素β-1b，一種從大腸桿菌生產(chǎn)的、由165個氨基酸殘基組成的非糖基化多肽，也用作免疫調(diào)節(jié)劑；干擾素γ-1b,1-139干擾素γ(人淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)部分來源的)，N2-L-Met，用作抗腫瘤劑和免疫調(diào)節(jié)劑；iroplact，包含71個氨基酸殘基、有兩個Cys橋的N-甲硫氨酰血小板因子4(人亞單位)；lanoteplase，一種通過缺失纖連蛋白樣和EGF樣結(jié)構(gòu)域并使Asn117突變?yōu)镚ln117而從人t-PA衍生得到的組織纖溶酶原激活物蛋白，通過在哺乳動物宿主細(xì)胞中編碼肽序列的DNA序列的表達(dá)而制得，用作纖溶酶原激活物和溶栓劑；包含8個氨基酸和一個二硫鍵的醋酸蘭瑞肽，用作抗腫瘤劑；來諾拉提，一種通過表達(dá)來自于人口腔鱗狀上皮細(xì)胞系-mRNA的人粒細(xì)胞集落刺激因子-cDNA而在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中產(chǎn)生的、由174個氨基酸殘基組成的糖蛋白，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；醋酸黃體瑞林，一種包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；莫拉司亭，一種包含127個氨基酸的集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白質(zhì)部分來源的)，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；莫羅德明，一種表皮生長因子(鼠唾液腺)；醋酸那法瑞林，包含9個氨基酸的促黃體激素釋放因子(豬)，用作LHRH興奮劑；nagrestipen，包含69個氨基酸、有兩個二硫鍵的26-L-丙氨酸淋巴因子MiP 1α(人克隆pAT 464炎癥巨噬細(xì)胞)；胃酶抑制劑，N-(3-甲基-1-氧丁基)-L-Val-L-Val-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酰-L-Ala-4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，用作胃蛋白酶抑制劑；pramlintide，一種包含37個氨基酸和有一個二硫鍵的蛋白質(zhì)，用作抗糖尿病藥；人胰島素原，包含86個氨基酸殘基、有三個二硫鍵的胰島素原(豬)，用作抗糖尿病藥；沙莫司亭，集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白質(zhì)部分)，23-L-Leu，一種從釀酒酵母表達(dá)的、127個氨基酸殘基的單鏈糖基化多肽，用作抗中性白細(xì)胞減少劑和生血刺激劑；天然產(chǎn)生的和合成的、包括重組衍生的人和動物促生長素(生長激素)，尤其是牛和豬促生長素；牛瑞生長素，促生長素(牛來源的)，1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-谷氨酰胺]-，包含191個氨基酸，用作催乳劑，尤其是獸醫(yī)應(yīng)用；豬丙氨生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-丙氨酰-生長激素，總共包含191個氨基酸，用作激素(生長，豬)；人蛋氨生長素，促生長素(人)，N-L-Met-，包含具有兩個二硫鍵的191個氨基酸，用作生長激素；促生長素，一種具有從人腦垂體前葉得到的主要生長刺激激素的正常結(jié)構(gòu)的、包含191個氨基酸的單鏈多肽，用作生長激素；促生長素，可以以重組形式獲得；牛亮氨生長素，促生長素(牛)，127-L-Leu-，牛垂體促生長素中的四個天然產(chǎn)生的分子變體之一，用作催乳劑；豬諾生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190個氨基酸，用作豬生長激素；牛蛋氨生長素，促生長素(牛)，1-L-Met-127-L-Leu-，包含191個氨基酸，用作獸醫(yī)生長刺激劑；豬蛋氨生長素，促生長素(豬重組體)C979H1527N265O287S8；塞泊生長素，促生長素(豬重組體)C938H1465N257O278S6；牛度生長素，促生長素(牛重組體)C1020H1596N274O302S9；替普羅肽，緩激肽增效劑B,2-L-Trp-3-去-L-Leu-4-去-L-Pro-8-L-谷氨酰胺-，包含9個氨基酸，用作血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑；特立帕肽，一種包含34個氨基酸的蛋白質(zhì)，用作骨吸收抑制劑和骨質(zhì)疏松癥治療佐劑；thymalfasin，包含28個氨基酸的胸腺素α1(牛)，用作抗腫瘤劑，用于治療肝炎和傳染病，以及用作疫苗增強(qiáng)劑；胸腺噴丁，一種用作免疫調(diào)節(jié)劑的五肽；曲普瑞林，促黃體激素釋放因子(豬)，6-D-Trp，包含10個氨基酸，用作抗腫瘤劑；包含具有一個二硫鍵的8個氨基酸的伐普肽，用作抗腫瘤劑；包含具有一個二硫鍵的9個氨基酸的、8-L-Arg-或8-L-Lys-型加壓素，用作抗利尿激素；肌紅蛋白；血紅蛋白；β-乳球蛋白；免疫球蛋白-G(IgG)；抗血友病因子(因子Ⅷ)；溶菌酶；遍在蛋白；血小板活化因子(PAF)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；腫瘤壞死因子-β(TNF-β)；巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)；肝素；嗜伊紅性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)；重組因子Ⅸ；非何杰金氏B細(xì)胞淋巴瘤的單克隆抗體；干擾素α，用于治療丙型肝炎；和用于治療創(chuàng)傷和燒傷的成纖維細(xì)胞衍生的人造皮膚。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述能有效推動所述縮合反應(yīng)實(shí)質(zhì)完成的條件包括(a)能使存在的任何水從液相變?yōu)闅庀嗷蚬滔嘤纱藢⑺鏊畯乃隹s合反應(yīng)的所述含水環(huán)境除去的那些條件；和(b)能使必需輸入所述方法中的能量優(yōu)化以最有效地將發(fā)生縮合反應(yīng)的所述含水環(huán)境中的水，包括所述縮合反應(yīng)本身產(chǎn)生的水，和起始反應(yīng)物以及縮合加合終產(chǎn)物分離開的那些條件。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中在0℃以上的溫度下，所述能使存在的任何水從液相變?yōu)闅庀嗖⒛軆?yōu)化輸入所述方法的能量的條件包括(a)按照保持所述蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和所述縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法包括所述縮合反應(yīng)的要求，將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物加熱至最高溫度；(b)按照保持所述蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和所述縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法包括所述縮合反應(yīng)的要求，將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物細(xì)分成最小液滴；和(c)給由此形成的所述液滴提供關(guān)于它們所從中通過的惰性氣體的最高比速，同時符合保持所述蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和所述縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法包括所述縮合反應(yīng)的要求。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述將反應(yīng)混合物細(xì)分成液滴是使用一種噴灑器械完成的，該器械包括高壓氣流發(fā)生器和有關(guān)的分散裝置與高壓液壓泵裝置和有關(guān)的噴嘴裝置的任何適當(dāng)?shù)慕M合。
8.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述將反應(yīng)混合物細(xì)分成液滴是利用快速旋轉(zhuǎn)的圓盤形式的機(jī)械作用實(shí)現(xiàn)的，其中，包含所述每一種起始反應(yīng)物的水流指向該轉(zhuǎn)盤表面的上方，并且所述水流以從所述圓盤的邊緣以液滴形式推進(jìn)的方式通過所述圓盤，這發(fā)生在對溫度、濕度和壓力進(jìn)行了調(diào)節(jié)的條件下，以去除已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水，同時也符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并能確保轉(zhuǎn)化為所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
9.按照權(quán)利要求5的方法，其中在0℃和0℃以下的溫度下，所述能使存在的任何水從液相變?yōu)楣滔嗖⒛軆?yōu)化輸入所述方法的能量的條件包括(a)將在所述含水環(huán)境中的所述反應(yīng)混合物冷卻至溫度低到足以使所述含水環(huán)境中存在的所有非結(jié)合液態(tài)水實(shí)質(zhì)凍結(jié)的程度，所述溫度符合保持蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法包括所述縮合反應(yīng)的要求；(b)使所述由此冷卻后的在所述凍結(jié)的含水環(huán)境中的反應(yīng)混合物在通入惰性氣體的條件下經(jīng)受降低的壓力，同時這符合保持所述蛋白質(zhì)起始反應(yīng)物和所述縮合加合終產(chǎn)物的完整性、以及效率和經(jīng)濟(jì)最佳地完成所述制備方法包括所述縮合反應(yīng)的要求。
10.一種包含蛋白質(zhì)和芳族鄰羥基醛的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物，它是在能有效地除去已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0％-約99.9％重量、優(yōu)選約98.0％-約99.0％重量的水的條件下制備的，該制備條件同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求，并可確保向所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，即，所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5％重量，優(yōu)選等于或大于約99.5％重量，以反應(yīng)物的重量計。
11.按照權(quán)利要求10的產(chǎn)物，其中所述芳族鄰羥基醛包含一個或多個下式化合物 其中R1和R4獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2-S(=O)2N(R7)(R9)；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9和-N(R7)(R9)，其中R7是氫或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中定義R1和R4的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；缓捅?C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；X和Y獨(dú)立地分別是N,CHR2或CHR3，其中R2和R3獨(dú)立地選自氫；羥基；鹵素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)環(huán)烷基；(C2-C6)鏈烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氫或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定義R2和R3的所述烷基、環(huán)烷基和鏈烯基可選地被選自以下成員的一個或兩個取代基獨(dú)立地取代鹵素；羥基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺?；?；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
12.按照權(quán)利要求11的產(chǎn)物，其中所述芳族鄰羥基醛包括鄰香草醛；水楊醛；2,3-二羥基苯甲醛；2,6-二羥基苯甲醛；2-羥基-3-乙氧基苯甲醛；或吡哆醛。
13.按照權(quán)利要求11的產(chǎn)物，其中所述對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)包括選自上述權(quán)利要求4所定義的組中的一個或多個成員。
14.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)包括從以下成員中選擇的一種物質(zhì)天然產(chǎn)生的豬促生長素；豬丙氨生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-丙氨酰-生長激素，總共包含191個氨基酸；豬諾生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190個氨基酸；促生長素(豬重組體)C979H1527N265O287S8；和塞泊生長素，促生長素(豬重組體)C938H1465N257O278S6。
15.按照權(quán)利要求13的產(chǎn)物，其中所述對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)包括從以下成員中選擇的一種物質(zhì)天然產(chǎn)生的豬促生長素；豬丙氨生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-丙氨酰-生長激素，總共包含191個氨基酸；豬諾生長素，促生長素(豬克隆pPGH-1來源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190個氨基酸；促生長素(豬重組體)C979H1527N265O287S8；和塞泊生長素，促生長素(豬重組體)C938H1465N257O278S6。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于制備組分包括對動物具有有益活性的蛋白質(zhì)和芳族鄰羥基醛的席夫堿縮合加合終產(chǎn)物的改良方法,該方法包含使上述組分一起混合在pH7.0或更高pH值下的含水環(huán)境中而形成一個反應(yīng)混合物,反應(yīng)發(fā)生在能通過除去已存在的或在所述縮合反應(yīng)過程中產(chǎn)生的約97.0%－約99.9%重量、優(yōu)選約98.0%－約99.0%重量的水來有效地推動所述縮合反應(yīng)實(shí)質(zhì)完成的條件下,同時符合保持縮合反應(yīng)物和加合終產(chǎn)物的完整性的要求,并可確保向所述縮合加合終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率,即,所述縮合加合終產(chǎn)物的收率等于或大于約98.5%重量,優(yōu)選等于或大于約99.5%重量,以反應(yīng)物的重量計。優(yōu)選的芳族鄰羥基醛包括鄰香草醛;水楊醛;2,3－二羥基苯甲醛;2,6－二羥基苯甲醛;2－羥基－3－乙氧基苯甲醛;或吡哆醛。可以使用的蛋白質(zhì)種類非常多。該改良方法提供了90%以上的收率,和醛與蛋白質(zhì)向縮合加合物的基本定量的轉(zhuǎn)化。
文檔編號C07K1/107GK1305490SQ99807518
公開日2001年7月25日 申請日期1999年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月26日
發(fā)明者B·A·海, M·T·科拉克 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司